1
(21)4456475/31-13
(22)06.07.88
(46) 15.05.90, Бюл. № 18
(71)Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта АН СССР
(72)И.А. Прудовский, П.М. Рубцов, , Е.М. Капник, А.В, Зеленин,
К.Г. Скрябин и А.А. Баев
(53)578.085.23 (088.8)
(56)Krivi G.G. and Rowold E. Hybridoma, 3. 1984. № 2, p. 103-124.
(54)ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ГОРМОНУ РОСТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
(57)Изобретение относится к биотехнологии и касается получения моно- клональных антител с помощью культуры соматических гибридных клеток. Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток жиИэобретение относится к биотехнологии и касается получения монокло- нальных антител с помощью культуры соматических гибридных клеток.
Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируе мых клеток животных, продуцирующего моноклональные антитела (МонАТ) к гормону роста крупного рогатого ско-г та с высокой продуктивностью.
Штамм получают следующим образом.
Клетки мышиной миеломы Х-63АГ 8653 гибридизуют с клетками сепезенвотных, продуцирующего моноклональные антитела (МонАТ) к гормону роста крупного рогатого скота с высокой продуктивностью. Штамм получают гибридизацией клеток селезенки мышей линии BALB/c, иммунизированных гормоном роста крупного рогатого скота, с клетками миеломы Х-63 АГ8653. Клетки культивируют в среде RPMI- 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки пассируют 2 раза в неделю, кратность рассева 1:5, концентрация клеток для посева 5-104/мл. Штамм продуцирует МонАТ, специфичные гормону роста крупного рогатого скота. Секреция МонАТ на 3-4 день культивирования составляет 20 мкг/мл в культуральной среде и 15-20 мг/мл в асцитической жидкости. Штамм ВССК (П) № 24 ОГ продуцирует МонАТ, которые могут быть использованы для выявления гормона роста крупного рогатого скота.
(Л
ки мыши линии BALB/C, иммунизированными гормоном роста крупного рогатого скота. В результате селекции полученных гибридных клеток на среде ГАТ, приготовленной на основе среды RPMI-1640 с добавлением 10% эмбрно- .нальной телячьей сыворотки,отбирают штамм ИМБ 2/3, стабильно продуцирующий МонАТ к гормону роста крупного рогатого скота Штамм депонирован под номером ВСКК (П) № 240Д„
Культуральные признаки.
Сл
05 4ь
00 4Ь
315
Среда культивирования RPMI-1640 или DMEM сыворотка - эмбриональная телячья или телячья, антибиотик - гентамицин (40 мкг/мл) Тип роста - миеломный, способ культивирования - суспензионный. Возможно культивирование как в платах, так и в герметически закрытой посуде Частота пассирования - 2 раза в неделю, кратность рассева - 1:5, концентрация клеток при посеве . Количество произведенных пассажей - 30«
Продуктивность штамма.
Первичная культура моноклональна. Проведено два клонирования)ф Все клоны позитивны. На протяжении 30 пассажей клона ИМБ 2/3 интенсивность продукции антител не изменяется (титр антител по ELISA в культураль- ной среде , а в асцитической жидкости 10 }.
Содержание антител в асцитической жидкости 15-20 мг/мл.
Контроль видимой специфичности.
а,Прививаемость мышам BALB/C.
б.Продукция мышиных иммуноглобулинов (антител против гормона), видовое происхождение которых показано с помощью кроличьих антител к мышиным иммуноглобулинам.
Консервация.
Среда для замораживания - бычья или телячья сыворотка + 10% ДМСО. Режим замораживания - на программном замораживателе 1°С/мин до 70 С, затем перенос в жидкий азот и хранение в нем.
При размораживании клеток после .
5
0
5
0
5
Культура прививается и растет в виде асцита в перитонеальной полости мышей ВАЬЪ/С. За 7 дней до введения клеток мышам-реципиентам вводят по 0,5 мл пристана, Асцит образуется через 10-14 сут после введения 1-5 млн. клеток.
Использование штамма иллюстрируется следующим примером.
Пример. Асцитическую жид- кость центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге К-24. Осадок отбрасывают, а супернатант используют в дальнейшей работе. После определения оптической плотности супернатанта при 280 нм (38,9 о.е./мл) его разбавляют буфером А (0,01 М натрий-фосфат, 0,15 М NaCl, pH 7,3) до оптической плотности 12 о.е./мл. С этой целью к 6 мл супернатанта добавляют 13,4 мл буфера А. Далее проводят осаждение иммуноглобулинов .сульфатом аммония, добавляя к раствору 17,46 мл насыщенного при комнатной температуре раствора сульфата аммония. Смесь перемешивают по холоду в течение 40 мин и оставляют при 4°С на ночь„ Осадок отделяют центрифугированием при 15000 об/мин в течение 15 мин на центрифуге К-24, растворяют в 19,4 мл буфера А и повторяют осаждение иммуноглобулинов сульфатом аммония.
