СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ B ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ СВИНЬИ Российский патент 2009 года по МПК C12N9/14 C12N9/48 C12N9/64 

Изобретение относится к биохимии, точнее к способу получения карбоксипептидазы В (кВ) из поджелудочной железы свиньи, и может быть использовано в биотехнологии при получении генно-инженерного инсулина, а также в научных исследованиях при сиквенировании белков и синтезе пептидов.

Известен способ получения кВ из поджелудочной железы свиньи, включающий механическую гомогенизацию исходного сырья, автолиз, получение ацетонового порошка из автолизата, экстракцию, осаждение сульфатом аммония и последующую очистку целевого продукта двумя последовательными хроматографиями на ДЕАЕ-целлюлозе (А.с. №1551742 МКИ C12N 9/48, 1987).

Недостатком способа является использование на первом этапе органических растворителей (ацетон, диэтиловый эфир) и относительно низкая удельная активность конечного препарата (107-155 ед/мг белка).

Известен способ получения кВ из поджелудочной железы млекопитающих, предлагающий механическую гомогенизацию исходного сырья, автолиз, экстракцию при 50-75°С и дробное осаждение сульфатом аммония 320-416 г/л и диализ (патент RU №1487817, МКИ C12N 9/48, 1989).

Недостатком способа является недостаточно высокий выход конечного препарата.

Известен способ получения кВ из поджелудочной железы северных оленей (патент SU №1833427, МКИ C12N 9/64, 1991), включающий гомогенизацию, экстракцию, двухступенчатое подкисление до рН 5,2-5,5, затем до рН 3,8-4,2, осаждение ацетоном, повторное осаждение этанолом, лиофилизацию.

Недостатком способа является сложность получения исходного сырья.

Известен способ получения кВ из поджелудочной железы свиньи (патент RU №2177997, МПК C12N 9/14, 2002), включающий механическую гомогенизацию исходного сырья, автолиз, экстракцию при 60°С, двухступенчатое осаждение сульфатом аммония, повторную термообработку, хроматографию на оксиапатите, повторное осаждение сульфатом аммония, диализ, хроматографию на ДЕАЕ-сефарозе.

Недостатком способа является многоступенчатость (10 стадий) и длительность процесса.

Задача изобретения - упрощение способа получения карбоксипептидазы В при сохранении удельной активности конечного препарата на уровне от 200 ед/мг белка и выхода не менее 40%.

Поставленная задача решается за счет того, что в способе получения карбоксипептидазы В из свиной поджелудочной железы, включающем гомогенизацию, автолиз, экстракцию исходного сырья, осаждение сульфатом аммония, диализ и очистку целевого продукта двукратной хроматографией на Q-сефарозе, все этапы очистки проводят в буферных растворах, содержащих 0,001-0,005 М хлорида цинка, при этом экстракцию проводят при 65°С в течение 15 минут, а в процессе хроматографии используют ступенчатую элюцию 0,07-0,08 М NaCl в 0,005 М трис HCl, рН 7,6 буфере.

Отличием предлагаемого способа является, во-первых, применение экстракции при 65°С в течение 15 минут, позволяющей освободиться от значительного количества термолабильных белков и липидов; во-вторых, использование в процессе хроматографии на Q-сефарозе ступенчатой элюции 0,07-0,08 М хлорида натрия в 0,005 М трис HCl рН 7,6, позволяющей получать белковые пики с высокой концентрацией и, соответственно, высокой удельной активностью при минимальных трудозатратах; в-третьих, использование в качестве стабилизатора активности карбоксипептидазы В хлорида цинка, который добавляют в рабочий буфер до концентрации 0,001-0,005 М на всех этапах процесса.

Пример 1.

1. Гомогенизация и автолиз.

Одну железу (~0,3 кг) дважды гомогенизируют в бытовой мясорубке, помещают в пластиковую емкость и инкубируют в течение ночи на шейкере при комнатной температуре.

2. Экстракция.

К полученному автолизату добавляют 2 объема (600 мл) 0,01 М КН₂PO₄, рН 6,5, 0,001 М ZnCl₂ и экстрагируют в предварительно нагретом до 65°С водном термостате в течение 15 минут при перемешивании механической мешалкой. Полученный экстракт охлаждают в ванне с проточной холодной водой и центрифугируют при 12000 об/мин, 4°С, 30 минут. Супернатант собирают, осадок отбрасывают.

