Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности и может быть использовано для получения Аурона - нового биологически активного вещества (БАВ), которое в перспективе является препаратом противовоспалительного действия, обусловленного его противомикробной, фагоцитарной, митотической и антиоксидантной активностью.
Известен широкий круг БАВ, в том числе и препаратов, обладающих противовоспалительной активностью.
К таким веществам относятся препараты, полученные химическим синтезом: трихопол, фуродонин, тинидазол, аспирин и т. д.
Наиболее эффективными в плане противовоспалительного действия являются синтетические антиоксиданты - производные ионолового ряда - феназан К+ и Z+.
Однако общим недостатком химических препаратов является их высокая токсичность.
Менее токсичным является ДМСО - диметилсульфоксид, препарат, обладающий антиоксидантными свойствами, применяемый в качестве противовоспалительного средства. Особенно эффективен ДМСО в комплексе с гормональными (стероидного типа) препаратами. Недостатком данного аналога является низкая эффективность в отсутствии комплекса с гормоном. Вместе с тем включение в схему лечения гормонов часто имеет побочные явления: увеличение жесткости клеточных мембран, нарушение их проводимости, ломкость и т. д.
Этих недостатков лишены экстракты из растительного сырья. Однако, как правило, препараты естественного происхождения имеют низкую эффективность в сравнении с первой группой веществ.
Расширение спектра лекарственных средств противовоспалительного действия является постоянно актуальной задачей фармацевтической промышленности, прикладных исследований в медицине.
Таким образом техническим результатом предлагаемого изобретения является расширение спектра БАВ, обладающих противовоспалительным действием.
В основу решения положены исследования Караваева В. по пряной экстракции растительного сырья в воду.
Технический результат достигается следующим образом. Аурон получают пряной экстракцией растительного сырья в воду дистиллированную в течении 5 ч при температуре не ниже 30оС. Экстракт фильтруют. К полученному фильтрату добавляют глицерин, нашатырный спирт, олеиновую кислоту и эфирный концентрат.
В качестве растительного сырья, взятого на 1 л воды, используют смесь, содержащую, г Трава полыни горькой 10 Трава мяты перечной 10 Почки сосны обык- новенной 12 Корень солодки 1 Трава зверобоя проды рявленного 5 Трава чабреца 5 Цветы тысячелистника 5 Цветы календулы 5 Трава чистотела 5
В качестве эфирного концентрата используют смесь масел: масло мяты перечной и/или масла пихтового, фенхелевого, тминного, анисового, укропного, кориандрового, бергамотного, лимонного, апельсинового, эвкалиптового, санталового, иланг-илангового, мускатно-шалфейного, розового, лавандового и гвоздичного.
В эфирном концентрате масла находятся в равных пропорциях, а количество концентрата в Ауроне составляет 5 г на 1 кг Аурона.
В табл. 1 приводится пример состава Аурона.
Исследования биологической активности аурона.
Исследования противомикробной активности.
Исследования проводили на музейных культурах микроорганизмов: St. aureus. Escn coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhinurium, Schigell a ftexneri, кишечная палочка 0-138. За трое суток до начала работы культуры пересевались на ЖСА, через 48 ч колонии откладывались на МПА и инкубировались в течении 24 ч при 37оС в термостате.
Для проведения исследования противомикробной активности препарата микроорганизмы пересевались на чашки Петри с питательной средой и инкубировались в течение ночи до появления на чашках большого количества микробных колоний.
Исследуемый препарат в количестве 0,02 наносится на чашку Петри поверх микробных колоний откалиброванной бактериологической петлей и чашки инкубировались в течение 2 сут. Результат учитывался по появившимися пятнам лизированных микроорганизмов. В качестве контроля использовались интактные чашки с музейной культурой микроорганизмов без воздействия препарата. Было проведено 5 серий исследований, в результате которых установлено, что нативный препарат Аурон обладает выраженной антибактериальной активностью в отношении всех исследовавшихся микроорганизмов. Результаты представлены в табл. 2.
