СПОСОБ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины и найдет применение для выявления "скрытых" антител (АТ) при определении тяжести течения ВИЧ-инфекции.

За последнее время ВИЧ-инфекция приобрела характер пандемии. Это заболевание с тяжелыми последствиями в 100% случаев ведущими к летальному исходу. Лечению ВИЧ-инфекции уделяется большое внимание как у нас, так и за рубежом, особенно в капиталистических странах. Немаловажную роль в лечении этого заболевания играет своевременное выявление инфицированных лиц, т.к. на ранних стадиях этой инфекции возможно облегчение состояния больного. От своевременного прогнозирования тяжести течения данного заболевания зависит эффективность терапии, а также трудо- и жизнеспособность пациента. Поэтому вопросы прогнозирования тяжести течения ВИЧ-инфекции являются актуальными. Известно, что в ответ на внедрение вируса в организм человека вырабатываются антитела (АТ) к белкам ВИЧ. Эти специфические АТ могут быть "свободными" и "связанными". Последние получили название "скрытых" АТ, из-за трудности их выполнения т.к. они входят в состав циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) или же они заблокированы блокирующим фактором. Когда "скрытых" АТ много, тогда организм больного не может достаточно активно бороться с инфекцией.

Существующие способы выявления АТ к ВИЧ направлены на обнаружение только "свободных" АТ, а "скрытые" АТ из-за того, что они заблокированы, остаются нераспознанными. Выявление их позволит установить истинное содержание АТ в сыворотке крови и прогнозировать тяжесть течения заболевания. Кроме того, зачастую наличие "свободных" АТ в сыворотке крови больных невелико, что приводит к ложноотрицательным реакциям. Определение суммарного количества АТ (как "свободных", так и "скрытых") позволит повысить чувствительность существующего способа выявления АТ к ВИЧ, увеличить % выявляемости специфических антиВИЧ АТ, т.е. повысить порог надежности диагностики ВИЧ.

Проведенными исследованиями по научно-медицинской и патентной литературе выявлен ряд способов диагностики ВИЧ-инфекции.

Так в работе А.С. Новохатского с соавт. 1987 г. "Серодиагностика СПИД", ВИНИТИ, Вирусология, том 14, с. 57 - 62, указывается на диагностику ВИЧ инфекции с помощью иммуноферментных диагностикумов (метод ELIZA). Сущность этого способа заключается в последовательном нанесении на предварительно сорбированную специфическим антигеном (АГ)-белками ВИЧ плашку сыворотки больного, конъюгата, субстрата с последующим спектрофотометрическим учетом иммуноферментной реакции АГxАТ. Особенность этого способа заключается в специальном подборе сорбционных белков ВИЧ от которых зависит спектр выявленных специфических антиВИЧ АТ.

Преимущество этого способа заключается в его простоте, доступности в применении для массового скрининга, возможности использования отечественной аппаратуры, определении антиВИЧ АТ в малом количестве сыворотки (10 мкл), достаточно высокой специфичности и чувствительности.

Недостатки этого метода находятся в зависимости от спектра сорбционных белков, и как следствие этого возможные ложные результаты, а также невозможность выявления АТ находящихся в составе ЦИК или заблокированных блокирующим фактором, т.е. "скрытых" АТ.

В работе Петрова Р.В. с соавторами, 1992 г., "Развитие серодиагностики ВИЧ-инфекции" (ВИНИТИ, Вирусология, т. 30, с. 3 - 35) указывается на выявление АТ к ВИЧ методом тИФА (твердофазный иммуноферментный анализ). Сущность этого метода заключается в последовательном нанесении на предварительно сорбированную плашку сыворотки больного, конъюгата, субстрата с последующим спектрофотометрическим учетом реакции. Особенность заключается в спектре сорбционных белков.

Преимущества способа такие же как у предыдущего, однако спектр выявляемых специфических антиВИЧ АТ более широкий.

Недостатки способа заключаются в невозможности в 100% случаев выявлять специфические антиВИЧ АТ. Кроме того, как и предыдущий способ, этот способ имеет определенный % ложных реакций, что связано в ряде случаев с невозможностью выявления "скрытых" АТ, свидетельствующих об истинной реакции организма на вирус.

В нашей стране получили широкое распространение обнаружение АТ в сыворотке крови ВИЧ инфицированных.

Так патентом СССР N 1612264 G 01 N 33/53; 33/68; C 07 K 7/07, публикацию 1990 г. защищен "Способ твердофазного иммуноферментного определения антител (АТ) к вирусу иммунодефицита человека и меченный биотином синтетический пептид для его осуществления". Этот способ также основан на ИФА, однако в качестве сорбционного материала здесь используется синтетический пептид, а не белки "натурального" вируса ВИЧ.

Преимущества способа заключаются в безопасности для лабораторных сотрудников, возможность определения специфических антиВИЧ АТ широкого спектра, высокая чувствительность и специфичность.

Недостатки способа связаны с определенным % ложных результатов, а также невозможности определения истинного количества специфических антиВИЧ АТ из-за невыявляемости "скрытых" АТ, содержание которых имеет прогностическое значение.

