НАБОР ДЛЯ ФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/52 C12Q1/00 

Изобретение относится к ферментному анализу и может быть использовано для определения важнейших метаболитов (М) и биологически активных веществ (БАВ), например таких как глюкоза (диагностика и лечение сахарного диабета), холестерин (диагностика атеросклероза, мочекаменной болезни, ряда инфекционных заболеваний), этанола (криминалистика, контроль технологических процессов в микробиологической и пищевой промышленности) и других являющихся субстратами для соответствующих ферментов.

Серийные анализы таких М и БАВ, как правило, выполняются с использованием наборов готовых форм реагентов (диагностикумов), содержащих все необходимые компоненты для проведения анализа конкретного вещества, что обеспечивает быстроту и стандартизацию исследований.

При изготовлении наборов реагентов для серийных клинико-диагностических исследований используют химреактивы и биопрепараты в виде как растворов, так и твердых сухих (твердых) форм. Сухие формы реагентов предпочтительнее при реализации методик, основанных на применении ферментов, поскольку лиофильно высушенные препараты ферментов сохраняют свою активность дольше, чем те же препараты в растворах. Дополнительным преимуществом изготовления наборов на основе сухих форм является небольшой вес готовых форм реактивов.

В качестве прототипа могут быть выбраны наборы разных фирм, в частности фирмы KONE (Финляндия), ТЕСО (США), LABSYSTEMS (Финляндия).

Данные наборы представляют собой герметично закрытые флаконы, содержащие в качестве обязательных компонентов смесь (смеси) сухих веществ (в порошкообразном виде), а именно ферменты, индикаторные субстраты и буферные вещества [1.2]. (В качестве прототипа указан один из перечисленных наборов).

В качестве буферных веществ наборы содержат K/Na фосфаты. Схему применения ферментов при определении М или БАВ, являющихся соответствующими субстратами, можно изобразить в виде следующей последовательности реакций:

Концентрация окрашенных соединений пропорциональна концентрации субстрата, окисленного соответствующим ферментом (оксидазой), поэтому измерение оптической плотности реакционных смесей при длинах волн, соответствующих максимуму поглощения света образующимися окрашенными соединениями, обеспечивает определение концентрации М и (или) БАВ.

В частности, например, для определени глюкозы используют следующие сухие формы: в качестве ферментов - глюкозооксидазу и пероксидазу, в качестве индикаторного субстрата для пероксидазы-4-аминоантипирин и п-гидроксибензолсульфонат Na; в качестве буферной смеси - фосфаты K/Na [1].

Для определения холестерина используют те же вещества в расчетных количествах, кроме того, что вместо глюкозооксидазы диагностикум содержит смесь холестериноксидазы и холестеринэхстеразы [2].

Все известные ферментные наборы с сухими компонентами содержат в качестве буферного вещества K/Na фосфатный буфер, а если для цветовой реакции используют пероксидазу, то в качестве индикаторного субстрата используют 4-аминоантипирин и п-гидроксибензосульфонат Na.

Использование в ферментных наборах в качестве буферных систем K/Na солей ортофосфорной кислоты обусловлено их способностью поддерживать pH в области 5,8-8,0, соответствующей оптимуму стабильности и активности большинства ферментов.

Способ изготовления наборов для ферментного анализа включает высушивание, смешивание и гомогенизацию основных функциональных компонентов (ферментов, индикаторных субстратов и буферных веществ, находящихся в виде твердых форм) [1]. Затем эти компоненты расфасовывают по флаконам; флаконы вакуумируют или заполняют инертным газом и далее герметично укупоривают.

Все известные способы и наборы, основанные на использовании твердых форм реагентов, в том числе принятый для сравнения прототип, обнаруживают ряд существенных недостатков, проявляющих себя при организации серийного производства:
- требуется специальное, окупаемое только при больших объемах производства, автоматизированное оборудование для расфасовки сыпучих реагентов по флаконам, с дальнейшей их деаэрацией и укупоркой,
- флаконы с сухими порошкообразными реагентами имеют значительный объем и вес, что задает объем транспортной тары и создает сложности при их хранении, требующем термостатируемых условий и пониженной температуры;
- высокая удельная площадь поверхности порошкообразных реагентов ограничивает стабильность компонентов наборов;
- высушивание K/Na фосфатных буферных компонентов наборов требует высокой температуры и осуществляется под вакуумом, что проводит у усложнению технологической схемы, ее аппаратной реализации и, следовательно, увеличивает стоимость конечного продукта.

