СОРБЕНТ ДЛЯ УДАЛЕНИЯ АТЕРОГЕННЫХ ЛИПОПРОТЕИНОВ ИЗ КРОВИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 1998 года по МПК A61M1/34 A61M1/36 

Изобретение относится к биологии и медицине и может найти применение в клинической практике при различных нарушениях липидного и липопротеидного обменов.

Одной из наиболее тяжелых форм дислипопротеидемий является семейная или наследственная гиперхолестеринемия, приводящая в конечном итоге к тяжелым атеросклеротическим поражениям сердечно-сосудистой системы. Основной причиной развития различных форм гиперхолестеринемии (гетеро- и гомозиготной) считают нарушение функциональной активности: уменьшение либо полное отсутствие на клеточных мембранах соответствующих рецепторов к липопротеидам низкой плотности (ЛПНП) [1]. Кроме лиц, страдающих семейной гиперхолестеринемией, снижение уровня ЛПНП необходимо у больных с хронической почечной недостаточностью и у пациентов с тяжелыми формами ишемической болезни сердца [2].

Из существующих методов снижения повышенных концентраций атерогенных липопротеидов, наряду с медикаментозными способами воздействия и диэтой, особый интерес представляют сорбционные технологии, которые позволяют, используя метод плазмосорбции, избирательно удалять на колонках специфические субстанции, имеющие непосредственное отношение к развитию патологического процесса, оставляя в плазме крови некомплементарные сорбенту молекулы. Принцип терапии, основанный на элиминации атерогенных липопротеидов в экстракорпоральном контуре кровообращения, является весьма перспективным при лечении различных нарушений липидного и липопротеидного обменов у человека, но требует создания высокоэффективных селективных биосовместимых гемосорбентов.

Известен сорбент для поглощения токсина на основе углеродного материала, пропитанного полимеризованным органическим веществом. В качестве углеродного материала применен обеззоленный уголь с объемом пор 0,05 - 0,15 и 0,30 - 0,60 см³/г [3].

Известный сорбент не обладает специфичностью к атерогенным липопротеидам.

Известен способ получения сорбента на основе углеродного материала, включающий пропитку углеродного материала в виде обеззоленного угля с объемом пор 0,05 - 0,15 и 0,30 - 0,60 см³/г полимеризующимися органическими веществами и последующую его термообработку при температуре 35-70^oC, при непрерывном перемешивании и соотношении углеродного материала и полимеризующихся веществ 1:(0,1 - 0,2) [3].

Известный способ не обеспечивает получение сорбента, обладающего специфичностью к атерогенным липопротеидам.

Известен синтетический углеродный материал сферической грануляции для сорбции веществ из растворов и биологических жидкостей с объемом микропор 0,2 - 0,6 см³/г, объемом мезопор 0,2 - 2,1 см³/г, объемом макропор 0,1 - 0,5 см³/г, с удельной поверхностью пор 150 - 2000 м³/г, удельной поверхностью мезопор 20 - 300 м³/г, с эффективной полушириной микропор 0,2 - 1,1 нм, эффективным радиусом мезо- или макропор 3 - 250 нм, соотношением объемов микро- и мезопор 1:1 - 3,5; диаметром гранулы 0,1 - 2,0 нм. Материал может содержать на поверхности различные функциональные протоногенные группы, катионы металлов, биологически активные добавки [4].

Известный сорбент не обладает специфичностью к атерогенным липопротеидам.

Известен способ получения сорбента, включающий карбонизацию пористых органических полимеров сферической грануляции, термообработку, активацию с получением углеродного носителя и его модификацию. Карбонизацию осуществляют путем пиролиза без доступа воздуха или при недостатке кислорода при подъеме температуры до 599^oC в течение 2 - 24 ч или путем жидкофазного окисления при 130 - 180^oC серной кислотой или олеумом, а термообработку ведут при 700 - 800^oC в течение 15-30 мин в токе инертного газа [4].