Патентом СССР N 1597728, G 01 N 33/535, публикация 1990 г., защищен "Способ определения АТ к ВИЧ в крови". Этот способ является прототипом. Он основан на ИФА, заключающимся в специфическом связывании АТ сыворотки больного со специфическим АГ на поверхности полистироловой плашки. Для этого на дно полистироловых лунок с сорбированным АГ последовательно наносят сыворотку больного, конъюгат, субстрат с последующим спектрофотометрическим учетом оптической плотности (ОП) содержимого лунок. Сыворотка считается положительной (т.е. содержащей АТ к ВИЧ) при ОП сыворотки, превышающей ОП критическую.

Преимущества способа заключаются в определении специфических антиВИЧ АТ к определенным белкам вируса, простота, доступность, возможность использования отечественной аппаратуры, применения для массового скрининга, определении специфических антиВИЧ АТ в малом количестве сыворотки (10 мкл), достаточно высокая специфичность и чувствительность.

Недостатки способа определяются наличием некоторого количества ложных результатов в связи с тем, что выявляются только "свободные" АТ, титр которых может быть низким; а также невозможность определения "скрытых" АТ входящих в состав ЦИК или заблокированных блокирующим фактором.

Учитывая, что одним из недостатков прототипа, а также других рассмотренных способов выявления специфических антиВИЧ АТ является невозможность выявления "скрытых" АТ, в связи с чем невозможно определить истинное содержание антиВИЧ АТ к ВИЧ, что не позволяет с большей достоверностью прогнозировать тяжесть течения ВИЧ-инфекции, а также наличие некоторого количества ложноотрицательных результатов возникла необходимость в устранении этого недостатка.

Целью изобретения является прогнозирование тяжести течения заболевания.

Эта цель достигается путем вычисления коэффициента "скрытых" АТ к ВИЧ, для чего сыворотку больного разделяют на две фракции с помощью ионообменной хроматографии на QAE-A-50 сефадексе, затем определяют оптическую плотность (ОП) цельной сыворотки и двух фракций и по суммарному отношению ОП первой и второй фракций к ОП цельной сыворотки вычисляется коэффициент "скрытых" АТ.

Описание способа.

У пациента забирают кровь в количестве 3 - 5 мл из локтевой вены. Отстаивают 1-2 часа для отделения сыворотки.

Затем сыворотку разделяют на две фракции.

Для этого подготавливают колонку с фильтром и сжимающимся носиком. В колонку добавляют 1,0 сефадекса QAE-A-50 (1 г сухого сефадекса заливают 50 мл H₂O на 24 часа для набухания). Перед работой колонку промывают 1,0 фосфатного буфера (0,01 М, pH 7,0-7,3). Затем смесь сыворотки (0,2 мл) и фосфатного буфера (1,8 мл) по каплям пропускают через колонку с сефадексом. Жидкость из колонки собирают в сухую пробирку. Затем колонку промывают 1,0 фосфатного буфера. Промывную жидкость собирают в эту же пробирку - это и есть первая фракция в разведении 1:10. При получении первой фракции происходит разрушение ЦИК и устранение блокирующего фактора. Вторую фракцию получают путем "снятия" задерживающихся АТ на колонке с помощью 3 - 4 0,5 М раствора NaCl (1 часть 2 М раствора NaCl + 3 части фосфатного буфера) который также вводят по каплям в колонку. "Промывная" жидкость собирается в отдельную пробирку и это и есть вторая фракция в разведении 1:20.

Т. о. с помощью ионообменной хроматографии получают две фракции сыворотки, содержащие "скрытые" АТ уже в свободном виде, т.к. происходит разрушение ЦИК и устранение блокирующего фактора.

После получения фракций (процесс которого занимает 15 минут) осуществляется стандартный ИФА на ВИЧ с помощью обычных тест-систем для диагностики ВИЧ инфекции. При этом исследуют цельную сыворотку в разведении 1:10+90 мкл буфера ИФА); первую фракцию (10 мкл фракции в разведении 1:10+90 мкл буфера ИФА); вторую фракцию (60 мкл фракции в разведении 1:20+40 мкл буфера ИФА).

После проведения ИФА производится учет реакции с помощью ELIZA и определяется оптическая плотность (ОП) как цельной сыворотки так и фракций и по соотношению оптической плотности 1 фракции и 2 фракции к оптической плотности цельной сыворотки вычисляют коэффициент "скрытых" АТ по формуле

где
K - коэффициент "скрытых" антител;
ОП_1ф - оптическая плотность 1 фракции;
ОП_2ф - оптическая плотность 2 фракции;
ОП_ц.с. - оптическая плотность цельной сыворотки
Чем выше коэффициент "скрытых" антител, тем тяжелее протекает течение болезни
Пример подсчета.

Оп_1ф = 0,610; ОП_2ф = 0,804; Оп_ц.с. = 0,711;

Пример 1. У больного A с диагнозом ВИЧ-инфекции, II стадия (согласно классификации Покровского В. И.) при очередном наблюдении из локтевой вены забрали 3,0 мл крови. Отстаивали 2 часа. Для работы использовали полученную сыворотку, которую разделяли на две фракции с целью освобождения "скрытых" АТ, а затем осуществляли стандартный этап - ИФА на ВИЧ с цельной сывороткой и полученными фракциями.