3. Фракционирование сульфатом аммония.

К полученному супернатанту добавляют сульфат аммония из расчета 350 г на литр экстракта, поддерживая рН 6,5 с помощью сухого карбоната натрия.

Осадок формируют при +4°С в течение ночи. Затем осаждают центрифугированием при 8000 об/мин 30 минут и растворяют в 100 мл 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl₂.

Полученный осадок диализуют против частых смен 0,005 М трис HCl, рН 7,6 до полного удаления сульфата аммония. Не растворившийся осадок осаждают центрифугированием, супернатант используют для хроматографии.

4. Хроматография на Q-сефарозе.

Супернатант, полученный на предыдущем этапе, наносят на колонку с Q-сефарозой объемом 50 мл, предварительно уравновешенную 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl₂ со скоростью 100 мл/ч. Колонку промывают последовательно тремя объемами стартового буфера, тремя объемами рабочего буфера с 0,005 М NaCl и элюируют целевой белок раствором 0,08 М NaCl в 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl₂. Собирают белковые фракции с удельной активностью более 100 ед./мг белка, помещают в диализный мешок и диализуют в течение ночи против 2-х смен 10-кратных объемов 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl₂.

5. Повторная хроматография на Q-сефарозе.

Отдиализованную фракцию целевого фермента наносят на колонку объемом 10 мл, предварительно уравновешенную 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl₂. Промывают 3 колоночными объемами рабочего буфера, тремя объемами рабочего буфера с 0,005М NaCl. Элюируют целевой белок 0,08 М NaCl в 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl₂. Собирают белковые фракции с удельной активностью более 170 ед./мг. Готовый препарат хранят замороженным при - 20°С.

Выход составляет 143 мг фермента с удельной активностью 235 ед./мг белка.

Пример 2.

1. Гомогенизация и автолиз.

Одну железу (~0,3 кг) дважды гомогенизируют в бытовой мясорубке, помещают в пластиковую емкость и инкубируют в течение ночи на шейкере при комнатной температуре.

2. Экстракция.

К полученному автолизату добавляют 2 объема (600 мл) 0,01 М КН₂PO₄, рН 6,5, 0,001 М ZnCl₂ и экстрагируют в предварительно нагретом до 65°С водном термостате в течение 15 минут при перемешивании механической мешалкой. Полученный экстракт охлаждают в ванне с проточной холодной водой и центрифугируют при 12000 об/мин, 4°С, 30 минут. Супернатант собирают, осадок отбрасывают.

3. Фракционирование сульфатом аммония.

К полученному супернатанту добавляют сульфат аммония из расчета 350 г на литр экстракта, поддерживая рН 6,5 с помощью сухого карбоната натрия.

Осадок формируют при +4°С в течение ночи. Затем осаждают центрифугированием при 8000 об/мин 30 минут и растворяют в 100 мл 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl₂. Полученный осадок диализуют против частых смен 0,005 М трис HCl, рН 7,6 до полного удаления сульфата аммония. Нерастворившийся осадок осаждают центрифугированием, супернатант используют для хроматографии.

4. Хроматография на Q-сефарозе.

Супернатант, полученный на предыдущем этапе, наносят на колонку с Q-сефарозой объемом 50 мл, предварительно уравновешенную 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl₂ со скоростью 100 мл/ч. Колонку последовательно промывают тремя объемами стартового буфера, тремя объемами рабочего буфера с 0,005 М NaCl и элюируют целевой белок 0,08 М NaCl в 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl₂. Собирают белковые фракции с удельной активностью более 100 ед./мг белка, помещают в диализный мешок и диализуют в течение ночи против двух смен 10-кратных объемов 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl₂.

5. Повторная хроматография на Q-сефарозе.

Отдиализованную фракцию целевого фермента наносят на колонку объемом 10 мл, предварительно уравновешенную 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl₂. Промывают тремя колоночными объемами рабочего буфера, тремя объемами рабочего буфера с 0,005М NaCl. Элюируют целевой белок 0,07 М NaCl в 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl₂. Собирают белковые фракции с удельной активностью более 170 ед./мг. Готовый препарат хранят замороженным на - 20°С.

Выход составляет 133 мг фермента с удельной активностью 245 ед./мг белка.

Пример 3.

1. Гомогенизация и автолиз.

Одну железу (~0,3 кг) дважды гомогенизируют в бытовой мясорубке, помещают в пластиковую емкость и инкубируют в течение ночи на шейкере при комнатной температуре.

