3'-(5-R-ТЕТРАЗОЛ-2-ИЛ)ТИМИДИНЫ, ПРОЯВЛЯЮЩИЕ АНТИВИРУСНУЮ АКТИВНОСТЬ, И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 1998 года по МПК C07H19/73 

Предлагаемое изобретение относится к химии нуклеозидов, в частности к соединениям, применяемым в медицине как противовирусные препараты при заболеваниях, вызванных, например, вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусом миелобластоза птиц (ВМП).

В стратегии лечения СПИДа и других вирусных заболеваний большое значение приобретает химиоиммунотерапия с применением эффективных ингибиторов обратной транскриптазы - производных тимидина, содержащих в 3'-положении различные функциональные группы (азидная, фтор и проч.).

Основным препаратом, используемым в лечении СПИДа, является производное тимидина с азидогруппой в 3'-положении-3'-азидо-2',3'-дидезокситимидин-азидотимидин (AZT). В работах Glinsky R.P., Khan M.C., Kalamas R.L., Sporn R. L. Nucleotide synthesis IV. Phosphorylated 3'-amino-3'-deoxythymidine and 5'-amino-5'-deoxythymidine and derivatives. I. Org. Chem., 1973, v 38, N 25, p. 4299 - 4305 и патенте US, 4837208, кл. A 71 K 31/70, 1983, было показано защитное действие на лимфоциты человека, инфицированные вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), и приведен способ его получения.

Известен способ получения 3'-дезокси-3'-фторнуклеозидов и применение указанных соединений в фармацевтике (патент ГДР 268475, кл. C 07 H 19/073, 1981). Сообщается (W. Tong, Z. Xi, C. Gioeli & I. Chattopadhyaya. Synthesis of new 2,'3'-modified uridine derivatives from 2',3'-ene-2'-phenylselenonyl uridine by Michael addition reactions Tetrahedron, 1991, v 47, N 20/21, p. 3431 - 3450) о синтезе 3'-гетероциклических аналогов AZT: имидазолил, 1,2,4-триазолил, пиразолил производных нуклеозидов.

Синтез таких веществ включает ряд последовательных стадий: ангидридизацию замещенного производного нуклеозида, введение фенилселеновой группы в положение 2', мезилирование, элиминирование метилсульфаниловой кислоты с образованием ненасыщенного производного, окисление надкислотами с образованием соответствующего фенилселенонильного производного, снятие защиты в положении 5' нуклеозида, введение гетероцикла в положение 3' с одновременным элиминированием фенилселенонильной группы. Это способ многостадийный, сложный, требующий большого числа исходных соединений, в том числе и дорогостоящих производных селена.

Наиболее близкими по строению к заявляемым соединениям являются 3'-(5-амино-1,2,3,4-тетразол-1-ил)-3'-дезокситимидины.

Прототипом предлагаемого изобретения по объекту способ является способ получения 3'-(5-амино-1,2,3,4-тетразол-1-ил)-3'-дезокситимидина, включающий взаимодействие AZT с трифенилфосфином в тетрагидрофуране при кипячении, последующую обработку промежуточного соединения - фосфинимина изоцианатами с образованием соответствующих карбодиимидов. Реакция промежуточных карбодиимидов с азотистоводородной кислотой в толуоле приводит к образованию целевого вещества (Dieter Habich. Synthesis of 3'-(5-amino-1,2,3,4-tetrazol-1-yl)-3'-deoxythrymidines. Synthesis,
1992, N 4, p. 358 - 360).

Недостатками способа являются:
- возможность синтеза ограниченного числа соединений. Cпособ позволяет получить только 3'-(5-R-аминотетразолил)-производные нуклеозида, где R - водород, алкил, арил; 3'-(5-R-тетразол-2-ил)тимидины таким способом не могут быть синтезированы;
- многостадийность;
- опасность процесса, обусловленная использованием взрывоопасной и токсичной азотистоводородной кислоты;
- сложность технологического оформления процесса.

Задачей изобретения является разработка технологичного безопасного способа получения новых гетероциклических аналогов AZT, обладающих потенциальной антивирусной активностью.

Предложены 3'-(5-R-тетразол-2-ил)тимидины формулы

где
R - водород или низший алкил, проявляющие антивирусную активность.

Предложен способ получения 3'-(5-R-тетразол-2-ил)тимидинов, включающий обработку 5'-O-защищенного-2,3'-ангидротимидина производным тетразола общей формулы

где
R имеет указанные значения,
в среде органического растворителя в присутствии триалкиламина с образованием 5'-O-бензоилпроизводного тимидина, последующее гидролитическое отщепление бензольной группы и выделение целевого продукта известными приемами.