Результаты оптических плотностей:
ОП_1ф = 0,711; ОП_2ф = 0,412; ОП_ц.с. = 0,921.

По формуле определяли коэффициент "скрытых" АТ

Пример 2. У больного М. с диагнозом ВИЧ-инфекция, III стадия (согласно классификации Покровского В. И.) при очередном наблюдении из локтевой вены забрали 3,0 мл крови. Отстаивали 2 часа. Для работы использовали полученную сыворотку, которую разделяли на две фракции с целью освобождения "скрытых" АТ, а затем осуществляли стандартный этап - ИФА на ВИЧ с цельной сывороткой и с полученными фракциями.

Результаты оптических плотностей:
ОП_1ф = 0,610; ОП_2ф = 0,804; ОП_ц.с. = 0,711.

По формуле вычисляем коэффициент скрытых АТ

Приведенные примеры демонстрируют величину коэффициента "скрытых" антител: во II стадии = 1,2, а в III стадии = 1,99. Нами осуществлено наблюдение на 53 ВИЧ-инфицированными детьми (22 человека - II стадия, 31 человек - III стадия (согласно классификации В.И.Покровского) и установлено, что данный коэффициент "скрытых" АТ во II стадии = 1,57±0,4; в III стадии = 1,92±0,06.

При этом эти показатели достоверно коррелировали с другими серологическими показателями, что видно из таблицы.

Из представленной таблицы видно, что с утяжелением инфекционного процесса (т.е. при переходе из II стадии в III) серологические показатели изменяются в сторону увеличения, что свидетельствует о прогрессировании инфекции. Исключение составляет величина коэффициента T_x/T_s (T-лимфоциты помощники/T-лимфоциты супрессоры), который уменьшается, что свидетельствует об истощении популяции лимфоцитов помощников (T_x).

В случае с больным А. его другие серологические показатели и клиника соответствуют согласно классификации В.И.Покровского II стадии ВИЧ-инфекции. Эти показатели свидетельствуют о борьбе организма с инфекцией. А выявленный нами коэффициент "скрытых" АТ=1,2 меньше предлагаемого нами критерия для данной стадии (K=1,57±0,14), что дает возможность предположить пока еще сравнительно легкое течение заболевания на данный момент. Однако учитывая неизбежность перехода из II стадии в III стадию ВИЧ-инфекции (из-за отсутствия эффективного лечения этой инфекции в мире) т.е. ухудшения состояния больного необходимо отметить непостоянство этого благополучия.

В случае с больным М. его другие серологические показатели и клиника соответствует III стадии ВИЧ-инфекции (согласно классификации В.И.Покровского). III стадия характеризуется дальнейшим значительным ухудшением клинического состояния и изменением серологических показателей в сторону увеличения. Выявленный нами коэффициент "скрытых" АТ у этого больного = 1,99, что соответствует предлагаемому нами коэффициенту в этой стадии = 1,92±0,06 и это дает возможность прогнозировать тяжелое течение ВИЧ инфекции.

Т. о. по выявленным коэффициентам "скрытых" АТ у больного А. (K=1,57), и больного М. (K=1,99) можно предположить более легкое течение ВИЧ инфекции у больного А., и более тяжелое течение этого заболевания у больного М.

По сравнению с прототипом заявленный "Способ лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции" путем разделения сыворотки на фракции для выявления "скрытых" АТ обладает следующим преимуществом: позволяет наряду с другими показателями прогнозировать тяжесть течения ВИЧ-инфекции.

Способ диагностики ВИЧ-инфекции заключается в том, что вычисляют коэффициент "скрытых" АТ к БИЧ, для чего сыворотку больного разделяют на две фракции с помощью ионообменной хроматографии на ОАЕ-50 сефадексе, затем определяют оптическую плотность (ОП) цельной сыворотки и двух фракций и по сумматорному отношению ОП первой и второй фракции к ОП цельной сыворотки вычисляют коэффициент "скрытых" АТ. При значении коэффициента "скрытых" АТ 1,92 прогнозируют тяжелое течение ВИЧ-инфекции. 1 табл.

Способ лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции путем исследования сыворотки крови больного, отличающийся тем, что сыворотка больного с помощью ионообменной хроматографии на ОАЕ-А-50 сефадексе разделяется на две фракции, затем в цельной сыворотке и полученных фракциях после проведения ИФА на ВИЧ определяют оптические плотности и по соотношению суммы оптических плотностей первой и второй фракций к оптической плотности цельной сыворотки определяют коэффициент "скрытых" АТ по формуле

где K - коэффициент "скрытых" АТ к ВИЧ;
ОП_ц.с - оптическая плотность цельной сыворотки;
ОП_1ф - оптическая плотность 1 фракции;
ОП_2ф - оптическая плотность 2 фракции,
при значении коэффициента "скрытых" АТ ≥ 1,92 прогнозируют тяжелое течение ВИЧ-инфекции.