СОРБЕНТ ДЛЯ УДАЛЕНИЯ АТЕРОГЕННЫХ ЛИПОПРОТЕИДОВ ИЗ КРОВИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 1998 года по МПК B01J20/00 C12P19/04 G01N30/48 

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано в клинической практике в качестве сорбционного препарата при различных нарушениях липидного и липопротеидного обмена.

Одной из наиболее тяжелых форм дислипопротеидемий является семейная или наследственная гиперхолестеринемия, приводящая в конечном итоге к тяжелым атеросклеротическим поражениям сердечно-сосудистой системы [1].

Основной причиной развития различных форм гиперхолестеринемии (гетеро- и гомозиготной) считают нарушение функциональной активности, уменьшение либо полное отсутствие на клеточных мембранах соответствующих рецепторов к липопротеидам низкой плотности (ЛПНП) [2,3]. Помимо ЛПНП атерогенными считаются ЛПНОП и ЛП (а) [1]. Кроме лиц, страдающих семейной гиперхолестеринемией, снижение уровня ЛПНП необходимо у больных с хронической почечной недостаточностью и у пациентов с тяжелыми формами ишемической болезни сердца [1,4].

На сегодняшний момент существующие методы снижения повышенных концентраций атерогенных липопротеидов в плазме крови больных либо недостаточно эффективны, либо чрезвычайно дороги. Наряду с медикаментозными способами воздействия и диетой в последние годы интенсивно развиваются методы эфферентной терапии для лечения гиперхолестеринемий. К ним можно отнести плазмаферез [5] , каскадную плазмофильтрацию [6], преципитацию ЛПНП гепарином [9].

Особый интерес представляют сорбционные технологии, которые позволяют, используя метод плазмосорбции, избирательно удалять на колонках специфические субстанции, имеющие непосредственное отношение к развитию патологического процесса, оставляя в неприкосновенности некомплементарные сорбенту молекулы. Наиболее широкое распространение в клинической практике получили методы плазмосорбции ЛПНП с использованием колонок с гепарин-сефарозой [7] и декстран-сульфатом [8].Однако наиболее часто используемый для плазмосорбции препарат гепарин-сефароза обладает рядом недостатков. Наряду с атерогенными липопротеидами гепарин-сефароза элиминирует из плазмы липопротеиды высокой плотности (ЛПВП), в частности субфракции апоЕ-ЛПВП, которые обладают антиатерогенными свойствами, а также удаляют печеночную триглицеридлипазу и белки системы свертывания крови [11].

Наиболее близким по сущности к предлагаемому изобретению является иммуносорбент, созданный на основе сефарозной матрицы и ковалентно связанных с ней поли- или моноклональных антител, полученных к апобелку (а) [12]. Его применение в клинике у больных с антиографически подтвержденным атеросклерозом коронарных сосудов, имеющих повышенный уровень ЛП (а), дало положительные результаты. Очевидно что сам принцип терапии, основанный на элиминации атерогенных липопротеидов в экстракорпоральном контуре кровообращения, является весьма перспективным при лечении различных заболеваний липидного и липопротеидного обмена у человека и требует создания высокоэффективных селективных биосовместимых гемосорбентов. Однако этот сорбент обладает сравнительно невысокой специфической емкостью (1,5± 0,2 мг на 1 мл геля). Также следует указать на многостадийность и значительную трудоемкость получения препарата, что неизбежно ведет к его высокой стоимости.

Наиболее близким по сущности к предлагаемому способу получения препарата является способ получения сефадексов с использованием в реакции поперечно-сшивающих агентов типа эпихлоргидрина, согласно которому исходный материал обрабатывают поперечно-сшивающим агентом до перехода в гелеобразное состояние [13].

Изобретение направлено на создание препарата для сорбционных методов лечения заболеваний, вызванных повышенной концентрацией атерогенных липопротеидов, и способа его получения, при этом обеспечены необходимые для плазмосорбции дренажные свойства сорбента, специфичность и значительная удельная емкость к атерогенным липопротеидам. Сорбент не обладает сродством к ЛПВП, прост в изготовлении, легко стерилизуется без изменения специфических характеристик.

