СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАННЕГО ВРОЖДЕННОГО СИФИЛИСА СКРЫТОГО Российский патент 2011 года по МПК G01N33/52 G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционной иммунологии, и может быть использовано в детской инфектологии для диагностики раннего врожденного сифилиса (РВС) скрытого.

Сифилис является одной из классических венерических болезней, возбудитель которой может поражать различные органы и обусловливать циклическую, хроническую инфекцию [1]. В последние годы в России регистрируется неуклонный рост заболеваемости сифилисом, который сопровождается закономерным повышением заболеваемости врожденным сифилисом (ВС) [2]. Участились случаи раннего врожденного сифилиса (РВС) с активными проявлениями и летальным исходом [3].

Сифилитическая инфекция по-прежнему не потеряла своей научной актуальности как в плане эпидемиологическом, так и диагностическом. Новый подъем заболеваемости в 90-х годах XX века проявив себя высоким удельным весом скрытых форм и преобладанием их среди женщин и детей, вновь заставил вернуться к этой проблеме. Однако, несмотря на ее значимость, многие вопросы остаются открытыми и требуют дальнейшего изучения. Если несколько десятилетий назад важным признавалось совершенствование специфической терапии сифилиса, то сегодня интерес сместился в сторону изучения серодиагностики, закономерностей эпидемиологии сифилиса и изучения иммунопатогенеза этой инфекции [3, 4, 5].

Установление диагноза РВС принято проводить с учетом следующих основных критериев [6]:

- данные анамнеза: отсутствие лечения или неадекватное лечение матери;

- рентгенологическое исследование длинных трубчатых костей;

- более высокая позитивность серологических реакций в венозной крови ребенка в сравнении с пуповинной кровью;

- более высокая позитивность серологических реакций в венозной крови ребенка, взятой на 7-8-й день лечения, в сравнении с кровью матери;

- патология в ликворе;

- температурная реакция обострения после начала лечения;

- положительный тест IgM-ИФА с венозной кровью ребенка (как дополнительный критерий).

В настоящее время отмечается, что РВС чаще стал протекать в скрытой форме или со стертыми клиническими проявлениями. Для последних характерна малосимптомность и скудность высыпаний, иногда отрицательные серологические реакции и даже негативные реакции иммунофлюоресценции (РИФ) и реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ), что затрудняет диагностику заболевания, особенно у детей грудного возраста [7]. При моносимптомном РВС манифестном единственным специфическим признаком заболевания чаще оказывается поражение костной системы (60%), или асимптомный менингит (нейросифилис) с положительными серологическими реакциями в ликворе. Данные клинические проявления требуют проведения рентгенологического обследования и люмбальной пункции, с чем могут возникнуть определенные затруднения [8], при этом диагноз РВС может быть «пропущен» или расценен как «скрытый».

Трудности возникают при диагностике РВС скрытого, который необходимо дифференцировать с трансплацентарной передачей антител от матери к плоду [1, 2, 9, 10]. Постановка диагноза «РВС скрытый» требует большой ответственности и допустима либо в случае нарастания титров серологических реакций в процессе лечения, либо при более высоких титрах серологических реакций у новорожденного по сравнению с материнскими. Многие серологические реакции не являются строго специфическими и могут давать ложноположительные результаты. Надежными диагностическими критериями отечественная сифилидология пока не располагает.[1, 2, 8, 9, 10].

Возможность верификации РВС большинством исследователей ассоциируется с необходимостью детекции специфических иммуноглобулинов класса М (JgM) методом иммуноферментного анализа (ИФА) или РИФ-абс, которые за счет избирательной проницаемости плаценты не обнаруживаются у детей при отсутствии сифилиса (при трансплацентарной передаче материнских антител). Однако качество тест-систем для выявления IgM, применяемых в настоящее время в России, не позволяет полностью полагаться на полученный результат. Также на практике при их выявлении могут возникать сложности, связанные с концентрацией в серологических реакциях данных Jg с антителами класса G. Все из предложенных на сегодняшний день методов удаления JgG не могут быть адаптированы для практического использования в связи с крайней методической сложностью, трудоемкостью и дороговизной [7, 11, 12].