2. Экстракция.

К полученному автолизату добавляют 2 объема (600 мл) 0,01 М КН₂PO₄, рН 6,5, 0,001 М ZnCl₂ и экстрагируют в предварительно нагретом до 65°С водном термостате в течение 15 минут при перемешивании механической мешалкой. Полученный экстракт охлаждают в ванне с проточной холодной водой и центрифугируют при 12000 об/мин, 4°С, 30 минут. Супернатант собирают, осадок отбрасывают.

3. Фракционирование сульфатом аммония.

К полученному супернатанту добавляют сульфат аммония из расчета 350 г на литр экстракта, поддерживая рН 6,5 с помощью сухого карбоната натрия.

Осадок формируют при +4°С в течение ночи. Затем осаждают центрифугированием при 8000 об/мин 30 минут и растворяют в 100 мл 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl₂. Полученный осадок диализуют против частых смен 0,005 М трис HCl, рН 7,6 до полного удаления сульфата аммония. Не растворившийся осадок осаждают центрифугированием, супернатант используют для хроматографии.

4. Хроматография на Q-сефарозе.

Супернатант, полученный на предыдущем этапе, наносят на колонку с Q-сефарозой объемом 50 мл, предварительно уравновешенную 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl₂ со скоростью 100 мл/ч. Колонку последовательно промывают тремя объемами стартового буфера, тремя объемами рабочего буфера с 0,005 М NaCl и элюируют целевой белок 0,07 М NaCl в 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl₂. Собирают белковые фракции с удельной активностью более 100 ед./мг белка, помещают в диализный мешок и диализуют в течение ночи против 2-х смен 10-кратных объемов 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl₂.

5. Повторная хроматография на Q-сефарозе.

Отдиализованную фракцию целевого фермента наносят на колонку объемом 10 мл, предварительно уравновешенную 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl₂.

Промывают 3-колоночными объемами рабочего буфера, тремя объемами рабочего буфера с 0,005М NaCl. Элюируют целевой белок 0,07 М NaCl в 0,005 М трис HCl, рН 7,6, 0,001 М ZnCl₂. Собирают белковые фракции с удельной активностью более 170 ед./мг белка. Готовый препарат хранят замороженным при - 20°С.

Выход составляет 123 мг фермента с удельной активностью 250 ед./мг белка.

Пример 4.

Все делают как в примере 3, но хлорид цинка добавляют до концентрации 0,005 М.

Выход целевого белка составляет 120 мг с удельной активностью 242 ед./мг белка.

Пример 5.

Все делают как в примере 3, но хлорид цинка не добавляют.

Выход целевого белка составляет 123 мг с удельной активностью 193 ед./мг белка.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать 410-476 мг препарата карбоксипептидазы В с удельной активностью 235-250 ед/мг (в прототипе 220 ед./мг) или 111860-102500 единиц с 1 кг исходного сырья при сокращении числа стадий очистки до 7 по сравнению с 10 в прототипе. Это достигается за счет применения ступенчатой элюции в процессе хроматографии на Q-сефарозе и использования 0,001-0,005 М хлорида цинка в качестве стабилизатора.

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в биотехнологии при получении генно-инженерных продуктов. Для выделения карбоксипептидазы В из поджелудочной железы свиньи экстракцию, осаждение сульфатом аммония и очистку проводят в буферных растворах, содержащих 0,001-0,005 М хлорида цинка. При этом очистку проводят двукратной хроматографией на Q-сефарозе, а в процессе хроматографии используют элюцию 0,07-0,08 М NaCl в 0,005 М трис HCl буфере, рН 7,6. Изобретение обеспечивает упрощение способа получения карбоксипептидазы В при сохранении высокой удельной активности конечного препарата и стабильности карбоксипептидазы В.

Способ получения карбоксипептидазы В из поджелудочной железы свиньи, включающий гомогенизацию животного сырья, автолиз и экстракцию в присутствии буферного раствора, осаждение сульфатом аммония и последующую очистку целевого продукта двукратной хроматографией, отличающийся тем, что экстракцию, осаждение и очистку проводят в буферных растворах, содержащих 0,001-0,005 М хлорида цинка, при этом экстракцию проводят при 65°С, а очистку проводят хроматографией в два этапа на Q-сефарозе, применяя элюцию 0,07-0,08 М NaCl в 0,005 М трис HCl, рН 7,6 буфере.