Одним из главных направлений борьбы со СПИДом и другими вирусными заболеваниями является разработка лекарственных средств профилактики и лечения. AZT - единственное применяемое средство в настоящее время, является структурным аналогом природного нуклеозида-тимидина, входящего в состав молекулы ДНК вируса.

Действие препарата, согласно Краевский А.А., Бибилашвили Р.Ш., Куханова М. К. , Райфельд Ю.Е. Молекулярно-биологические проблемы создания лекарственных средств и изучение механизма их действия. - Хим. фарм. ж., 1988, т, 22, N 11, с. 1289 - 1302 , основано на введении в положении 3' полиазотистого линейного азидного фрагмента. Введение в это положение молекулы тимидина фрагмента полиазотистого гетероцикла тетразола (циклического аналога азида) и его производных позволяет получить препараты, обладающие как выраженной противовирусной активностью, так и низкой токсичностью. Предложенные 3'-(5-R-тетразол-2-ил)тимидины в литературе не описаны.

3'-(Тетразол-2-ил)-тимидин I и 3'-(5-метилтетразол-2-ил)-тимидины II были испытаны на наличие антивирусной активности на модели ВИЧ-1, вируса иммунодефицита человека I-го типа, этиологического агента СПИД. Изученные препараты являются водорастворимыми. На первом этапе исследовали цитотоксичность соединений I и II. Исследование проводилось с использованием чувствительных к ВИЧ-1 лимфобластоидных клеточных линий CEM и Sup T1. 5 • 10⁴ клеток Sup T1 и CEM инкубировали с препаратами I или II в концентрациях 1, 10, 100 и 500 мкг/мл в течение 3 суток, после чего проводили подсчет жизнеспособности в камере Горячева с использованием 0,2% раствора витального красителя трипанового синего или применяли тест МТТ [Vistica D.T., Scehan P., Scudiero D. Cancer Res., 1991, v, 51, p. 2515-20]. Результаты исследований представлены в таблице 1 и 2.

Таким образом, было показано, что оба препарата обладают низким уровнем токсичности на двух разных клеточных линиях. Так, для препарата I при 500 мкг/мл жизнеспособность составляет в среднем 80%, в то время как для препарата II жизнеспособность составляет 95%.

На втором этапе была исследована антивирусная активность этих соединений в диапазоне концентраций: от 0,1 мкг/мл до 100 мкг/мл. Источником ВИЧ служил супернатант клеточной линии CEM, хронически инфицированной штаммом ВИЧ-1 LAI_BRU(TCID₅₀ = 1 • 10⁴/мл). 5 • 10⁴ клеток CEM или Sup T1 инкубировали в течение 2 часов с различными концентрациями препаратов I и II, после чего клетки инокулировали 20 мкл вирусосодержащего супернатанта CEM/LAI_BRU. Развитие инфекции регистрировали методом поликлональной ELISA (Жданов В.М., Карамов Э.В. и др. Вопросы вирусологии, 1989, N 2, с. 294 - 8) на четвертые сутки после заражения, одновременно проводился подсчет жизнеспособных клеток с помощью окрашивания 0,2% трипановым синим. В качестве отрицательного контроля использовались незараженные клетки CEM или Sup T1, положительным контролем служили зараженные вирусом CEM/LAI_BRU клетки без препаратов. Результаты испытаний представлены в таблице 3.

На модели CEM-LAI_BRU установлено, что оба препарата эффективно ингибируют развитие ВИЧ-инфекции даже в концентрации 0,1 мкг/мл. В сравнении с хорошо известным препаратом 3'-азидотимидином (АЗТ) исследуемые производные тетразола значительно менее токсичны.

Таким образом, было показано, что синтезированные производные 3'-(тетразол-2-ил)тимидин I и 3'-(5-метилтетразол-2-ил)тимидин II являются малотоксичными для изученных клеточных моделей и эффективными ингибиторами репликации ВИЧ-1 в культуре инфицированных клеток.

Предлагаемый способ позволил осуществить прямое введение молекулы гетероцикла в положение 3'-нуклеозида (тимидина) путем нуклеофильной атаки производного 5-замещенного тетразола по 3'-положению 5'-O-защищенного ангидротимидина, что дает возможность избежать многостадийных синтезов с использованием взрывоопасной азотистоводородной кислоты и сделать доступными тетразолилпроизводные тимидина без ограничения природы заместителя.

Пример 1. 3'-(Тетразол-2-ил)тимидин.