В то же время, несмотря на имеющиеся трудности, необходимо раннее установление диагноза РВС для своевременного проведения соответствующего лечения - профилактического либо специфического [6].

Не вызывает сомнений ключевая роль иммунной системы в развитии любых патологических процессов. Реактивность иммунной системы в значительной степени определяет тяжесть любого инфекционного процесса. Различные звенья иммунной системы тесно взаимосвязаны между собой, в связи с чем недостаточность одного из них приводит к срыву всего механизма иммунореактивности [13, 14].

Известно, что при сифилитической инфекции в организме человека возникает специфический воспалительный процесс, формируется нестерильный или инфекционный иммунитет, который сохраняется все время нахождения возбудителя в организме больного [10, 15]. До настоящего времени механизм иммунитета при сифилисе окончательно не установлен, хотя очевидно, что в его формировании участвуют все звенья иммунной системы [10, 16]. Их исследование при сифилисе является актуальным и необходимым: для создания модели взаимодействия возбудителя и иммунной системы, для изучения особенностей иммунных реакций при различных клинических формах инфекции с целью улучшения диагностики и лечения, для определения «иммунологических критериев» излеченности больных сифилисом и рациональности проведения иммунокоррегирующей терапии [16].

Клеточный иммунитет является одним из наиболее ранних ответов макроорганизма человека на внедрение бледной трепонемы и играет значительную роль в формировании иммунной защиты [10, 15]. Вместе с тем данные роли гуморального звена иммунитета в патогенезе сифилиса противоречивы [16, 17]. В последние годы в литературе все чаще стали появляться работы по изучению иммунологических характеристик больных в различные периоды сифилитической инфекции [18], у инфицированных беременных [14], ВИЧ-позитивных лиц, а также с серорезистентностью после лечения сифилиса. При этом нам не встретились работы по изучению иммунологии РВС.

Задача изобретения: ускорение диагностики РВС скрытого.

Поставленную задачу решают за счет того, что при значениях процентного содержания -лимфоцитов более 12,1% по отношению к контрольной группе, абсолютного и относительного числа HLA-DR - антигена: более 80,6×10³/мкл и 1,5% соответственно, чем в контрольной группе, а также фагоцитарного индекса нейтрофилов более 48,2%, диагностируют РВС скрытый.

Способ осуществляют следующим образом.

Проводили исследование клеточного и гуморального звена иммунитета, а также фагоцитоза.

Популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов крови оценивали с помощью метода проточной цитофлоуметрии, используя FACS Calibur (Becton Dickinson, USA) и реагенты Simul Test IMK-Lymphocyte Kit (USA). Анализ проводили используя программу Simul Set.

Изучили содержание , , , , , -клеток в периферической крови. Определили соотношение -клеток (иммунорегуляторный индекс (ИРИ)), которое используют для оценки иммунного статуса пациентов с аутоиммунными нарушениями, с иммунодефицитом или иммунными реакциями. Показано, что относительный процент субпопуляции снижен, а относительный процент субпопуляции повышен у многих пациентов с врожденными или приобретенными иммунодефицитными состояниями, такими как тяжелый комбинированный иммунодефицит и синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). ИРИ равный 1,5-2,5, соответствует нормергическому состоянию, более 2,5 - гиперактивности, менее 1,0 - иммунодефициту. При тяжелом течении воспалительного процесса ИРИ может быть меньше 1,0. Повышение ИРИ до 3,0 нередко отмечается в острой фазе различных воспалительных заболеваний за счет повышения Т-хелперов и снижения уровня Т-супрессоров. При стихании воспалительного процесса эти показатели и их соотношение нормализуются [19].

Концентрацию иммуноглобелинов классов A, М, G в сыворотке крови определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле по G.Mancini [20].

Содержание циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови определяли в реакции с полиэтиленгликолем по методике V.Haskova et al. [21].

Фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови изучали в реакции с частицами латекса. Рассчитывали процент фагоцитирующих нейтрофилов и фагоцитарное число, то есть среднее число поглощенных одним нейтрофилом частиц.

Фагоцитоз - поглощение клеткой крупных частиц, видимых в микроскоп. Изучение показателей фагоцитоза имеет значение в комплексном анализе и диагностике иммунодефицитных состояний. Наиболее информативным для оценки активности фагоцитоза считают фагоцитарное число и индекс завершенности фагоцитоза [19].

Отбор производился из 364 детей в возрасте от 0 до 3 месяцев, составивших группу риска по РВС. В данной группе нами выявлено 64 ребенка с наибольшей вероятностью развития РВС.У 34 из них диагностирован РВС (у 16 детей - манифестный, а у 18 - скрытый). Профилактическое лечение по схеме РВС получили 30 детей (с перинатальным контактом по сифилису), которые составили контрольную группу.

Статистическая обработка результатов проведенных исследований [22] выявила у детей с РВС скрытым изменения функциональной активности Т-клеточного звена иммунитета.

Таблица 1. Показатели клеточного иммунитета у детей в возрасте от 0 до 3 месяцев с РВС скрытым   Контрольная группа(n=30) РВС скрытый (n=18) CD₃ ⁺-клетки, % 71,567±1,144 68,353±1,531 CD₃ ⁺-клетки, 10³/мкл 4331,6±295,724 3658,529±255,912 CD₃ ⁺CD₈ ⁺, % 20,±1,026 19,667±1,561 CD₄ ⁺/CD₈ ⁺ 2,938±0,213 2,94±0,3 CD₁₉ ⁺-клетки, % 12,133±1,136 16,882±1,695 p<0.05 HLA-DR⁺-клетки, % 1,474±0,14 2,471±0,286 p<0.01 HLA-DR⁺-клетки, 10³/мкл 80,579±11,811 131,529±16,965 p<0.05 CD₉₅ ⁺CD₈ ⁺-клетки, % 19,632±2,928 24,941±3,178 Примечание: p - достоверность различий показателей больных с РВС скрытым относительно контрольной группы.

Результаты проведенных иммунологических исследований, представленные в табл.1, показывают, что в группе детей с РВС скрытым в период до лечения заболевания определяется достоверно значимое повышение процентного содержания -лимфоцитов более 12,1% относительно показателей контрольной группы. Кроме того, установлено увеличение абсолютного числа и процентного содержания лимфоцитов крови, экспрессирующих активационный маркер HLA-DR более 80,6×10³/мкл и 1,5% соответственно. Также, согласно табл.2, отмечается нарастание процента нейтрофилов периферической крови более 48,2% относительно величин контрольной группы.

CD19-антиген - гликопротеин, присутствующий на всех периферических В-лимфоцитах, а также на всех предшественниках В-клеток. Он отсутствует на плазматических клетках. Является самым ранним маркером В-клеток и играет важную роль в регуляции активации и пролиферации В-лимфоцитов [19].

HLA-DR - антиген представляет собой мономорфную детерминанту молекул II класса HLA. Маркер экспрессируется на клетках Лангерганса, дендритных клетках лимфоидных органов, определенных типах макрофагов, В-лимфоцитах, активированных Т-клетках и эпителиальных клетках тимуса. В клинике определение маркера используют для количественного определения активированных Т-лимфоцитов, имеющих фенотип , HLA-DR⁺ [19].

Таблица 2. Показатели фагоцитарной активности у детей в возрасте от 0 до 3 месяцев с РВС скрытым   Контрольная группа (n=30) РВС скрытый (n=18) ФИ (%) 43,462±1,182 48,222±1,059 p<0.05 ФЧ (ед.) 4,219±0,087 4,444±0,105 Примечание: p - достоверность различий показателей больных с РВС скрытым относительно контрольной группы.

Таким образом, результаты проведенных исследований установили, что у детей с РВС скрытым в период до лечения заболевания наблюдается увеличение содержания в периферической крови лимфоцитов, несущих поздний маркер активации (HLA-DR) и повышение процентного количества клеток, экспрессирующих -антиген. Кроме того, отмечено увеличение фагоцитарного числа нейтрофилов относительно нормальных величин.