Предлагаемый способ и набор призваны устранить указанные недостатки.

Цель достигается тем, что набор для ферментного анализа, включающий основные функциональные компоненты в твердой форме: ферменты, индикаторный субстрат и буферные вещества, в качестве буферных веществ содержит аммонийные соли ортофосфорной кислоты.

Цель достигается тем, что основные функциональные компоненты диагностикума находятся в таблетированной форме, в том числе могут находится в составе одной таблетки (однореагентный набор).

Если в качестве хромогенообразователя набор содержит фермент пероксидазу, то предлагается использовать в качестве одной из компонент индикаторного субстрата 8-оксихинолин или его производные, в частности, 8-оксихинолин-сульфонат.

Для осуществления цели изобретения предлагается также новый способ изготовления (получения) набора для ферментного анализа, включающего в твердом виде основные функциональные компоненты: ферменты, индикаторный субстрат и буферные вещества, отличающийся тем, что готовые формы функциональных компонентов набора получают таблетированием, при котором в качестве наполнителя используют аммонийные соли ортофосфорной кислоты, содержащиеся в составе набора в качестве буферных веществ.

На сегодняшний день нет сведений об использовании совокупности этих взаимосвязанных признаков в каких-либо готовых изделиях либо в сообщениях научного или патентного характера, т.е. авторы не располагают све6дениями об использовании аммоний-фосфатов в качестве буферных компонентов в ферментных наборах; о таблетировании реагентов ферментных наборов с целью повышения их стабильности, оптимизации технологии упаковки, транспортирования и хранения; об использовании 8-оксихинолина или его производных в составе субстрата хромогенобразующего фермента.

Изобретение было разработано в процессе решения задачи по созданию технологии таблетирования сухих форм реагентов в ферментных наборах. В ходе соответствующих исследований было установлено, что основным препятствием при решении задачи являются физико-химические свойства веществ, используемых как составляющие компоненты реагентов набора; в частности буфера, а если в наборе используется пероксидаза, то физико-химические свойства компонентов, входящих в состав ее индикаторного субстрата.

Как известно, приготовление K/Na-фосфатной буферной смеси включает смешение гидратированных K/Na-солей, при этом происходит выделение воды. В ходе исследования было установлено, что характер взаимодействия молекул воды с K/Na фосфатами с одной стороны затрудняет высушивание содержащего эти соли буфера, с другой - осложняет процесс таблетирования, а именно высокое давление при прессовании приводит к высвобождению гидратированных молекул воды и, как следствие, намоканию и инактивации общей композиционный смеси.

Также было установлено, что наличие в составе индикаторно-субстратной смеси п-гидроксибензосульфоната в количествах, необходимых для проведения индикативной реакции в разумное время, приводит к недопустимо низкой прочности таблеток.

Была проведена работа по изысканию веществ, которые могли бы функциально заменить эти компоненты и обладали бы необходимыми физико-химических свойствами.

Как оказалось, аммоний-ортофосфатный буфер дает необходимый интервал pH, одно- и двузамещенный ортофосфаты аммония, не выделяет воду при смешивании и таблетировании, легко высушивается при комнатной температуре на воздухе.

Кроме того, было установлено, что аммоний-фосфатные композиции не обладают абразивными свойствами, что позволяет использовать их в качестве основного наполнителя таблетированных форм сухих реагентов диагностических наборов. При этом для таблетирования применяют стандартное оборудование и стандартные режимы работы, обеспечивающие полное сохранение функциональных свойств реагентов.

Для наборов, в которых в качестве хромогенобразователя используется фермент пероксидаза, было установлено, что вместо известного компонента индикаторного субстрата может быть использован 8-оксихинолин или его производные, например, 8-оксихинолин-сульфонат, которые обладают высоким средством к пероксидазе. Это позволяет использовать их в количествах, в которых эти соединения мало влияют на физико-химические свойства содержащих их композиционных смесей, что обеспечивает возможность их таблетирования. В процессе оптимизации составав композиционных смесей компонентов набора, имея в виду их дальнейшее таблетирование, а также согласования технологических возможностей оборудования с предлагаемыми весовыми и геометрическими характеристиками таблетированных компонентов, была обнаружена возможность сосуществования всех указанных основных компонентов в одной таблетке, т.е. стало возможным созданием набора, содержащего один реагент в виде одной таблетки.

