СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ОСТРОПРОГРЕССИРУЮЩЕГО ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ Российский патент 2002 года по МПК A61K38/20 A61P37/02 

Изобретение относится к области медицины, а именно - к фтизиатрии, и может быть использовано для лечения остропрогрессирующего туберкулеза легких.

С начала 90-х годов наблюдается значительное ухудшение эпидемиологической ситуации по туберкулезу в России и во всем мире (в том числе и в высокоразвитых странах) в связи с неблагоприятной экологической обстановкой, негативными социальными и медицинскими факторами, ростом иммунодефицитных заболеваний различного генеза [1, 2]. Параллельно отмечается выраженное утяжеление клинической структуры заболеваемости за счет больных с остропрогрессирующими формами туберкулеза [3]. Данные формы течения инфекции наряду с выраженными симптомами интоксикации характеризуются распространенными деструктивными поражениями с множественными полостями распада и плохо поддаются терапии, что в значительной мере обусловлено состоянием иммунной системы, определяющим развитие и течение туберкулезного процесса.

Включение в состав комплексной терапии туберкулеза иммунокорригирующих средств, таких как тималин (протопит), левамизол, продигиозан, димефосфон и других, позволяет добиться значительного повышения эффективности лечения больных [4, 5, 6]. При этом в последнее время наблюдается тенденция все большего сужения показаний к их назначению, обусловленная, вероятно, неоднозначными иммунологическими сдвигами, получаемыми в результате применения данных препаратов. Возможно, это связано с широким спектром действия этих иммуномодуляторов, которые являются мощными индукторами дифференцировки практически всех лимфоцитов, в то время как сейчас уже ясна нецелесообразность активации при туберкулезе некоторых субпопуляций, в частности Т-хелперов 2 (Тх-2).

Туберкулез в настоящее время относят к интерлейкинзависимым иммунодефицитам с выраженными изменениями в цитокиновой сети и дисбалансом регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов [7, 8, 9]. Наиболее отчетливо с характером течения инфекции связаны сдвиги в статусе интерлейкина-2 (ИЛ-2) и ИЛ-4, определяющие продуктивность путей иммунной защиты. Высокий протективный иммунитет при туберкулезе большинство авторов связывают с ответом Тх-1, продуцирующих ИФН-γ и ИЛ-2, а низкую сопротивляемость к инфекции - с активностью Тх-2, секретирующих ИЛ-4 [9, 10, 11].

Задачей предлагаемого изобретения является повышение эффективности лечения туберкулеза путем использования в его комплексной терапии селективного стимулятора Тх-1 - ронколейкина.

Ронколейкин - инъекционная лекарственная форма отечественного рекомбинантного ИЛ-2 человека (рИЛ-2), который разработан и производится ТОО "БИОТЕХ". Является полипептидом, состоящим из 133 аминокислот, с молекулярным весом 15,4 кДа. Вырабатывается из клеток непатогенных штаммов пекарских дрожжей рода Saccharomyces cerevisiae, в генетический аппарат которых встроен ген ИЛ-2 человека, и, в отличие от зарубежных аналогов, не содержит эндотоксинов и не обладает повышенной иммуногенностью, поскольку по последовательности аминокислот полностью аутентичен природному ИЛ-2 человека. Зарегистрирован в Фармакологическом комитете РФ (95/249/5) и разрешен к применению для лечения иммуносупрессии, сопровождающей септические состояния различной этиологии.

Отличительной особенностью заявляемого способа является использование ронколейкина в комплексном лечении с рифампицином и изониазидом при тяжелых остропрогрессирующих формах туберкулеза. Проведено сравнительное исследование результатов применения ронколейкина и иммуностимулятора широкого спектра действия полипептида тимуса тималина в терапии экспериментальной туберкулезной инфекции. Применение ронколейкина в лечении туберкулеза ранее не описывалось.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Влияние ронколейкина на течение тяжелого остро прогрессирующего экспериментального туберкулеза с выраженным деструктивным компонентом воспаления.