Полученные результаты позволили определить статистически значимые изменения показателей иммунного статуса у детей с РВС скрытым и выявить количественные и качественные показатели, характеризующие данный инфекционный процесс.

Предлагаемый способ может использоваться для ранней диагностики РВС скрытого, что будет способствовать своевременному проведению соответствующего лечения - профилактического либо специфического.

Пример 1.

Больной А., 7 сут., переведен в инфекционный стационар из родильного дома с диагнозом: врожденный сифилис? Из анамнеза заболевания известно, что у матери выявлен скрытый сифилис в 32 нед. беременности и она получила курс специфического лечения, а профилактическое лечение не закончила, так как поступила в роды.

Родился мальчик от преждевременных (в 36 нед.), самостоятельных родов. Масса при рождении 2485 г., закричал сразу, к груди был приложен на вторые сутки.

При переводе состояние ребенка средней тяжести. При обследовании клинических проявлений сифилиса не выявлено. При исследовании сыворотки крови обнаружены положительные серологические реакции на сифилис, но отрицательные ИФА-JgM и нарастание титров серологических реакций в динамике. От проведения люмбальной пункции мать категорически отказалась. Данные результаты также можно расценить, как трансплацентарную передачу материнских антител плоду.

Проведено обследование сыворотки крови. Забор крови из вены осуществляли утром натощак в стерильные герметически закрывающиеся полимерные пробирки (вакутейнеры), содержащих антикоагулянт:

- Для исследования клеточного звена иммунитета и проведения иммуногематологических исследований - пробирки с К₃ЭДТА (1,5+0,15 мг на мл крови) - не менее 2 мл крови.

- Для исследования фагоцитоза - пробирки с гепарином - не менее 5 мл.

- Для исследования гуморального звена - «сухая пробирка» (без антикоагулянты) - не менее 2 мл.

Пробирки с кровью осторожно покачивали, чтобы антикоагулянт на стенках пробирки растворился в пробе. Пробирки с кровью помещали в контейнер и доставляли в центр «СПИД», стараясь избегать встряхивания в пути.

Для каждого образца пациента маркировалось 6 пробирок от A до F, в каждую из которых вносли по 4 мкл антител: CD₄₅/CD₁₄; негативный контроль; CD₃/CD₁₉; CD₃/CD₄; CD₃/CD₈; CD₃/CD₁₆+CD₅₆. На дно каждой пробирки аккуратно добавляется 50 мкл крови и перемешивается, затем инкубировали 20 мин при комнатной температуре в темноте. Разводили лизирующий раствор 1:10 дистиллированной водой при комнатной температуре и добавляли по 0,5 мл в исследуемые пробирки, тщательно перемешивали. Пробирки инкубировали 10 мин при комнатной температуре в темноте, затем центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин. Сливали супернатант, добавляли 2 мл Cell Wash (омыватель клеток) и тщательно перемешивали, затем вновь центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин. Вновь сливали супернатант, добавляли 0,35 мл Cell Wash и тщательно перемешивали. Приготовленные пробы анализировали на проточном цитометре FACS Calibur с помощью программы SimulSET, используя FACS Calibur (Becton Dickinson, USA) и реагенты Simul Test IMK-Lymphocyte Kit (USA). Изучили содержание , , , , , -клеток в периферической крови. Определили соотношение -клеток (иммунорегуляторный индекс (ИРИ)).

Концентрацию иммуноглобелинов классов A, М, G в сыворотке крови определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле по G.Mancini.

Содержание циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови определяли в реакции с полиэтиленгликолем по методике V. Haskova et al.

Фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови изучали в реакции с частицами латекса. Рассчитывали процент фагоцитирующих нейтрофилов и фагоцитарное число, то есть среднее число поглощенных одним нейтрофилом частиц.