Суть изобретения сводится к следующему. Сорбент для удаления атерогенных липопротеидов выполнен на основе гранулированного поперечно-сшитого разветвленного полисахарида микробного происхождения, например, аубазидана, продуцируемого дрожжеподобным грибом Aureobasidium pullulans - штамм депонирован в коллекции НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, г. Москва, коллекционный номер ВКПМ F-448, 16 апреля 1990 г.

Способ получения сорбента для удаления атерогенных липопротеидов основан на классическом способе получения сефадексов путем использования в реакции поперечно-сшивающих агентов типа эпихлоргидрина. Исходный материал - разветвленный полисахарид микробного происхождения обрабатывают поперечно-сшивающим агентом до его перехода в гелеобразное состояние. Полученный гель обрабатывают дистиллированной водой или органическим растворителем для получения препаратов с определенными адсорбционными свойствами. Как показали исследования, выполненные авторами, обработку геля можно проводить протонными, апротонными полярными и неполярными растворителями, причем количество растворителя и продолжительность обработки геля не влияют на достигаемый результат. Полученный сорбент обладает достаточной жесткостью и хорошими дренажными свойствами не только для плазмы, но и для форменных элементов крови.

В таблице представлены результаты стендовых испытаний, характеризующие влияние сорбентов на некоторые биохимические показатели сыворотки крови. Анализ результатов исследования показал, что предложенные сорбенты, полученные путем обработки поперечно-сшитого аубазидана различными органическими растворителями, обладают неспецифической сорбционной активностью для ряда макромолекул сыворотки, что характерно для сорбентов любого происхождения. Обращает на себя внимание практически полное отсутствие сорбционной активности препаратов на низкомолекулярные соединения (биллирубин, мочевина). Отмечается тенденция к неспецифическому связыванию белков плазмы, которая выражена приблизительно одинаково на всех сорбентах независимо от растворителя, использованного для обработки геля аубазидана. Анализ липопротеидов в пробах до и после прохождения сыворотки крови через сорбенты обнаружил достоверное (p<0,05) снижение концентрации β -липопротеидов, определяемых по методу Бурштейна и Самай (10) и представляющих собой суммарную фракцию ЛПНП и ЛПОНП в постперфузионных образцах сыворотки. Наиболее выраженные изменения наблюдали на сорбентах, прошедших обработку этанолом и 1,4- диоксаном. Обнаружение этого факта заставило провести более подробные исследования, касающиеся специфики взаимодействия созданных сорбентов с липопротеидами сыворотки крови человека.

В предварительных стендовых экспериментах наибольшее специфическое связывание β - липопротеидов обнаружено на сорбенте, обработанном диоксаном (ДиоГАП). Поэтому все дальнейшие исследования проводили на этом препарате. Работа выполнена в лаборатории биохимии ИЭМ РАМН (руководитель лаборатории академик РАМН А.Н.Климов).

В экспериментах в качестве объекта перфузии использовали плазму больных наследственной гиперхолестеринемией, чистые фракции липопротеидов, выделенные методом дифференциального ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте плотности NaBr [14] , а также плазму больных, свободную от липопротеидов. Процедуру сорбции- элюции проводили в колоночном варианте и batch -методом. В качестве элюирующих растворов использовали 0,1%-ный раствор SDS и 0,01М раствор Na₂CO₃.

На фиг. 1 изображена специфическая емкость сорбента ДиоГАП для ЛПНП; на фиг. 2 - неспецифическая сорбционная емкость ДиоГАП для белков плазмы, истощенной от ЛПНП; на фиг. 3 - истинная специфическая сорбционная емкость ДиоГАП при плазмосорбции цельной плазмы больных.

1. Специфическая емкость сорбента ДиоГАП для ЛПНП (фиг. 1). К сорбенту (1мл) в 0,15М NaCl и 0,005М трис-HCI добавляли различное количество ЛПНП (по белку). Через 1 ч гель промывали стартовым буфером, связанные липопротеиды элюировали 0,1% р-р SDS, количество липопротеидного белка определяли по Лоури.