Таким образом, выявленные закономерности позволяют как усовершенствовать известные способы получения порошкообразных ферментных наборов, предлагая альтернативные варианты композиций буфера и хромоген-субстратного компонента, новую перспективную форму этих наборов - реагенты в таблетированном виде, так и создать новый способ их получения.

Производные по предлагаемой технологии наборы представляют собой один или несколько типов таблеток, которые могут содержать смесь химически не взаимодействующих друг с другом веществ. Таблетированные реагенты упаковывают в многослойные ленточные материалы, обеспечивающие влаго-, а при необходимости, и светонепроницаемость типа БП(бумага-полиэтилен) или БФП(бумага-фольга-полиэтилен), или в другие аналогичные по функциональным свойствам упаковочные материалы.

Таблетированные формы реагентов компактны, для их получения и упаковки может быть использовано стандартное автоматизированное оборудование, применяющееся в фармацевтической промышленности, в том числе и для производства опытно-лабораторных серий. Это значительно упрощает и удешевляет процесс изготовления наборов. Упаковочный материал имеет минимальный вес и обеспечивает высокую степень сохранности реагентов в условиях транспортировки и хранения. Дополнительное преимущество таблетированных форм реагентов - более высокая стабильность по сравнению с порошкообразными, являющаяся следствием их значительно меньшей удельной площади поверхности реагирования с внешней средой.

Пример 1. Набор для ферментного анализа глюкозы и способ его получения (на 100 анализов).

Вариант I. Набор содержит, мг: сухая буферно-субстратная смесь 700-900 на 1 набор; сухая ферментная смесь 300-500 на 1 набор.

Способ получения набора заключается в высушивании, в том числе лиофилизации, смешивании и гомогенизации компонентов набора, указанных выше.

Получение буферно-субстратной смеси. Навески 170-210 мг аммония-ортофосфата однозамещенного (АФ-1) и 340-420 мг аммония-ортофосфата двузамещенного (АФ-2) сушат при комнатной температуре и нормальном атмосферном давлении в течение суток. Навески 90-220 мг 4-аминоантипирина (4-ААП), 45-120 мг 8-оксихинолина (8-ОХ) и 55-90 мг K/Na-хлористого тщательно перемешивают и добавляют к навескам аммоний-ортофосфатные соли. Полученную смесь тщательно гомогенизируют.

Получение ферментной смеси. Навеску глюкозооксидазы, соответствующую 3000-5000 ед. активности, и навеску пероксидазы, соответсвующую 1000-2000 ед. активности, растворяют в 200 мл 0,2 М аммоний-ортофосфатного буфера, pH7,0±0,2. Полученный раствор лиофилизируют.

К лиофилизированной смеси ферментов добавляют 10-15 мг MnSO₄, 200 мг аммоний-ортофосфатного буфера и K/Na-хлористый до общего конечного веса смеси 300-500 мг. Полученную смесь тщательно гомогенизируют.

Вариант II. Набор содержит таблетированную буферно-субстратную смесь (см. вариант I) - 2 таблетки на I набор; таблетированную ферментную смесь (см.вариант I) - 1таблетку на 1 набор.

Способ получения набора заключается в высушивании, в том числе лиофилизации, смешивании и гомогенизации компонентов набора, как это указано в варианте I с последующим таблетированием полученных буферно-субстратной и ферментной смесей. Таблетирование осуществляют на таблетирующем прессе РТМ-12 при давлении и скорости таблетирования в пределах рабочих технических характеристик этого оборудования.

Предварительно проводят пробное таблетирование; при отклонении веса таблеток в пределах 5% от расчетного приступают к таблетированию. Контроль веса таблеток и их прочности на разлом проверяют через каждые 10 мин.

Вариант III. Набор содержит таблетированную буферно-субстратно-ферментную смесь - 2 таблетки на 1 набор;
Способ получения набора заключается в высушивании, в том числе лиофилизации, смешивании и гомогенизации компонентов набора.