Исследование проведено на 643 беспородных белых мышах, которым внутривенно инокулировали М. bovis 8 (0,1 мг сухой массы) разной степени вирулентности (высокой, средней, слабой). Лечение проводили с 8 дня после заражения. Ронколейкин применяли на фоне изониазида (5-10 мг/кг) в дозах 0,25; 1,0; 2,0 мкг/мышь в трех, четырех режимах введения каждая. Продукцию ИЛ-2 (спонтанную и индуцированную Кон А 5 мкг/мл) определяли в первичных культурах спленоцитов по уровню пролиферации ИЛ-2 - зависимой клеточной линии CTL L [12] . Содержание СД4⁺, СД8⁺ клеток оценивали в гомогенате селезенки цитотоксическим методом [13] ; функциональную активность макрофагов - по уровню внеклеточной 5-нуклеотидазы в первичной культуре перитонеальных макрофагов [14] . Результаты опытов показали, что инокуляция высоковирулентного штамма МБТ привела к развитию остропрогрессирующей формы инфекции (начало гибели - через 2 недели после заражения). В легких погибших животных при гистологическом исследовании обнаружены скопления ядерного детрита и очаги некроза на фоне специфического альвеолярно-макрофагального грануломатоза. Исследование уровня продукции ИЛ-2 спленоцитами (Фиг.1а) показало прогрессирующее с развитием инфекции снижение секреции ИЛ-2 спленоцитами в ответ на Кон А вплоть до полного отсутствия цитокина в культуральной среде перед гибелью животных на фоне максимальной выраженности специфического поражения легочной ткани (33%, 19% и 0% от уровня интактных животных на 8, 15 и 21-е сутки после заражения, Р<0,02, Р<0,001).

При инокуляции штамма М. bovis средней вирулентности гибель животных наблюдалась позже, через 3 недели после заражения. В легочной ткани выраженность альтеративного компонента воспаления была меньше: очаги некроза немногочисленны, полей некроза не отмечалось. Степень угнетения выработки ИЛ-2 при этом (Фиг. 1б), через 2 недели после заражения, практически соответствовала показателю в предыдущем опыте (9% от уровня интактной группы, Р<0,001). Однако на следующих сроках наблюдения отмечалось некоторое (до 50% уровня интактных мышей, Р<0,05) восстановление продукции ИЛ-2 в ответ на митоген.

Таким образом, степень ингибиции продукции ИЛ-2 спленоцитами мышей с генерализованным туберкулезом зависит от тяжести течения и темпа развития инфекции. При остропрогрессирующем процессе с выраженным деструктивным компонентом воспаления обнаружено полное торможение синтеза ИЛ-2 спленоцитами в ответ на митоген.

Ронколейкин, присоединенный к терапии изониазидом, значительно повышал ее эффективность. Так, через 3 недели после окончания курса препарата в оптимальном режиме (0,25 мкг/мышь, 5 инъекций ежедневно) значимо снизились: коэффициенты массы легких - до 2,15 усл. ед. против 3,5 усл. ед. в группе контроля лечения (Р=0,01); коэффициенты массы селезенки - до 1,96 усл. ед. против 2,68 усл. ед. (Р<0,05); высеваемость МБТ из селезенки - до 208,3 КОЕ против 250,0 КОЕ (Р<0,05).

В следующих сериях опытов изучено влияние препарата на результативность лечения туберкулеза с различной тяжестью его течения. Ронколейкин при этом (Фиг. 2) достоверно снизил показатели пораженности легких только при заражении животных культурой МБТ высокой и в меньшей степени средней вирулентности. В эксперименте с инокуляцией мышам М. bovis высокой вирулентности по данным гистологического исследования при присоединении к туберкулостатику ронколейкина наблюдалось выраженное cнижение распространенности специфического процесса, исчезновение альтеративного характера воспаления, увеличение выраженности периваскулярных и перибронхиальных лимфогистиоцитарных инфильтратов, появление признаков активации легочных макрофагов.