Исследование влияния растительного экстракта Аурон на фагоцитарную активность элементов крови.
Исследование проводилось на нейтрофилах крови (тест НСТ). Суть теста состоит в том, что способные к фагоцитарной активности клетки крови захватывают частички красителя - нитротетразолиевого синего. Количество нейтрофилов, захвативших краситель, является показателем активности крови.
В качестве субстрата для получения нейтрофилов использовалась донорская кровь. Кровь в стерильных условиях забиралась из локтевой вены, гепаринизировалась по общепринятой методике и затем в течение часа с момента ее получения проводился тест НСТ.
В качестве стандартов сравнения активности исследуемого препарата использовались известные индукторы фагоцитаза - лизоцим и продигиозан.
В иммунологический планшет помещали по 0,05 мл гепаринизированной крови. В контрольную лунку (для проверки спонтанной активности) добавляли 0,225 мл раствора Хэнкса, в лунки для сравнения со стандартными препаратами по 0,025 мл раствора продигиозана и лизоцима, в остальные лунки добавлялся исследуемый препарат в концентрации 50% , 10% , 1% на солевом растворе Хенкса. Также в одну из лунок с кровью добавляли 0,025 мл среды 199 в качестве контроля растворителя.
Затем во все исследуемые лунки добавляли по 0,025 мл 0,02% -ного раствора НСТ. Содержимое лунок в планшете пипетировали при помощи микропитеток и инкубировали при 37оС в течение 15 мин. После этого повторно пипетировали и инкубировали в термостате в течение 30 мин.
Затем готовили мазки крови на обезжиренных предметных стеклах, высушивали мазки на воздухе, фиксировали в течение 10 мин в смеси метилового и этилового спирта, окрашивали кармином в течение 1 ч.
В полученных и окрашенных мазках подсчитывали отношение числа нейтрофилов, которые захватили краситель к общему числу нейтрофилов в мазке (из 100 клеток). Полученные результаты статически обрабатывались и сводились в табл. 3.
Символ n в названии группы означает незахват красителя.
Исследуемый препарат Аурон во всех концентрациях (50% , 10% и 1% ) усиливал фагоцитарную, статистически достоверную активность нейтрофилов в 2,73 - 3,05 раза по сравнению со спонтанной, в зависимости от концентрации. Аурон является активным стимулятором процесса фагоцитоза, он может применяться при различных состояниях и заболеваниях, протекающих со снижением клеточного иммунитета.
Изучение антиоксидантной активности препарата Аурон.
Исследование антиоксидантной активности Аурона проводилось на нейтрофилах крови. Индуцировался зимозаном процесс кислородного взрыва и исследовался процесс его ингибирования исследуемым препаратом.
Препараты, инбигирующие индуцированный кислородный взрыв, по литературным данным обладают антиоксидантной и противовоспалительной активностью.
Исследование проводилось на цельной крови донора. Гепаринизированная кровь, полученная из локтевой вены, в количестве 0,1 мл добавлялась в анализатор хемолюминометра, затем добавлялось по 0,1 мл растворов люминола и зимозана (для индуцирования кислородного взрыва в нейтрофилах крови).
В клетках крови нарастал кислородный взрыв, что регистрировалось по увеличению хемолюминисценции. На пике кислордного взрыва в анализатор вводился препарат Аурон в конечной концентрации 0,5% и замерялось изменение люминисценции. Контролем служила кровь, к которой не добавлялся препарат.
Было установлено, что добавление в количестве 0,015 мл препарата к крови практически полностью ингибировало кислородный взрыв в клетках, что можно расценить как ингибирование АФК - активных форм кислорода, участвующих в механизме перекисного окисления липидов и развитии окислительной реакции.
На чертеже отражен механизм ингибирования индуцированной хемолюминесценции.
С: IOB2. con - спонтанная люминесценция крови
С: IOB2. pre - ингибирование индуцированной люминесценции.
В результате 2 серий изменений было установлено, что аурон достоверно ингибирует в клетках крови активные формы кислорода, участвующие в воспалительных реакциях в организме.
