Штамм гриба CLaVIcepS pURpURea-продуцент пептидных эргоалкалоидов Советский патент 1990 года по МПК C12N1/14 C12P33/20 

t

Изобретение откосится к микройио - логической прокышленкостЕ и предстан- лйет собой гатамм спорыньи продуцирующий фармакологически цен1-а,е пеп- тидные эргоалкалоиды в сапрофитных условиях при глубинной ферментации.

Целью изобретения является С lav leaps purpurea, обладающий зысо-- кой продуктивностью,

„ Штам гриба Clavlceps pu.rpurea К-41 получен путем облучения, Уф--яу- чами суспензии спор спорьшьи С(5. ржи с последующей селекцией па агаризо- ванньш питательньш средах,.

Штамм гриба Clavlceps purpursa

депонирован в коллекции л. йь- тур М1исроо гаш-.31чов Всесоюзного наукно-исследовательского- института антибиотиков и i-шеет. рех истраци- oHHbift номер .

Штамм Clavlceps purpurea ВНИИА характеризуется следующш-чи нризнакамк.

Морфолого-культуральяьш признаки, При выращршании. на агаризованной среде Т2 (состав среды, в г/лх. сахароза 100, дрожжевой экстракт .0,55 аспарагин 10 КН„Р04 G ,,25, KCI QJ2, HgS0. 0,25/СаШ 1, peSO -7Н : 0502, ZnSO THjO 0,015, агар 20 дистиллированная вода - ЮСО см, рН 5д2) зш етньй рост mi atft-ia лрояв-- пяётся на сутки, Образзпощиеся колош-ш вначале светлые;, прозрачкывл впоследствии .приобретают 6ypo-Kopw4 -. йёзую окраску, 2-3-недельтле в-оло- яки имеют складчат по крупиячатую мас сув края четко охт-аьжченЫс, ральеф ко- куса, иногда усеченного, i кокцу выращив-ания размер колонк; от О,-.8 см ДО 1 ,5 CMg цвет буро-коричмевьй:; обратная сторона колоний бехш.Бого цвета. Штамм растет в виде мидели- альнь1х клеток округлых диаметром 3050 мкм5 .сильно гран:улированных. Конидий в указанных условияк не-обра- .аует е Колонии этого штамма легко от-- деляются от агаровой среды н при. переносе в жидкук среду распадаются на отдельные клетки шш небольшие агре-- гаты их,При росте в жидкик средах штамм вьщелдаот в среду пш мент g среда окрашивается в бурый и светлсз.коричиевьй щзеТ; иногда почти до черного о

Физиологические признаки. Штамм: . кулычшируют в аэробных условиях в

погруженной культуре в жидклш ере-

2011 .дак, содержащих в качестве источни ка углерода преим чцественно сахарозу, глюкозу, макнит, глицерин, орга- нические кисд-оты - лимонную или янтарную кислоту, В качестве источниг ка азота может бьп ь аммиак аспара- Sин, дрожжевой экстракт или аммонийная соль, в качестве минеральных лей могут быть использованы хлориды нитраты, фосфаты, соли магния, железа и цинка.

Итамм отличается стабильной хорошо воспроизводи1 1ой продуктивнойтью

IS ы может быть сохранен культивирования на средах или глубоким замо раживанием в жидком азоте.

Культуру вырапшвагат на чашках Кетрн или в колбах на кача.тсах со

20 скоростью вращения 180-240 об/мин при 20-30 с., период культивирования от 4 до 20 дней. Штамм выращивают на. средах при рН 3,,0-5 s5 . В. период .интенсивного синтеза алкалоидов рК

2В среды колеблется от 3,12 до 6,2 в зависимости от состава использованных сред, Культ5-ширование можно прот водить одно, двух- и трехступенчато с Наиболее благоприятным являетйО ся использование соотношения иноку- гаома и среды от 1:5 до 1:20

Пример 1, Штамм грнба С lair Iceps purpurea ВНИИА К 312-А выра- в течение 9 дней на агаризоgg ванной питательной среде T2s Затем колонии 1 омогенизируют и переносят Б. колбы Эрле1-гмейера объемом 500 см , содержащих 50 см питательной среды Тд следующего составаj г/л5 Глюкоза

40 ШО, лг-шонная кислота 10, KHgP04

OjS,, Ид504- Н,0 0,3, дрожжевой экстракт 0,1 .РеЗОл Н О 0,007,

ZnSO,

О J 006 5 дистиллированная

качалках температуре 24 С в Те

рода 1000 см .J рН до 5з2 ai-гмиаком,.

Культуру выращивают на в темноте при

чение б дней,, 5 -t-m пол гченной культуры инокулир ют в колбы такого же объема с 50 см среды Т25 следугоDtero состава,, г/л, сахароза 300$ ..шкоккая кислота 15, О-З. 0,25, дрожжевой экстракт Оj КС 1 0,12, FeS047Н 0 ()s007j ZnSO 7Н,,0 0,006, дисткплированная вода 1000 ск, рИ - до 5,2.амина к ом„ Куль тив ироБ ание тфоводяг в течение 8 дней.