Обследование сыворотки крови по предлагаемому способу показало повышение процентного содержания -лимфоцитов до 15%, а также абсолютного и относительного числа HLA-DR - антигена до 242×10³/мкл и 3% соответственно. Также отмечается нарастание процента нейтрофилов (54%), участвующих в фагоцитозе.

На основании анамнеза заболевания, клинических данных и комплексного обследования ребенку был выставлен диагноз: Ранний врожденный сифилис скрытый.

Пример 2.

Больная М., 5 сут., переведена в инфекционный стационар из родильного дома с диагнозом: врожденный сифилис? Из анамнеза заболевания известно, что у матери выявлен скрытый сифилис за 2 года до беременности и она получила курс специфического лечения, профилактическое лечение женщине не проводилось.

Родилась девочка от срочных (в 37 нед.), самостоятельных родов. Масса при рождении 2655 г., закричала сразу, к груди приложена на вторые сутки.

При переводе состояние ребенка средней тяжести. При обследовании клинических проявлений сифилиса не выявлено. При исследовании сыворотки крови обнаружены положительные серологические реакции на сифилис, но отрицательные ИФА-JgM, которые на фоне специфической терапии стали положительными.

Обследование сыворотки крови по предлагаемому способу показало повышение процентного содержания -лимфоцитов до 14,5%, а также абсолютного и относительного числа HLA-DR - антигена до 214×10³/мкл и 2,5% соответственно. Также отмечается нарастание процента нейтрофилов (52%), участвующих в фагоцитозе.

На основании анамнеза заболевания, клинических данных и комплексного обследования ребенку был выставлен диагноз: Ранний врожденный сифилис скрытый.

Таким образом, результаты исследования иммунологических показателей установили у детей с РВС скрытым в период до лечения заболевания увеличение содержания в периферической крови лимфоцитов, несущих поздний маркер активации (HLA-DR) и повышение процентного количества клеток экспрессирующих -антиген. Кроме того, отмечено увеличение фагоцитарного числа нейтрофилов относительно нормальных величин.

Использование способа оценки иммунологических показателей у детей из группы риска по РВС с достаточной точностью позволит на ранних этапах диагностировать РВС скрытый, а значит своевременно и адекватно проводить необходимое лечение заболевания с включением в комплекс терапевтических мероприятий соответствующих иммунокоррегирующих препаратов.

Источники информации

1. Сенчук А.Я. Перинатальные инфекции: Пратич. пособие / Под ред. А.Я.Сенчука, З.М.Дубоссарской. - М.: ООО «МИА», 2005. - С.28-47.

2. Володин Н.Н. Актуальные проблемы неонатологии / Под ред. Н.Н.Володина. - М: ГЭОТАР Медицина, 2004. - С.217-298.

3. Тихонова Л.И. Общий обзор ситуации с инфекциями, передаваемыми половым путем. Анализ заболеваемости врожденным сифилисом в Российской Федерации / Л.И.Тихонова // Вестн. дерматол. и венерол. - 1999. - №2. - С.4-8.

4. Ильппе А. Руководство по детским болезням: Пер. с нем. / Г.Фанкони, А.Вальгрен. - М.: Медгиз, 1960. - С.465-476.

5. Новоселов В.С. Серодиагностика сифилиса: врачебный выбор / В.С.Новоселов, А.В.Новоселов // Альманах клинич. мед. - 2007. - №15. - С.75-78.

6. Приказ Минздрава РФ от 30 июля 2001 г.№291 «О мерах по предупреждению распространения инфекций, передаваемых половым путем» (в ред. Приказа Минздрава РФ от 15.11.2001 №411).

7. Милявская И.Р. О раннем врожденном сифилисе у новорожденных / И.Р.Милявская, И.А.Горланов, Л.М.Леина // Журн. акушерства и женских болезней. - 2004. - №S4. - С.59-60.

8. Терещенко В.Н. К вопросу о современном течении раннего врожденного сифилиса и его диагностике / В.Н.Терещенко, М.П.Середина, Л.Ю.Бердицкая и др. // Тихоокеанский мед. журн. - 2003. - №4. - С.45-46.