Следовательно, терапевтическая активность ронколейкина зависит от степени распространенности туберкулеза и тяжести его течения и наиболее выражена при тяжелых быстропрогрессирующих формах инфекции.

Исследование уровня продукции ИЛ-2 спленоцитами при подключении ронколейкина к изониазиду позволяет предположить, что эффект препарата при тяжелых быстропрогрессирующих формах туберкулеза обусловлен его действием именно на статус данного цитокина. При заражении мышей культурой МБТ средней вирулентности, где терапевтическое действие ронколейкина было значительно слабее, выработка ИЛ-2 спленоцитами при лечении цитокином практически не менялась (27% от уровня интактных мышей в группе лечения изониазидом и 28,9% - в группе изониазид + ронколейкин после окончания курса препарата). При быстропрогрессирующем процессе с деструктивным компонентом на фоне полной ингибиции ИЛ-2 спленоцитами зараженных нелеченных мышей (Фиг.4) ронколейкин значительно (Р<0,001) повышал синтез ИЛ-2 и через двое суток после окончания курса препарата, и через 9 дней после его отмены.

Быстропрогрессирующая форма туберкулеза у животных в наших экспериментах сопровождалась и значительными сдвигами в относительном содержании регуляторных субпопуляций спленоцитов (Фиг.3). При этом перед гибелью нелеченных мышей наблюдалось значимое увеличение доли СД4⁺ и СД8⁺ спленоцитов (29,3% и 37,0% соответственно против 23,0% и 22,7% у интактных мышей, Р=0,01). Монотерапия изониазидом практически не отразилась на уровне спленоцитов с фенотипом СД4^-, снизив лишь число СД8⁺ Т-клеток через неделю применения изониазида. Подключение к лечению ронколейкина привело к устойчивой, на обоих сроках наблюдения, нормализации процента и Т-хелперов (CД4⁺) Т-супрессоров (СД8⁺) в селезенке зараженных животных (21,7% и 24,7% против 32,7% и 32,3% в группе контроля лечения, Р=0,01, через неделю после окончания курса рИЛ-2).

При использовании в комплексной терапии ронколейкина зарегистрирована также стимуляция функциональной активности макрофагов, являющихся основными элиминаторами возбудителя инфекции. Снижение активности внеклеточной 5-нуклеотидазы (биохимический признак стимуляции Мф) отмечено непосредственно после курса введения ронколейкина (1,70±0,32 усл. ед. против 3,88±0,40 усл. ед. у мышей, получавших терапию этиотропную, Р<0,01) и через 2 недели после его отмены (1,55±0,22 усл. ед. против 3,06±0,51 усл. ед., Р<0,05), причем до уровня, значимо более низкого, чем в интактной группе (2,58±0,18 усл. сд., Р<0,01). Данный эффект ронколейкина видимо также обусловлен восстановлением им активности Тх-1, секретирующих основные активаторы функции макрофагов - ИЛ-2 и ИНФ-γ.

Пример 2. Сравнительная оценка ронколейкина и тималина при их использовании в терапии экспериментального туберкулеза.

Проведено сравнение влияния ронколейкина и полипептида тимуса тималина на характер течения экспериментального туберкулеза. При этом оба препарата в оптимальном режиме введения (ронколейкин - 250 мкг/мышь, тималин - 2 мкг/мышь) вводили с седьмого дня от инокуляции инфекта после регистрации в легких макроскопических признаков развития процесса на фоне изониазида в терапевтической дозе (10 мг/кг). Опыты проведены на мышах с быстропрогрессирующей формой инфекции и при введении животным штамма М. bovis средней вирулентности. В обоих случаях лечебный эффект ронколейкина через две недели после окончания курса введения препаратов был значительнее и проявлялся в снижении большего числа показателей тяжести течения инфекции (см. таблицу).

Исследование относительного количества СД4⁺, CД8⁺ спленоцитов также показало преимущество использования ронколейкина. Нормализация содержания как СД4⁺, так и CД8⁺ спленоцитов при включении ронколейкина в терапию наблюдалась раньше, сразу после окончания курса препарата (18,3±2,5% и 23,67±2,5% соответственно) до уровня субпопуляций у интактных мышей (23,0±2,1% и 22,67±2,1%). При лечении мышей тималином - только через неделю после отмены иммуностимулятора (26,0±2,1% и 22,33±2,1%).