Сод : ржание суг-мы пепт адньк эрго- ;шкаловдов в мицехши и культуральной жидкости определяют по методу Румпеля.

Для определения алкалоидов куль- туральную жидкость отделяют от мице лиальной массы фильтрованием. Куль- туральную жидкость отделяют, измеряют объем, а мицелий дважды промывают дистиллированной водой по 0 м 0,3 г сырого отфильтрованного мицелия растирают в фарфоровой ступке с небольшим количеством песка и добавляют 2 мл 4%-ного раствора винной кислоты в 50% метаноле. Полученную массу переносят в коническую центрифужную пробирку. Экстракцию Проводят на водяной бане при температуре 50-60 С в течение 3 мин при перемешивании. К горячему виннокислртному извлечению добавляют 2 мл 10%-ный раствор уксуснокислого цинка, мешивают и отстаивают в течение 10 мин. Затем центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин. К 1 мл прлученной надосадочной жидкости добавляют 2 мл реактива Ван-Урка (раствор парадиметиЛаминобензальде- гида в 60%-ного растворе серной кислоты) и оставляют на свету. Чере 30 мин растворы, окрашенные в сине- фиолетовый цвет, колориметрируют на ФЭК-М с зеленьм светофильтром (длина волны 540 нм) в кювете с толщиной слоя 10 мм. Содержание алкалоидов рассчитьюают- по калибровоч - ной кривой, построенной по зргота- мину-тартрату. Содержание алкалоидов в процентах (Х) рассчитьшают по формуле:

., а.4.100.100

о зПТоб-ь)

где а - количество эргоалкалоидов

в i мл раствора, г, найденное по калибровочному графику;. b - влага, %,

Для определения содержа1Л1я эргоалкалоидов в культуральной жид- кости (КЖ) к 2 мл КЖ добавляют 4 мл реактива Ван-Урка, перемешивают, оставляют на свету и через 20 мин . . колориметрируют на ФЭК. Количество эргоалкалоидов (Х) в КЖ рассчитывают по формуле

X а.1000-100 мг %,

,

342011

где а - кол1-гчество эргоалкалоидов в I мл КЖ, г, найденное по калибровочному, графику. Общую алкалоидную продуктивность подсчитывают как сумму алкалоидов, найденных в КЖ и мицелии. Для идентификации алкалоидов проводят вы-: деление суммы алкалоидов из КЖ-и 10 мицелия. КЖ и мицелш подщелачивают до рН 9-10, экстрагируют хлористым метиленом, затем 2%-ным водньп-i раствором кислоты. Биннокислотное извлечение подп елачивают до рН 9 и вновь . 15 экстрагируют хлористьгм метиленом. Xлopиctoмeтилёнoвый экстракт сгущают и добавляют гексан для осаждения алкалоидов. Полученную порош- кообуазную сумму алкалоидов сушат 20 в вакууме.. Пепт -1дные эргоалкалоиды в вьщеленной сукше подтверждают ме- |тодами тонкослойной хроматографии с разными сорбентами в разнътх системах , растворителей в сравнении с досто- 25 верными образцами эргоалкалоидов пептидного типа (группы эрготамина и эрготоксина), методом жидкостной хроматографии и установлением аминокислотного состава пептидной части 30- молекулы после кислотного гвдролиза.

Таким образом, проведенная проверка показала, что Ciaviceps purpurea ВНИЙА № 3I2-A продуцирует j- пептидные эргоалкалоиды, при этом продуктивность его в процессе ферментации составляет на 8 сутки куль- тивирования 1657 /мл.

40 11ример2. Культуру выращивают на агаризованной среде Т2 и в среде Тд аналогично примеру I. 5 мл инокульной массы засевают кол- бы 50 см среды 668 следующего сос.

45 тава, г/л: сахароза 60, глицерин 60, глюкоза 80, дрожжевой экстракт 0,1, лимонная кислота 15, КС1 0,125, КНгРО 0,5, 0,5, x7H,b 0,007, ZnSO. -0,006, дне5Q тиллированная вода - 1000 см , рН до 5,2 аммиаком. Через 10 дней выращивания штамм продуцирует 1701 у/ /мл суммы эргоалкалоидов.

55 П р и м е р 3. Колонии с агаризо- ванной среды Т2, выращенные 21 день, гомогенизируют, засевают колбы Эр- ленмейера с 50 см среды Тд и выращивают в тех же условиях, что и в

513420П

примере 2, 5 мл инокульной массы зй Формула изобретения севают колбы с 50 см среды 668,

Через II дней культивирования штамм Штамм гриба Clavlceps purpurea продуцирует 2315 у/нп суммы эргоап-. ВНИИА W - продуцент пептидных калондов.,эргоалкалоидов.