Фоновая люминесценция сыворотки крови и препарата ничтожно мала и не влияет на полученный результат. Так как растительный экстракт Аурон достоверно ингибирует индуцированный зимозаном кислородный взрыв, его можно отнести к группе препаратов, обладающих антиоксидантной и противовопоспалительной активностью, и он может быть использован в качестве профилактического средства при воздействии повышенных температур.
Изучение митотической активности Аурона.
Изучение митотической активности Аурона проводилось методом биоиндикации на перевариваемой клеточной линии РН.
Клеточная взвесь (концентрация клеток 80 тыс. в 1 мл культуральной среды) рассаживалась по пенициллиновым флаконам с кусочками покровных стекол на дне. В качестве культуральной среды использовалась среда 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота. После сформирования клеточного монослоя культуральная среда сливалась и заменялась на раствор препаратов в среде 199. Для исследования митотической активности были использованы нетоксичные концентрации препарата Аурон - 0,5% -ный раствор. Контролем служила клеточная культура без добавления препаратов. Флаконы инкубировались в термостате при 37оС в течение 48 ч, каждые 24 ч готовились морфологические препараты по общепринятой методике и проводился подсчет числа митотических клеток в монослое методом случайных полей по морфологической сетке Стефанова С. Б.
Митотический индекс выражался в отношении числа митотических клеток к числу монослоя (на 1000 клеток).
Было проведено 5 серий исследований. Митотический индекс контрольной клеточной линии РН составляет 20,5 митотических клеток на 1000 исследуемых.
Использование Аурона (во всех 5 сериях) сопровождалось достоверным (в 2,34 раза) увеличением митотической активности клеток по сравнению с контрольной культурой. Увеличивая митотическую активность клеток, Аурон улучшает репаративные процессы кожи.
Проведенные исследования позволили установить, что Аурон оказывает противомикробное действие, являясь активным стимулятором процесса фагоцитоза, и может быть использован при различных состояниях, связанных со снижением клеточного иммунитета.
Растительный экстракт Аурон может быть отнесен к группе веществ, обладающих антиоксидантной и противовоспалительной активностью, за счет митотической активности клеток он улучшает репаративные процессы кожи.
Исследование безопасности накожного применения Аурона.
Изучение острой токсичности Аурона.
Изучение острой токсичности Аурона проводилось методом биоиндикации на клеточной линии Л-41-лейкоциты человека.
Клеточная суспензия рассаживалась в пенициллиновые флаконы с покровным стеклом (концентрация клеток - 80 тыс. /мл, культуральная среда - 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота). Флаконы инкубировались в термостате при 37оС в течение 24 ч до формирования на стеклах клеточного монослоя. Затем культуральная среда сливалась и заменялась на поддерживающую среду 199 без сыворотки.
Разведение Аурона готовили в среде 199 в различных концентратах от 0,1% до 10% и нативного.
Различные концентрации препарата добавлялись в культуральную среду и инкубировались в течение 72 ч в термостате, каждые 24 ч готовились морфологические препараты по общепринятой методике: фиксация жидкостью Карнуа, окраска гематоксилин-эозином.
Контролем служила клеточная культура, в которую не добавлялся Аурон, и культура, в которую добавлялось подчелночное масло.
Исследования показали, что Аурон не токсичен для клеточного монослоя в концентрациях от 0,1 до 0,5% . Клетки хорошо распластаны на стенке, цитоплазма мелкозернистая, ядра правильной формы, округлой с 1 - 3 ядрышками, имеется много митотических клеток. В концентрациях 1 - 3% проявляется слабая цитотоксичность: происходит разрежение монослоя, цитоплазма клеток вакуолизирована, встречаются отдельные пикнотизированные клетки.
В концентрации 3 - 10% токсичность препарата для клеточного слоя значительно возрастает, появляется 50 - 70% от общего числа погибших клеток.
Исследование хронической токсичности Аурона методом биоиндикации на клеточной линии Л-41-лейкоциты человека.