Вывод: максимальная специфическая емкость сорбента ДиоГАП составляет 3,0 мг ЛПНП на 1 мл геля.

2. Неспецифическая сорбционная емкость ДиоГАП для белков плазмы, истощенной от ЛПНП (фиг.2).

К сорбенту добавляли плазму крови больных, из которой методом ультрацентрифугирования удаляли все классы липопротеидов.

Вывод: неспецифическая емкость сорбента ДиоГАП для белков плазмы составляет 1,2 мг на 1 мл геля.

3. Истинная специфическая сорбционная емкость ДиоГАП при плазмосорбции цельной плазмы больных (фиг. 3).

К сорбенту добавляли плазму крови больных. Связавшиеся с ним липопротеиды определяли нефелометрически в реакции с антителами к апо В.

Выводы: 1. Специфическая сорбционная емкость ДиоГАП для ЛПНП при использовании в качестве перфузируемого материала цельной плазмы больных семейной гиперхолестеринемией составляет 2,2 мг на 1 мл геля.

2. В процессе плазмосорбции фракция ЛПВП практически не связывается с препаратом и не удаляется из плазмы (0,12 мг на 1 мл геля).

Таким образом, предлагается совершенно новый тип сорбента, который можно успешно использовать при нарушениях липидного и липопротеидного обмена у больных.

Способ получения сорбента иллюстрируется следующими примерами.

Аубазидан растворяли в 1 М NaOH до концентрации 5%. 3атем к раствору полисахарида добавляли сшивающий агент из расчета 1:2 (аубазидан по сухому весу к массе эпихлоргидрина) и, постоянно перемешивая, инкубировали при t = 40±1,0^oC до перехода раствора в гелеобразное состояние. После образования геля его переносили либо в дистиллированную воду (1 часть геля и 100 частей воды), либо в различные органические растворители :
диметилсульфоксид (ДМCO) (1 ч. геля и 100 ч. растворителя:
н-бутанол (1:500);
этанол (1:500);
диметилформамид (ДМФА) (1:100);
1,4 - диоксан (1:500).

Гели выдерживали в растворителях в течение суток. Отмытые от органических растворителей гели продавливали через сита с определенным диаметром ячеек для получения гранул размером 0,5- 1,0 мм. Мелкие частицы удаляли декантацией.

Сорбент обладает хорошими дренажными свойствами, специфичностью и наибольшей удельной емкостью к ЛПНП из известных в практике аналогов, не обладает сродством к ЛПВП. Препарат прост в изготовлении, легко стерилизуется без изменения специфических характеристик, дешев в производстве, что позволит после соответствующих испытаний предложить для клинической практики сорбент однократного использования.

Сорбент, обладающий необходимыми для плазмосорбции дренажными свойствами, а также специфичностью и значительной емкостью а атерогенным липопротеидам, не обладает сродством к ЛПВП, прост в изготовлении. Сорбент выполнен на основе гранулированного поперечно-сшитого разветвленного полисахарида микробного происхождения. Способ получения сорбента основан на способе получения сефадексов. Исходный материал - разветвленный полисахарид микробного происхождения обрабатывают поперечно-сшивающим агентом до его перехода в гелеобразное состояние, а полученный гель обрабатывают дистиллированной водой или органическим растворителем. 2 с.п.ф-лы, 1 табл., 3 ил.

1. Сорбент для удаления атерогенных липопротеидов из крови на основе поперечно-сшитого гранулированного полисахарида, отличающийся тем, что в качестве основы он содержит разветвленный полисахарид микробного происхождения - аубазидан, продуцируемый дрожжеподобным грибом Aureobasidium pullulans, ВКПМF-448. 2. Способ получения сорбента для удаления атерогенных липопротеидов из крови путем обработки исходного материала поперечно-сшивающим агентом до перехода в гелеобразное состояние с последующим формированием гранул, отличающийся тем, что в качестве исходного материала используют разветвленный полисахарид микробного происхождения - аубазидан, продуцируемый дрожжеподобным грибом Aureobasidium pullulans, ВКПМF-448, в качестве сшивающего агента - эпихлоргидрин, а полученный гель обрабатывают дистиллированной водой или органическим растворителем.