Известный способ не обеспечивает получения сорбента, обладающего специфичностью к атерогенным липопротеидам.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является сорбент, пригодный для удаления атерогенных липопротеидов из крови, содержащий пористую или не имеющую пор гранулу со средним диаметром 0,1-100,0 мкм из органического или неорганического материала, имеющую на поверхности ковалентно соединенный с ней непосредственно или через функциональные группы фуллерен. Гранула может быть выполнена из полимерного или из кремнийсодержащего материала [5].

Известный сорбент позволяет удалять атерогенные липопротеидов из крови, однако имеет недостаточную сорбционную емкость в области высоких концентраций ЛПНП.

Известен способ получения сорбента для удаления липопротеидов из крови, принятый в качестве прототипа, включающий нанесение на гранулы силикагеля аминных групп, обработку фуллерена органическим растворителем и последующее получение соединения C_60/70HBr, смешивание с последним упомянутых гранул силикагеля и получение на поверхности гранул соединения SiNHC_60/70H, удаление органического растворителя под вакуумом, промывку и сушку полученного сорбента [5].

Известный способ-прототип обеспечивает получение сорбента, специфичного к липопротеидам низкой плотности, но, к сожалению, он имеет недостаточную емкость в области высоких концентраций ЛПНП.

Задаче настоящей группы изобретений является разработка такого сорбента для удаления атерогенных липопротеидов из крови и способа его получения, который бы имел повышенную специфическую емкость в области высоких концентраций ЛПНП.

Поставленная задача решается тем, что в сорбенте для удаления атерогенных липопротеидов из крови, включающем пористую гранулу из органического или неорганического материала с фуллереном на ее поверхности, фуллерен нанесен в виде конденсированного из раствора немодифицированного фуллерена.

Поставленная задача решается также тем, что в способе получения сорбента для удаления атерогенных липопротеидов из крови, включающем обработку фуллерена органическим растворителем, смешивание полученного состава с пористыми гранулами из органического или неорганического материала, удаление органического растворителя, последующую промывку и сушку полученного сорбента, обработку фуллерена ведут путем растворения его в органическом растворителе, химически инертном к фуллерену. Промывку можно вести последовательно этиловым спиртом и дистиллированной водой. Сушку сорбента с гранулами можно вести при температуре 30-120^oC.

Заявителю неизвестно из научно-технической литературы, в том числе патентной, адсорбента и способа его получения, тождественного заявляемым решениям, в связи с чем, по мнению заявителя, предлагаемые технические решения обладают новизной.

В известном сорбенте фуллерен химически связан с материалом поверхности гранулы посредством функциональных групп, в то время как в заявляемом сорбенте фуллерен нанесен на поверхность в процессе конденсации его трехмерных молекул из раствора и удерживается на поверхности только ван-дер-ваальсовыми силами, что приводит к иной макроструктуре поверхности. В результате сорбционная емкость сорбента в отношении ЛПНП, как показано ниже, увеличивается в два раза в области высоких концентраций ЛПНП.

В отличие от известного способа получения фуллеренсодержащего сорбента на основе химического взаимодействия фуллерена и материала поверхности гранулы-носителя, в заявляемом способе фуллерен осаждают на поверхности простой конденсацией из раствора без образования химической связи.

Это свидетельствует, по мнению заявителя, о соответствии заявляемых технических решений критерию изобретательский уровень.

На фиг. 1 приведена зависимость количества ЛПНП (Q) адсорбированного заявляемым сорбентом (1) и сорбентом-прототипом (2) от концентрации ЛПНП (C) в системе изотонический раствор-адсорбент-ЛПНП (гранулы выполнены из силикагеля).

На фиг. 2 приведены результаты хроматографии на заявляемом сорбенте (гранулы из силикагеля). A - плазма крови, B - беспротеидные белки, C - липопротеиды высокой плотности (ЛПВП), D - липопротеиды низкой плотности (ЛПНП).

Заявляемый сорбент включает пористую гранулу из органического или неорганического материала, на поверхность которой нанесен конденсированный из раствора немодифицированный фуллерен. Характеристики изготовленных сорбентов приведены в таблице 1.