Для проведения исследования брали культуральный сосуд объемом 175 мл со сформированным клеточным монослоем. Монослой снимали со стекла раствором Версена, клетки суспендировали в культуральной среде 199 таким образом, чтобы концентрация в 1 мл среды составляла 100 тыс. клеток.
Полученная суспензия использовалась для проведения опыта в следующих вариантах:
в) В 2 чашки Карреля объемом 25 мл помещали 5 мл клеточной взвеси; затем в одну добавляли 5 мл среды 199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота, а во вторую 5 мл среды 199, содержащей 0,16% исследуемого препарата и сыворотку.
Таким образом препарат разводился до концентрации 0,08% . Обе чашки Карреля инкубировали в термостате при 37оС без смены среды до полной дегенерации клеточного монослоя.
Время инкубации составило 16 сут как для контрольного, так и испытуемого монослоя.
в) В 2 чашки Карреля объемом 25 мл помещали 5 мл клеточной взвеси, затем в одну добавляли 5 мл среды 199, а в другую - 5 мл 0,16% -ного раствора препарата в среде 199. В обе чашки добавлена сыворотка крупного рогатого скота в количестве 5% . Замену культуральной среды в обеих чашках проводили каждые 2 дн. Длительность выживания монослоя составляла 21 день как в контрольной чашке, так и в опытной. Разница в длительности выживания клеточного монослоя между первыми и вторым вариантом получена за счет введения во втором варианте питательной среды каждые два дня.
Проводилось ежедневное прижизненное наблюдение за состоянием монослоя, отклонений от морфологий монослоя не обнаружен.
в) 1 мл взвеси помещали в культуральный сосуд емкостью 175 мл, добавляли 10 мл среды 199, содержащей 0,16% исследуемого препарата и 10% сыворотки крупного рогатого скота. Сосуд инкубировали в термостате при 37оС в течение 72 ч до формирования клеточного монослоя. В дальнейшем каждые двое суток проводили отсадку ткани в пенициллиновые флаконы с покровными стеклами с целью приготовления морфологических препаратов (фиксация этиловым спиртом в течение 10 мин, окраска гематоксилин-эозином). Длительность исследования составила 10 пассажей (в каждом пассаже 16 флаконов).
г) Клеточная взвесь инкубировалась в течение 72 ч до формирования монослоя. Затем клетки снимались со стекла раствором Версена и рассаживались в пенициллиновые флаконы: В 16 флаконах в качестве культуральной среды использовали среду 199 с 10% сыворотки (контрольная группа) и в 16 флаконах 0,08% -ный раствор исследуемого препарата в среде 199 с сывороткой. Флаконы инкубировали в термостате, морфологические препараты готовились через каждые 24 ч.
Всего провели 5 серий исследований. Ни в одном варианте исследования не обнаружено отклонений в морфологии: отсутствуют патологические митозы, количество многоядерных (3,3) и гигантско-ядерных клеток (5,5 на 100) не превышает нормы для данной клеточной линии, отсутствует неспецифическая дегенерация.
Аурон в используемой концентрации не нарушает жизненных функций клеточного монослоя при длительном введении в питательную среду ни в одном из вариантов исследования.
В результате проведенных исследований установлено, что препарат Аурон нетоксичен и не оказывает цитологического действия на клеточный монослой в концентрации 0,5% и ниже, так как исследование фармакологических препаратов на клеточном монослое приравнивается к модели внутривенного введения, то при пересчете на 1 кг биомассы человека доза Аурона составит около 17,2 л. Следовательно Аурон можно отнеси к нетоксичным веществам.
Исследование местно-раздражающих свойств Аурона.
Экспериментальные исследования проведены на 40 белых беспородных крысах (самцы, масса тела 180 - 200 г) и 10 кроликах породы шиншилла (самки, масса тела 2,5 - 3,0 кг). Исследуемый бальзам вводили животным различными способами в нативном виде.
Исследование местно-раздражающего действия бальзама
Аурон на крысах путем накожных аппликаций.