Навеску глюкозооксидазы, соответствующую 3000 - 5000 ед. активности, и навеску пероксидазы, соответствующую 1000 - 2000 ед. активности, растворяют в 200 мл 0,2 М аммоний-ортофосфатного буфера, (pH 7,0 ± 0,2). Полученный раствор лиофилизируют.

2. К лиофилизированной смеси ферментов добавляют 10 - 15 мг MnSO₄, 90 - 120 мг 4-ААП, 45 - 60 мг 8-ОХ, 10 - 25 мг 8-оксихинолин-сульфоната (8-ОХС), 100 - 200 мг АФ-1 и 200 - 400 мг АФ-2 и K/Na-хлористого до общего конечного веса смеси 500 - 900 мг. Полученную смесь гомогенизируют и таблетируют, как это указано во II варианте.

Пример 2. Испытание наборов по примеру I (варианты I-III) на контрольных лабораторных растворах глюкозы.

Готовят три контрольных лабораторных раствора глюкозы с концентрациями 2,0; 5,0 и 15,0 ммоль/л и калибровочный раствор глюкозы с концентрацией 10,0 ммоль/л.

Навески буферно-субстратной смеси и ферментной смеси для варианта 1, или две таблетки буферно-субстратной смеси и 1 таблетку ферментной смеси для варианта II, или две таблетки буферно-субстратно-ферментной смеси для варианта III растворяют в 200 мл дистиллированной воды для каждого варианта (рабочий раствор для каждого варианта соответственно). Берут 21 пробирку (4 ряда по 5 пробирок и 1 пробирка - холостая проба для каждого варианта соответственно). Во все пробирки добавляют по 2 мл соответствующего рабочего раствора. В первый ряд пробирок добавляют по 25 мкл контрольного лабораторного раствора глюкозы с концентрацией 2,0 ммоль/л, во второй ряд - по 25 мкл контрольного лабораторного раствора глюкозы с концентрацией 5,0 ммоль/л, в третий ряд - по 25 мкл контрольного лабораторного раствора глюкозы с концентрацией 15 ммоль/л, в четвертый ряд - по 25 мкл калибровочного раствора глюкозы. Все пробирки встряхивают и инкубируют при 18 - 25^oС в течение 10 мин, после чего опять встряхивают и инкубируют еще 15 мин. Измеряют оптическую плотность на спектрофотометре типа СФ при длине волны 500 нм против холостой пробы. Для каждого ряда рассчитывают среднее арифметическое значение оптической плотности и концентрацию глюкозы по формуле 1
C = X_л/X_к• ммоль/л
где X_л - среднее значение оптической плотности в определяемых пробах, ед.опт.пл.;
X_к - среднее значение оптической плотности в пробах с калибровочным раствором глюкозы, ед.опт.пл.;
10 - концентрация глюкозы в калибровочном растворе глюкозы, ммоль/л.

Отклонение значений концентраций в опытных пробах от теоретических величин рассчитывают по формуле 2
C = (C_k - C_л)/C_k•100
где C_л - расчетная концентрация глюкозы, ммоль/л;
C_к - измеренная концентрация глюкозы в пробах с контрольным лабораторным раствором, ммоль/л.

Результаты эксперимента приведены в табл. I.

Отклонение в значениях концентраций не превышает ошибки измерения по выбранному методу 5%.

Пример 3. Набор для ферментного анализа холестерина и способ его получения.

Набор содержит: сухая смесь аммоний-ортофосфатного буфера и субстрата 700 - 1100 мг на один набор; сухая смесь ферментов холестериноксидазы 10 - 20 ед. активности, холестеринэстеразы 20 - 40 ед. активности, пероксидазы 50 - 110 ед. активности на один набор, 250 - 350 мг.

Способ получения данного набора включает высушивание, смешивание и гомогенизацию двух указанных смесей реагентов, а именно получение смеси буфера и субстрата.

Навески 200 - 300 мг АФ-1, 400 - 600 мг АФ-2, 40 - 80 мг натрия холиевокислого, 10 - 20 мг 8-ОХС, 50 - 100 мг 4-ААП смешивают и тщательно гомогенизируют.

Получение ферментной смеси.

Навески холестериноксидазы 10 - 20 ед. активности, холестеринэстеразы 20 - 40 ед. активности, пероксидазы 50 - 100 ед. активности смешивают с 200 мг аммоний-ортофосфатного буфера и с K/Na-хлористым до общего веса компонентов 250 - 350 мг. Смесь гомогенизируют.