Заявленный сорбент изготавливают следующим образом (на примере силикагеля). Пористые гранулы силикагеля промывают следующим образом (на примере силикагеля). Пористые гранулы силикагеля промывают последовательно этиловым спиртом, водой и вновь этиловым спиртом, после чего сушат при температуре 120-150^oC в течение 1-2 суток. Растворяют фуллерен в органическом растворителе. Концентрация фуллерена равна концентрации насыщенного раствора C_нр. В качестве растворителя были использованы: диметилхлорид (ДМХ), четыреххлористый углерод (ЧХУ), ортодихлорбензол (ОДХБ), сероуглерод (СУ) и бензол (Б). Для этих растворителей C_нр составляет: ДМХ - 0,26 мг/мл; ЧХУ - 0,32 мг/мл; ОДХБ - 30 мг/мл, Б - 1,7 мг/мл, СУ - 7,9 мг/мл. С использованием этих растворителей были приготовлены растворы фуллерена с концентрациями, указанными в таблице 1.

Гранулы силикагеля заливались раствором фуллерена в соотношении: для ОДХБ - 1:1, для СУ и Б = 1:3, для ЧХУ и ДХМ - 1:5. В случае применения четырех последних перемешивали полученную суспензию при температуре 50-60^oC для упаривания объема раствора до соотношения 1:1. Затем испаряли органический растворитель. В случае ЧХУ и ДМХ испарение вели сначала при температуре 20-23^oC в течение 3-4 часов, а затем при температуре 40-50^oC в течение 1-2 часов. При применении ОДХБ испарение осуществляли при давлении 10^-2 мм рт. ст. при температуре 23-25^oC, с помощью роторного испарителя при давлении 10^-1 мм рт.ст. и температуре 100^oC, а также естественным испарением при температуре 23-25^oC. Затем производили отмывку сорбента от следов растворителя 50-кратным объемом этилового спирта и 100-кратным объемом дистиллированной воды и сушку при температуре 30-120^oC в термостате в течение 5-10 часов до получения сыпучего сорбента.

Пример 1. Фуллерен C₆₀ растворяли в ОДХБ при температуре 23^oC в течение 24 часов. Концентрация фуллерена в растворе составила 30 мг/мл. Подготовленные, как указано выше, гранулы силикагеля размером 10 мкм с порами (см. таблицу 1) смешивали с приготовленным раствором фуллерена. Затем удаляли растворитель испарением при 120^oC в ротационном испарителе при 10^-1 мм рт. ст.

Пример 2. Фуллерен C₇₀ растворяли в ЧХУ при температуре 23^oC в течение 24 часов. Концентрация фуллерена в растворе составила 0,32 мг/мл. Подготовленные, как указано выше, гранулы силикагеля размером 10 мкм с порами 5 нм² смешивали с приготовленным раствором фуллерена. Затем удаляли растворитель путем испарения при 23^oC при атмосферном давлении.

Пример 3. Экстракт фуллерена (состав приведен в таблице 1) растворяли в бензоле 23^oC. Концентрация фуллерена в растворе составила 1,7 мг/мл. Подготовленные, как указано выше, гранулы силикагеля смешивали с приготовленным раствором фуллерена. Затем удаляли растворитель путем испарения при 50^oC при атмосферном давлении.

Всего было изготовлено 11 образцов адсорбентов и образец сорбента, прототипа, характеристика которых приведены в таблице 1.

Как показали исследования, тип растворителя фуллерена (протонный, апротонный, полярный, неполярный), а также его количество и продолжительность обработки гранул не влияют на свойства получаемого сорбента.

Было проведено определение селективности и емкости заявляемого сорбента с гранулами из силикагеля по данным биохимического анализа плазмы крови.

В таблице 2 приведен химический состав плазмы крови, на которой проводили исследования образцов сорбента, указанных в таблице 1.