Экспериментальные исследования были проведены на 20 беспородных крысах (самцы, масса тела 180 - 200 г), которые были разделены на 2 группы по 10 животных в каждой: 1-я группа - контроль (основа бальзама), 2-я группа - бальзам Аурон.
Бальзам и его основу наносили на депиллированную кожу спины крыс размером 2,0 х 2,0 см по 1 мл ежедневно в течение 30 сут. По окончании эксперимента проведена эвтаназия животных и визуально была исследована кожа и подкожная клетчатка в месте нанесения бальзама и основы. При установлении выраженной реакции кожи и подкожной клетчатки в виде гипермии или усиления сосудистого рисунка делался вывод о наличии раздражающего действия бальзама.
В результате проведенных исследований было установлено, что в условиях длительной аппликации бальзамом кожи крыс не зарегистрировано гиперемии или усиления сосудистого рисунка на коже и подкожной клетчатке, что свидетельствует об отсутствии раздражающего действия у исследуемого бальзама.
Изучение местно-раздражающих свойств бальзама Аурон при повторном подкожном введении крысам.
Исследования проведены на 20 белых беспородных крысах (самцы, масса тела 180 - 200 г), которые были разделены на 2 группы по 10 животных в каждой: 1-я группа - контроль (основа - бальзама), 2-я группа - бальзам Аурон.
Исследуемый бальзам и его основу вводили крысам 3-кратно подкожно в объеме 0,5 мл на животное. По окончании экспериментальных исследований была проведена эвтаназия животных. Оценка раздражающих свойств бальзама и основы проведена аналогично описанной ранее.
В результате проведенных исследований бальзам и его основа не вызывали видимых изменений кожи и подкожной клетчатки в месте введения препарата.
Оценка местно-раздражающих свойств бальзама Аурон при субконъюктивальном введении кроликам.
Исследования выполнены на 10 кроликах породы шиншилла (самки, масса тела 2,5 - 3,0 кг), которые были распределены на 2 группы по 5 животных в каждой: 1-я группа - контроль (основа бальзама, 2-я группа - бальзам Аурон.
Исследуемый бальзам и его основу вводили кроликам 3-кратно в количестве 0,02 мл на каждое животное в левый глаз, правый глаз при этом был контрольным.
Проведенные исследования свидетельствуют об отсутствии раздражающего действия исследуемого бальзама и его основы на слизистую кроликов и его основы на слизистую кроликов в условиях субконъюктивального введения.
Таким образом изучение токсичности Аурона и его местнораздражающего действия позволило установить, что:
в условиях длительной аппликации бальзамом Аурон на депиллированную кожу крыс отсутствуют видимые изменения кожи и подкожной клетчатки экспериментальных животных;
при 3-кратном введении крысам бальзама Аурон не зарегистрировано раздражающего действия препарата в месте инъекции;
бальзам Аурон не обладает раздражающим эффектом на слизистую оболочку глаз кроликов при повторном субконъюнктивальном введении.
Проведенные исследования позволяет оценить Аурон как перспективное средство для противовоспалительной терапии, не имеющее побочного действия.
Препарат проходит клинические испытания. (56) Машковский М. Д. Лекарственные средства. М. : Медицина, 1978.
Использование : в медицине и медицинской промышленности для получения вещества, обладающего свойствами адаптогена. Сущность изобретения состоит в том, что проводят прямую экстракцию соответствующего растительного сырья маслом и дистиллированной водой. Экстракты объединяют, добавляют живичный скипидар, аммиак водный, глицерин, эмульгатор, эфирный концентрат. Целевой продукт обладает выраженным адаптогенным эффектом, что проявляется в снижении утомляемости, увеличении работоспособности при его нанесении на поверхность тела. 2 с. и 1 з. п. ф-лы 1 ил, 4 табл.
Эфирный концентрат Не менее 3,0
Глицерин Не более 3,0
Эмульгатор Не более 3,0
Водный аммиак Не менее 5,0
Водный экстракт До 1 кг целевого продукта.