Анализ действия препаратов на продукцию ИЛ-2 спленоцитами в ответ на Кон А, практически полностью ингибированную при распространенном деструктивном процессе, продемонстрировал (Фиг. 4) более раннее (сразу после отмены препарата) и более значительное (до 60,56% от уровня интактных мышей) повышение ответа Тх-1 на индукцию при включении в терапию ронколейкина.

Изучены возможности использования ронколейкина на фоне рифампицина, который в настоящее время относится к туберкулостатикам первого ряда и практически является основным препаратом фтизиатрической практики. Рифампицин - сильнейший индуктор макросомального окисления клеток печени, в результате чего на его фоне снижается действие многих лекарственных препаратов. Это действие распространяется и на полипептиды тимуса, эффективность которых значительно уменьшается при назначении их совместно с рифампицином, что описано нами ранее [15] . Ронколейкин по результатам наших исследований сохраняет свои эффекты на фоне рифампицина. Достоверное снижение показателей тяжести течения туберкулезной инфекции (коэффициента массы и индекса поражения легких) при подключении ронколейкина к двум туберкулостатикам (изониазид + рифампицин) зарегистрировано сразу после окончания курса препарата (1,47±0,13 и 1,67±0,09 усл. ед. против 2,04±0,11 и 1,83±0,09 усл. ед. в группе контроля лечения, Р<0,05) и сохранялось 2,5 недели после его отмены (0,89±0,08 и 1,44±0,12 усл. ед. против 1,42±0,09 и 2,25±0,09 усл. ед., Р<0,01 соответственно). В опытной группе наблюдалась и стимуляция функциональной активности перитонеальных макрофагов по снижению уровня внеклеточной 5-нуклеотидазы (0,82±0,19 усл. ед. против 2,32±0,24 усл. ед., Р<0,01). При этом разница в показателях эффективности лечения в группах, где рифампицин вводился вместе с иммуностимулятором и где отменялся во время назначения ронколейкина, не отмечена. Таким образом, ронколейкин на фоне рифампицина полностью проявлял свою активность.

Представленные нами данные свидетельствуют о значительном лечебном эффекте ронколейкина (отечественный рекомбинантный ИЛ-2 человека, дрожжевой) при включении его в терапию быстропрогрессирующего экспериментального туберкулеза с выраженным деструктивным компонентом воспаления.

У животных, леченных ронколейкином, значительно снижается тяжесть течения туберкулезной инфекции, уменьшается распространенность специфического воспаления в легких, исчезает альтеративный компонент поражения, возрастает напряженность местного иммунитета в легочной ткани. Использование ронколейкина в терапии остропрогрессирующего туберкулеза существенно повышает индуцированную (Кон А) продукцию ИЛ-2 спленоцитами; нормализует число спленоцитов с фенотипом СД4⁺, СД8⁺; стимулирует функциональную активность перитональных макрофагов. Введение ронколейкина в терапию туберкулеза выгодно отличается от применения иммуномодулятора широкого спектра действия - тималина: лечебный эффект более выражен, нормализация содержания СД4⁺, CД8⁺ спленоцитов зарегистрирована на более ранних сроках, продукция ИЛ-2 в ответ на Кон А спленоцитами повышается раньше и существеннее. Таким образом, реализация терапевтического эффекта, по-видимому, осуществляется за счет направленной коррекции установленной нами при данных формах заболевания высокой степени ингибиции Тх-1 со значительным снижением продукции ИЛ-2, вплоть до полного угнетения синтеза цитокина.

Принципиальным для фтизиатрии преимуществом ронколейкина является сохранение эффективности препарата на фоне рифампицина, тогда как для действия тималина требуется отмена данного туберкулостатика.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Васильев А. В., Галкин В.Б. Динамика распространения туберкулеза на Севере России. //Новые технологии в диагностике и лечении туберкулеза различных органов и систем. Т.II. - СПб. - 1998. - С.10.

