ШТАММ БАКТЕРИЙ VIBRIO CHOLERAE 0139 СЕРОВАРА КМ 115 (И-1262), АВИРУЛЕНТНЫЙ ТЕСТ-ШТАММ, НЕ СОДЕРЖАЩИЙ CTX АВ ОПЕРОН, ДЛЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ И ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Российский патент 2000 года по МПК C12N1/00 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/63 

Штамм бактерий Vibrio cholerae 0139 серовара КМ 115 (И-1262), авирулентный тест-штамм, не содержащий ctx AB оперон, для иммунологических и генетических исследований.

Изобретение относится к области микробиологии (в частности микробиологии холеры) и может быть использовано в иммунологических и генетических исследованиях в качестве авирулентного тест-штамма 0139 серовара, не содержащего оперон ctx AB гена, детерминирующего синтез холерного энтеротоксина.

Известны штаммы Vibrio cholerae 0139 серовара, выделенные от людей, больных холерой (МО-45, Япония; Ар, Индия; 59-"Dinolicus" Франция; Р-16063, Ростов-на-Дону, Россия), не вызывающие гемолиз эритроцитов барана, содержащие ctx AB оперон и являющиеся высоковирулентными для человека и кроликов-сосунков.

Наиболее близким по своему таксономическому положению является штамм Vibrio cholerae 0139 серовара Р-16063 (Россия), выделенный от больного холерой. Штамм характеризуется как высоковирулентный для кроликов-сосунков, содержащий ctx AB оперон, детерминирующий выработку холерного энтеротоксина, не обладает гемолитической способностью в отношении эритроцитов барана, является эпидемически опасным (может вызвать вспышку или эпидемию холеры).

Отличительными признаками известных штаммов Vibrio cholerae 0139 серовара является выделение их от больных холерой людей, высокая вирулентность для человека и кроликов-сосунков, отрицательная гемолитическая активность в отношении эритроцитов барана, способность вырабатывать холерный энтеротоксин, продукцию которого обусловливает наличие ctx AB оперона.

Целью изобретения является штамм Vibrio cholerae 0139 серовара, гемолитический в отношении эритроцитов барана, авирулентный (Vct^-) для кроликов-сосунков, не продуцирующий холерный энтеротоксин вследствие отсутствия у него ctx AB оперона.

Штамм Vibrio cholerae 0139 серовара КМ 115 (И-1262) выделен из природного источника, а именно из р. Обь, может быть использован: 1. Как авирулентный (Vct^-) тест-штамм при дифференциации вирулентных штаммов 0139 серовара путем внутрикишечного заражения кроликов-сосунков. 2. Как контрольный тест-штамм при определении наличия ctx AB оперона у штаммов аналогичного серовара, выделенных из различных источников. 3. В иммунологических и генетических исследованиях, в частности, как компонент при разработке живой холерной вакцины.

Выделенный штамм Vibrio cholerae 0139 серовара КМ 115 (И-1262) депонирован в Государственной коллекции бактериальных возбудителей I=II групп патогенности при Российском научно-исследовательском институте "Микроб" под N КМ 115 (И-1262).

Штамм Vibrio cholerae 0139 серовара N КМ 115 (И-1262) характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки
Грамотрицательные полиморфные палочки, подвижны, с одним полярно расположенным жгутиком, образуют капсулу. На агаре Мартена и Хоттингера (pH 7,6) через 18 часов роста при 37^oC формируют полупрозрачные колонии голубовато-серого цвета до 2 мм в диаметр с ровным краем (S-форма); в бульоне и 1% пептонной воде - равномерное помутнение с нежной пленкой на поверхности.

Физиолого-биохимические признаки
Аэроб. Оптимальная температура роста 37^oC. Оптимум pH 7,6-8,2. Продуцирует индофенолоксидазу, относится к 1 группе Хейберга, окисляет и ферментирует глюкозу до кислоты без газа, декарбоксилирует лизин и орнитин, не обладает дигидролазой аргинина, обусловливает гемолиз эритроцитов барана в пробе Грейга, не лизируется холерными "С", "Эльтор", "ХДФ-3,4,5", "ДДФ", "ТЭПВ" фагами, растет на среде с полимиксином (30 мкг/мл).

Штамм Vibrio cholerae КМ 115 (И-1262) агглютинируется в развернутой реакции агглютинации сывороткой против штаммов 0139 серовара до диагностического титра и не агглютинируется холерными диагностическими "O-", "Инаба-" "Огава-", "RO-" сыворотками.

Особые свойства штамма
Штамм Vibrio cholerae КМ 115 (И-1262) не содержит ctx AB оперона, детерминирующего выработку холерного энтеротоксина, вызывает гемолиз эритроцитов барана в пробе Грейга, является авирулентным для кроликов-сосунков при внутрикишечном их заражении. Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами использования штамма Vibrio cholerae КМ 115 (И-1262).

Пример 1. Штамм Vibrio cholerae КМ 115 (И-1262), выделенный из р. Обь, при внутрикишечном заражении кроликов-сосунков в дозах 10⁵, 10⁷, 10⁹ КОЕ/мл не вызывает их гибели, что говорит о неспособности штамма продуцировать холерный токсин. Заражение крольчат референтными (высоковирулентными для людей) штаммами 0139 серовара (МО - 45, Япония; Ар-2, Индия; 59 - "Donolicus", Франция; Р-16063, Ростов-на-Дону) вызывало их гибель при внутрикишечном заражении в дозе 10⁵ КОЕ/мл с выраженным (на вскрытии) холерогенным симптомокомплексом и видимыми макроскопическими изменениями внутренних органов, что подтверждает способность этих штаммов вырабатывать холерный энтеротоксин.

Пример 2. Штамм КМ 115 (И-1262), выделенный из р. Обь, не содержит ctx AB оперона, отвечающего за выработку холерного энтеротоксина. При постановке полимеразно-цепной реакции (ПЦР) были использованы олигонуклеотидные праймеры, синтезированные на основе нуклеотидных последовательностей ctx AB оперона, представленных в базе данных Gen Bank EMBL. Специфичный продукт амплификации в реакции ПЦР со штаммом КМ 115 (И-1262) не образовывался, что подтверждает отсутствие у него гена токсинообразования, содержащего ctx AB оперон. Референтные (контрольные) штаммы 0139 серовара обусловливали в реакции ПЦР наличие специфичного продукта амплификации, что доказывает их способность вырабатывать холерный энтеротоксин, продукция которого не возможна без присутствия в геноме ctx AB оперона.

Преимущества штамма Vibrio cholerae КМ 115 (И-1262), вызывающего гемолиз эритроцитов барана, авирулентного для кроликов-сосунков, не содержащего в геноме ctx AB оперон, выделенного из природного источника - р. Обь, по сравнению с его аналогами следуют из приведенных выше примеров.

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к микробиологии холеры, и может быть использовано в иммунологических и генетических исследованиях в качестве авирулентного тест-штамма 0139 серовара, не содержащего оперон ctx AB гена, детерминирующего синтез холерного энтеротоксина. Штамм Vibrio cholerae 0139 серовара выделен из природного источника - из воды р. Обь, гемолитический в отношении эритроцитов барана, авирулентен (Vct^-) для кроликов-сосунков, не продуцирует холерный энтеротоксин вследствие отсутствия у него ctx AB оперона.

Авирулентный тест-штамм бактерий Vibrio cholerae 0139 серовара КМ 115 (И-1262), не содержащий в геноме ctx АВ оперон, для иммунологических и генетических исследований.