Пример 4. Испытания наборов по примеру 3 на контрольных лабораторных растворах холестерина.

Готовят три контрольных лабораторных раствора холестерина с концентрацией 1,0 : 3,0 и 10 ммоль/л и калибровочный раствор холестерина с концентрацией 5 ммоль/л.

Навеску буферно-субстратной смеси растворяют в 50 мл дистиллированной воды. Навеску ферментной смеси растворяют в 1 мл дистиллированной воды. Смешивают оба раствора - рабочий раствор. Берут 21 пробирку (4 ряда по 5 пробирок и 1 пробирка - холостая проба). Во все пробирки добавляют по 2 мл рабочего раствора. В одну пробирку добавляют 20 мкл дистиллированной воды - холостая проба. В первый ряд пробирок добавляют по 20 мкл контрольного лабораторного раствора холестерина с концентрацией 1,0 ммоль/л, во второй ряд - по 20 мкл контрольного лабораторного раствора холестерина с концентрацией 3,0 ммоль/л, в третий ряд - по 20 мкл контрольного лабораторного раствора холестерина с концентрацией 10,0 ммоль/л, в четвертый ряд - по 20 мкл калибровочного раствора холестерина. Все пробирки встряхивают и инкубируют 30 мин при температуре 37^oС. Измеряют оптическую плотность на спектрофотометре типа СФ при длине волны 500 нм против холостой пробы. Для каждого ряда рассчитывают концентрацию холестерина по формуле 1. Отклонение значений концентраций холестерина в опытных пробах от расчетных величин определяют по формуле 2.

Результаты эксперимента приведены в табл. 2.

Отклонение в значениях концентраций не превышает ошибки измерения по выбранному методу - 5%.

Список литературы
1. Каталог фирмы ТЕСО (США). Набор для определения глюкозы. Инструкция по применению.

2. Каталог фирмы ТЕСО (США). Набор для определения холестерина. Инструкция по применению.

Изобретение может быть использовано для определения важнейших метаболитов и биологически активных веществ с помощью ферментного анализа. Набор для ферментного анализа содержит в качестве основных функциональных компонентов твердые формы ферментов, индикаторного субстрата и буферных веществ. При этом в качестве буферных веществ указанный набор содержит аммонийные соли ортофосфорной кислоты. Набор может содержать перечисленные основные функциональные компоненты в таблетированной форме. При этом он может содержать основные функциональные компоненты в составе одной таблетки. В качестве индикаторного субстрата хромогенобразующего фермента пероксидазы указанный набор для ферментного анализа может содержать индикаторный субстрат, включающий 8-оксихинолин или его производные, например, 8-оксихинолинсульфонат. Для получения набора готовые твердые формы основных функциональных компонентов получают таблетированием, при котором в качестве наполнителя используют аммонийные соли ортофосфорной кислоты. Набор прост в хранении и использовании, способ его получения не требует специального дорогостоящего оборудования. 2 с. и 4 з.п.ф - лы, 2 табл.

1. Набор для ферментного анализа, содержащий в качестве основных функциональных компонентов твердые формы ферментов, индикаторного субстрата и буферных веществ, отличающийся тем, что в качестве буферных веществ он содержит аммонийные соли ортофосфорной кислоты. 2. Набор по п. 1, отличающийся тем, что он содержит основные функциональные компоненты в таблетированной форме. 3. Набор по п.2, отличающийся тем, что содержит основные функциональные компоненты в составе одной таблетки. 4. Набор по любому из пп. 1 - 3, отличающийся тем, что в составе индикаторного субстрата хромогенобразующего фермента пероксидазы он содержит 8-оксихинолин или его производные. 5. Набор по п.4, отличающийся тем, что в составе индикаторного субстрата он содержит 8-оксихинолинсульфонат. 6. Способ получения набора для ферментного анализа, содержащего в качестве основных функциональных компонентов твердые формы ферментов, индикаторного субстрата и буферных веществ, отличающийся тем, что готовые формы основных функциональных компонентов набора получают таблетированием, при котором в качестве наполнителя используют аммонийные соли, ортофосфорной кислоты, содержащиеся в составе набора в качестве буферных веществ.