В таблице 3 приведены данные по изменению биохимических показателей плазмы крови при плазмосорбции с использованием заявляемого сорбента и сорбента-прототипа. Истинную специфическую сорбционную емкость сорбента определяли следующим образом. К сорбенту добавляли плазму крови больных. Связавшиеся с сорбентом липопротеиды определяли по методу Бурштейна, Самай [6]. Каждое из приведенных значений Эл (элиминация - величина, характеризующая сорбционную способность сорбента) получено как среднее значение из трех параллельных опытов, заключавшихся в сопоставлении биохимического анализа плазмы крови до и после ее контакта с сорбентом в статических условиях. Анализ данных таблицы 3 выявил изменение биохимического состава плазмы по концентрации атерогенных липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) при контакте с заявляемым сорбентом на 10-40%, в то время как концентрация антиатерогенных липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) не убывает при контакте с сорбентом. Таким образом, полученные данные об изменении биохимического состава плазмы крови при контакте с заявляемым сорбентом выявляют его активную роль как плазмосорбента атерогенного ЛПНП.

Зависимость величины Эл от состава плазмы крови обусловлена влиянием концентрации ЛПНП.

Следует отметить, что при проведении плазмокоррекции с использованием заявляемого сорбента, различающегося плотностью молекул фуллерена на единицу поверхности гранул, увеличение их плотности в 100 раз приводит к росту ЭЛ только в 2 раза.

В таблице 4 приведены значения количества ЛПНП, связанного с адсорбентом, рассчитанные с использованием результатов модельного эксперимента, выполненного в статических условиях с использованием системы : изотонический раствор NaCl при pH 7,4 - индивидуальные липопротеиды разной плотности - сорбент. Расчет емкости и селективности сорбента осуществляли по данным прямого анализа фазы сорбента.

Как видно из таблицы 4, емкость ЛПНП в этой системе лежит в интервале 30-75 мг/г, что соответствует 30-50% вводимого в систему количества метаболита. Этот результат совпадает с выводами, сделанными на основе данных таблицы 3 для системы (плазма крови - метаболит - адсорбент) и объясняет зависимость значений Эл от состава плазмы крови влиянием концентрации ЛПНП. Емкость сорбентов по отношению к ЛПОНП на порядок ниже, чем для ЛПНП.

Из фиг. 1 видно, что экспериментальные кривые имеют сложный характер и на них могут быть выделены 4 характерных участка, различающихся видом зависимости количества вещества, адсорбируемого на поверхности гранул сорбента, от количества вещества, присутствующего в системе. 1-й и 3-й участки кривой выявляют примерно линейный рост Q от C, а 2-й и 4-й - независимость Q от C. Данная зависимость определялась многократно, как с использованием одной, так и новых партий адсорбента. Сложный двухступенчатый характер кривых хорошо воспроизводились на всех образцах заявляемого адсорбента, что указывает на воспроизводимость заявляемого способа получения адсорбента, так и на достоверность наблюдаемых закономерностей адсорбции. На фиг. 1 приведена также зависимость количества адсорбированных молекул липопротеида от их концентрации в системе для сорбента-прототипа. Из фиг. 1 видно, что в области малых концентраций ЛПНП (1,5 мг/мл) форма кривых для заявляемого сорбента и сорбента-прототипа одинакова. Наибольшие принципиальные изменения кривые претерпевают в области высоких концентраций ЛПНП: на кривой для сорбента-прототипа отсутствуют 3-й и 4-й участки, характерные для заявляемого сорбента. Вместо этого наблюдается ровное плато, указывающее на насыщение всех активных центров, соответствующее образованию монослоя ДЛПНП на поверхности сорбента. Это приводит к снижению емкости сорбента-прототипа в области высоких концентраций ЛПНП. Таким образом, наибольшая сорбционная емкость заявляемого сорбента в 2 раза выше, чем у сорбента-прототипа. Это, очевидно, обусловлено тем, что емкость заявляемого сорбента определяется не только присутствием молекул фуллерена в качестве функциональных групп, образующих центры сорбции.

Было определено влияние молекулярной массы фуллерена на сорбционную емкость заявляемого сорбента. Максимальную емкость по отношению к ЛПНП имеет сорбент с фуллереном C₆₀ (75 мг на 1 г сорбента), сорбент с фуллереном C₇₀ имеет на 30% меньшую емкость. Было также исследовано влияние удельной поверхности и размера пор гранулы на сорбционную емкость заявляемого сорбента. По сравнению с гранулами, имеющими размер пор 5 нм, гранулы с размерами пор 40 и 200 нм имеют емкость соответственно в 1,5 и 2,0 раза меньшую. В то же время уменьшение удельной поверхности гранулы приводит к росту емкости сорбента (соотношение емкостей гранул с удельной поверхностью (м²/г): 280, 49 и 15 составляет соответственно 1:4:20. Было также установлено, что специфическая емкость сорбента не зависит от материала гранул.