2. Литвинов В.И., Сельцовская П.П., Свистунова А.С., Кочеткова Е.Я. Неотложные меры борьбы с туберкулезом в крупном мегаполисе. //Новые технологии в диагностике и лечении туберкулеза различных органов и систем. Т.II. - СПб. -1998. - С.11.

3. Иванова Л. А. Современные методы коррекции этиопатогенетической терапии деструктивных форм туберкулеза легких: Автореф. дисс.... д.м.н. - СПб. - 1995.

4. Александрова А. Е., Заболотных Н.В. Лечение левамизолом экспериментального туберкулеза. /Пробл. туб. -1981. - 10. - С.55.

5. Кноринг Б.Е., Александрова А.Е., Сахарова И.Я. и др. Влияние различных методов иммунотерапии на иммунологический статус больных туберкулезом легких. ///Пробл. туб. - 1984. - 1. - С.21.

6. Иванова Л. А. Иммуноактивные препараты тимуса в комплексной терапии больных инфильтративным деструктивным туберкулезом легких: Автореф. дисс.... канд. мед. наук. - Л. - 1986.

7. Chan C.H.S., Lai K.N., Leung J.C., Lai C.K. T-lymphocyte activation in patients with active tuberculosis//Amer. Rev. Res. Dis. - 1991. - V.144, 2. - P.458.

8. Orme I.M., Roberts A.D., Griffin J.P., Abrams J.S. Cytokine secretion by CD4⁺ T-lymphocytes acquired in response to Mycobacterium tuberculosis infection. // J. Immunol. - 1993. - V.151, 1. - P.518.

9. Surcel H.M., Troye-Blomberc M., Paulie S. et al. Th₁/Th₂, profiles in tuberculosis based on the proliferation and cyte-kine response of blood lymphocytes to mycobacterial antigens.// Immunology. - 1994. - V.81, 2. - P. 171.

10. Shiratsuchi H., Okida V., Tsuyuguchi I. Recombinath human interleukin-2 reverses in vitro-deficient cell-mediated immune responses to tuberculin purified protein derivative by lymphocytes of tuberculosis patients. // Infect, end Immun. - 1987. - V.55, 9. -P.2126.

11. Montano L.F., Aburto A., Masso F., Rayon I., Parra C. Produccion у respuesta a interleucina 2 роr celulas perifericas mononucleare de pacientes infectados роr Mycobacterium tuberculosis. // Rev. Latinoamer. Microbiol. - 1988. - V.30, 2. - Р. 125.

12. Gillis S., Ferm M.M., Ou W. et al. T-cell growth factor: parameters of production and a quantitative microassay for activity. // J. Immunol - 1978. - V.120, 6. - P.2027.

13. Исхаков А. Т., Алексеев А.П., Багурин П.Г. и др. // Иммунология. - 1988. - 6. - С.75.

14. Туманян М.А., Кирилличева Г.В. Изменение 5-нуклеотидазной активности в макрофагах перитонеального экссудата мышей при введении различных иммуностимуляторов. // Иммунология. - 1984. - 5. - С.29.

15. Александрова А.Е., Заболотных Н.В. Итоги изучения препаратов тимуса, как средств патогенетической терапии экспериментального туберкулеза. // Туберкулез как объект научных исследований. Т.II. - СПб. - 1994. - С.17.

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для лечения остропрогрессирующего туберкулеза легких. Предложено использовать на фоне изониазида и рифампицина иммунокоррегирующий препарат ронколейкин. Способ позволяет повысить эффективность лечения остропрогрессирующего туберкулеза легких за счет направленной коррекции функции Тх-1 и продукции ИЛ-2 и сохранить активность иммунокорректора на фоне приема рифампицина. 4 ил., 1 табл.

Способ лечения остропрогрессирующего туберкулеза легких, включающий терапию изониазидом и рифампицином, отличающийся тем, что вводят ронколейкин.