Осадок растворяют в 2,5 мл буфера Б (0,02 М трис-HCl , 0,04 М NaCl, рН 7,9) и диализуют против буфера (2 смены буфера по 250 мл). Диализо- ванный раствор наносят на колонку с
Изобретение относится к биотехнологии и касается получения моноклональных антител с помощью культуры соматических гибридных клеток. Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующего моноклональные антитела (МонАТ) к гормону роста крупного рогатого скота с высокой продуктивностью. Штамм получают гибридизацией клеток селезенки мышей линии BALB/с, иммунизированных гормоном роста крупного рогатого скота, с клетками миеломы Х-63 АГ8653. Клетки культивируют в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки пассируют 2 раза в неделю, кратность рассева 1:5, концентрация клеток для посева 5.104/мл. Штамм продуцирует МонАТ, специфичные гормону роста крупного рогатого скота. Секреция МонАТ на 3-4 день культивирования составляет 20 мкг/мл в культуральной среде и 15-20 мг/мл в асцитической жидкости. Штамм ВСКК (II) N240Д продуцирует МонАТ, которые могут быть использованы для выявления гормона роста крупного рогатого скота.
хранения в жидком азоте ампулы быстро Q ДЭАЭ-целлюлозой (h 4,5 см, S переносят в водяную баню при 37 С, 1,1 см ), уравновешенной буфером Б. слегка покачивая. Содержимое ампулы Колонку промывают буфером ii до пол- стерильно переносят в подогретую питательную среду в ячейки платы с макного выхода белков, не связываемых с ионообменником (пик 1), Далее проворофагами, инкубируют при 37 С. После дят элюцию белков градиентом концент50
20-24 ч инкубации среду сливают и добавляют свежую подогретую питательную среду.
Жизнеспособность после размораживания - 70% о
Контроль контаминации
Проверку на микоплазмеиное и бактериальное заражение осуществляли с использованием флуорохромов Хехст 33258 и ДАЛИ и посевом культуральной среды на мясопептонный; аг ар. Заражения не обнаружено.
Прививаемость животным изогенного происхождения - 100%.
рации NaCl от 0,04 до 0,5 М в 0,02 М трис-HCl буфере, рН 7,3, Объем градиента составляет 64 мл, скорость нанесения и элюции 32 мл/ч.
Полученные фракции анализируют с помощью электрофореза в полиакриламид- ном геле с додецилсульфатом натрия, а также иммуноферментного анализа, Антитела к гормону роста крупного рогатого скота выходят в пике 1.
Результаты очистки антител из асцитической жидкости: объем асцитичес-1 кой жидкости, взятой в опыт,6 мл; концентрация белка в асцитической
ДЭАЭ-целлюлозой (h 4,5 см, S 1,1 см ), уравновешенной буфером Б. Колонку промывают буфером ii до пол-
ного выхода белков, не связываемых с ионообменником (пик 1), Далее проводят элюцию белков градиентом концент0
рации NaCl от 0,04 до 0,5 М в 0,02 М трис-HCl буфере, рН 7,3, Объем градиента составляет 64 мл, скорость нанесения и элюции 32 мл/ч.
Полученные фракции анализируют с помощью электрофореза в полиакриламид- ном геле с додецилсульфатом натрия, а также иммуноферментного анализа, Антитела к гормону роста крупного рогатого скота выходят в пике 1.
Результаты очистки антител из асцитической жидкости: объем асцитичес-1 кой жидкости, взятой в опыт,6 мл; концентрация белка в асцитической
собом. Титр антител в культуральной
жидкости 32,4 мг/млЈ суммарное количество белка, взятое в опыт. 194,4 мг, (Ю4 -10s) и в асцитической жидкости суммарное количество белка во фрак- ( 10) весьма высок.
фрак
ции с колонки 96,8 мг; выход очищенного препарата антител из 1 мл асцитической жидкости 16 мг; выход очищенного препарата антител 50% от суммарного белка асцитической жидкости
Таким образом, штамм стабильно продуцирует моноклонапьные антитела к гормону роста крупного рогатого скота. Эти антитела связываются как с природным гормоном, так и с гормоном, полученным генноинжёнерным спо1 мл асцитической жидкости содер - жит 15-20 мг моноклональных антител к гормону роста крупного рогатого ско та. Препарат однороден.
jg Формула изобретения
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus BCKK (П) 24ОД, используемый для получе- J5 ния моноклональных антител к гормону роста крупного рогатого скота.
собом. Титр антител в культуральной
(Ю4 -10s) и в асцитической жидкости ( 10) весьма высок.
1 мл асцитической жидкости содер - жит 15-20 мг моноклональных антител к гормону роста крупного рогатого скота. Препарат однороден.
Формула изобретения
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus BCKK (П) 24ОД, используемый для получе- ния моноклональных антител к гормону роста крупного рогатого скота.