В экспериментах по исследованию сорбционных свойств заявляемого сорбента в качестве объекта перфузии использовали плазму больных наследственной гиперхолестеринемией, чистые фракции липопротеидов, выделенные методом дифференциального ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте плотности NaBr [7] . Процедуру сорбции проводили в колоночном варианте (динамический режим) и методом стендовых статических экспериментов. В качестве элюирующих растворов использовали 0,1%-ный раствор додецилсульфата натрия (ДСН)Na₂SO₃. Элюирование осуществляли со скорость 0,6 мл/мин. Объем дозирования 0,5 мл, концентрация белка 0,5-1,0 мг/мл. После введения пробы проводили промывку колонки стартовым раствором для элюирования молекул, не адсорбируемых в колонке. Элюирование связанных сорбентом белков осуществляли раствором (ДСН)Na₂SO₃ в воде. Детектирование осуществляли с использованием спектрометра на длине волны 280 нм. Результаты элюирования проведены на фиг. 2, из которой видно, что в случаях (A) и (D) имеет место связывание белка сорбентом (второй максимум). Соотношение площадей пиков на хромотограммах соответствует весовым долям связанного белка.

Полученные данные подтверждают высокую селективность заявляемого сорбента по отношению к липопротеидам разной плотности: высокую активность по отношению к ЛПНП и низкую по отношению к ЛПВП и ЛПОНП.

Литература
1. Brown M., Goldstein J. - Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1974, v. 71, p. 788-792.

2. Лопатин Н. А. , Лопухин Ю.Я. - Эфферентные методы в медицине. - М.: "Медицина". - 1989, с. 347.

3. Патент РФ No 1834662, МПК: A 61 R 33/44, опубл. 15.08.93 г.

4. Патент РФ No 1836138, МПК: B 01 J 20/20, опубл. 23.08.93 г.

5. Патент США No 5308481, МПК: B 01 D 15/08, опубл. 03.05.94 г.

6. Колб В.Г., Камышников В.С. - Клиническая биохимия. - Минск, "Беларусь". - 1976, 271 с.

7. Havel R.J., Eder H.A., Brandon J.H. - Journ.Ciln.Invest. - 1995, v. 34, No 9, p. 1345-1353.

Способ получения сорбента включает обработку фуллерена органическим растворителем, смешивание полученного состава с пористыми гранулами, удаление растворителя, промывку и сушку сорбента. Новым является обработка фуллерена органическим растворителем, химически инертным по отношению к фуллерену и материалу гранул. Сорбент включает пористую гранулу из органического или неорганического материала, содержащую на поверхности фуллерен. Новым является нанесение на поверхность гранулы конденсированного из раствора немодифицированного фуллерена. Сорбент имеет повышенную специфическую емкость в области высоких концентраций липопротеидов низкой плотности. 2 с. и 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл.

1. Сорбент для удаления атерогенных липопротеидов из крови, включающий пористую гранулу из органического или неорганического материала, содержащую на поверхности фуллерен, отличающийся тем, что на поверхность нанесен конденсированный из раствора немодифицированный фуллерен. 2. Способ получения сорбента для удаления атерогенных липопротеидов из крови, включающий обработку фуллерена органическим растворителем, смешивание полученного состава с пористыми гранулами из органического и неорганического материала, удаление растворителя, последующую промывку и сушку полученного сорбента, отличающийся тем, что обработку фуллерена ведут путем растворения в органическом растворителе, химически инертным к фуллерену и материалу гранул. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что промывку ведут последовательно этиловым спиртом и дистиллированной водой. 4. Способ по п.2, отличающийся тем, что сушку сорбента с гранулами ведут при температуре 30 - 120^oС.