9. Терещенко В.Н. Патология нервной системы у детей, рожденных женщинами, инфицированными бледной трепонемой / В.Н.Терещенко, А.А.Овчинникова, Ю.В.Квон и др. // Тихоокеанский мед. журн. - 2003. - №4. - С.61-63.

10. Иванов А.М. Серологическая диагностика сифилиса: возможности повышения информативности / А.М.Иванов, Е.В.Ходосевич, И.Н.Теличко и др. // Журн. акушерства и женских болезней. - 2004. - №S4. - С.63-64.

11. Прохоренков В.И. Сифилис. Иллюстрированное руководство / Под. ред. проф. В.И.Прохоренкова. - М.: Медицинская книга, 2002. - С.81-98.

12. Железнякова Г.Ф. Значение иммунологических исследований при инфекционных болезнях у детей / Г.Ф.Железнякова, В.В.Иванова // Детские инфекции. - 2007. - том 6. - №3. - С.7-16.

13. Жуковская И.Г. Использование титансодержащих препаратов в комплексной терапии хронических цервицитов: Автореф. дис.… канд. мед. наук / И.Г.Жуковская. - Ижевск, 2007. - 24 с.

14. Панкратов О.В. Динамика некоторых показателей иммунной системы у беременных, больных сифилисом / О.В.Панкратов // Мед. новости. - 2006. - №6. - С.114-119.

15. Родионов А.Н. Сифилис // Краткое руководство. - СПб: Питер, 2007. - 320 с.

16. Прохоренков В.И. Современные представления об инфекционном процессе при сифилисе / В.И.Прохоренков, Ю.В.Карачева // Клинич. дерматол. и венерол. - 2005. - №4. - С.4-8.

17. Борисенко К.К. Роль некоторых факторов гуморального и клеточного иммунитета в патогенезе сифилиса / К.К.Борисенко, Е.М.Лезвинская, Ю.В.Вороник и др. // Вестн. дерматол. и венерол. - 1984. - №6. - С.30-34.

18. Борисенко К.К. Клинико-иммунологическая характеристика больных сифилисом / К.К.Борисенко, Н.М.Басинская, Н.А.Михеев // Вестн. дерматол. венерол. - 1985. - №7. - С.24-27.

19. Кишкун А.А. Иммунологические и серологические исследования в клинической практике / А.А.Кишкун. - М.: ООО «МИА», 2006. - 536 с.

20. Manchini G. Immunochemical quantitation of antigens by single radial diffusion / G.Manchini, A.O.Carbonaro, J.F.Haremans // Immunochemistry. - 1965. - Vol.2, - №3. - P.235-254.

21. Haskova V. Simple method of circulating immune complex detection in human sera by polyethylene glycol precipitation / V.Haskova, J.Kaslik, J.Riha // J.Immunol. - 1978. Vol.154, N 8. - P.399-406.

22. Гланц С. Медико-биологическая статистика: Пер. с англ. - М.: Практика, 1998. - 495 с.

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционной иммунологии. Для диагностики раннего врожденного сифилиса скрытого определяют значения клеточного, гуморального звена иммунитета и фагоцитоза в остром периоде болезни. При значениях процентного содержания -лимфоцитов более 12,1 по отношению к контрольной группе, абсолютного и относительного числа HLA-DR - антигена: более 80,6×10³/мкл и 1,5% соответственно, чем в контрольной группе, а также фагоцитарного индекса нейтрофилов более 48,2%, диагностируют РВС скрытый. Использование способа позволяет ускорить и повысить точность диагностики скрытой формы РВС. 2 табл.

Способ диагностики раннего врожденного сифилиса скрытого, включающий определение значений клеточного, гуморального звена иммунитета и фагоцитоза в остром периоде болезни, отличающийся тем, что при значениях процентного содержания -лимфоцитов более 12,1% по отношению к контрольной группе, абсолютного и относительного числа HLA-DR - антигена: более 80,6·10³/мкл и 1,5% соответственно, чем в контрольной группе, а также фагоцитарного индекса нейтрофилов более 48,2%, диагностируют РВС скрытый.