20 г (0,06 моль) 5'-O-бензоил-2,3'-ангидротимидина, 5,04 г (0,72 моль) тетразола, 10 мл (0,072) триэтиламина в 140 мл диметилформамида (ДМФА) нагревают при перемешивании до 100 - 110^oC и выдерживают 20 - 22 часа. ДМФА отгоняют, получив 25 г некристаллизующейся маслянистой жидкости.

Последнюю растворяют в хлороформе, хлороформенный экстракт промывают водой, сушат над MgSO₄ (прок.) и пропускают через колонку с силикагелем, собирая необходимую фракцию.

Получают 6,2 г (24,5%) 5'-O-бензоил-3'-(тетразол-2-ил)тимидина. T_пл 182 - 185^oC. Строение и индивидуальность полученного соединения подтверждают методами элементного анализа, ИК-спектроскопии.

Найдено, %: C 53,55; H 4,65; N 21,55. C₁₈H₁₈N₆O₅. Вычислено, %: C 54,27; H 4,55; N 21,09. ИК-спектр ( ν, см^-1): 3416(NH), 3156(OH), 3048(C=H), 1698(C= O), 1418, 1470(C=C, C=N), 1284(тетразол), 1094, 1056, 1024, 710(CH). Масс-спектр, m/z, (I_отн, %): 398 (6,9) [M⁺]. Спектр ЯМР ¹Н, δ, м.д. (DMCO-d₆): 1,7 (s, 3H, CH₃); 3,0 (m, 2H, H-2'); 4,7 (m, 1H, H-5'); 6,15 (m, 1H, H-4'); 6,6 (t, 1H, H-1'); 7,8 (m, 1H, H-6'); 8,15 (m, 5H, C₆H₅); 9,3 (s, 1H, CH tet); 11,6 (m, 1H, NH).

К суспензии 9,4 г (0,023 моль) 5'-O-бензоил-3'-(тетразол-2-ил)тимидина в метаноле прибавляют при перемешивании 23 мл 1н раствора метилата натрия в метаноле при 20 - 25^oC. Затем раствор нейтрализуют катионитом КУ-2, смолу отделяют, промывают метанолом. Метанольный раствор выпаривают в вакууме и остаток перекристаллизовывают из воды.

Получают 1 г (14,6%) 3'-(тетразол-2-ил)тимидина. T_пл 170 - 172^oC. Строение и индивидуальность полученного соединения подтверждают методами элементного анализа, ИК-спектроскопии.

Найдено, %: C 44,88; H 5,06; N 28,61. C₁₁H₁₄N₆O₄. Вычислено, %: C 44,90; H 4,80; N 28,55. ИК-спектр ( ν, см^-1): 2350, 2340, 1650(C=O), 1460(C=C, C= N), 1400, 1260(тетразол), 1250, 1080, 1060, 1030. Масс-спектр, m/z, (I_отн, %): 295 (0,05) [M+H]⁺. Спектр ЯМР ¹Н, δ, м.д. (DMCO-d₆): 1,8 (s, 3H, CH₃); 2,8 (m, 2H, H-2'); 3,8 (m, 1H, H-5'); 4,35 (m, 1H, H-4'); 5,75 (m, 1H, H-3'); 5,35 (t, 1H, OH); 6,55 (t, 1H, H-1'); 7,9 (s, 1H, H-6); 9,2 (s, 1H, CH tet); 10,45 (m, 1H, NH). Спектр ЯМР ¹³С, δ_c, м.д. (DMCO-d₆): 163,7 (C-4), 153,7 (C-5''), 150,5 (C-2), 136,1 (C-6), 109,9 (C-5), 84,1 (C-1'), 83,9 (C-4'), 62,9 (C-3'), 61,4 (C-5'), 36,3 (C-2'), 12,3 (CH₃).

Пример 2. 3'-(5-Метилтетразол-2-ил)тимидин.

Процесс проводят аналогично примеру 1 при молярном соотношении исходных соединений, указанном в примере 1. В качестве исходного соединения используют 5-метилтетразол. Получают на первой стадии 5'-O-бензоил-3'-(5-метилтетразол-2-ил)тимидин с выходом 81%. T_пл 159 - 162^oC.

Найдено, %: C 55,20; H 4,95; N 20,49. C₁₉H₂₀N₆O₅. Вычислено, %: C 55,34; H 4,88; N 20,38. ИК-спектр ( ν, см^-1): 2340, 2350, 1690, 1440, 1420, 1270, 1250, 1080, 1060, 1000. Масс-спектр, m/z, (I_отн, %): 412 (6,9) [M⁺]. Спектр ЯМР ¹Н, δ, м.д. (DMCO-d₆): 1,7 (s, 3H, CH₃); 2,5 (s, 3H, CH₃); 3,1 (m, 1H, H-5'); 4,7 (m, 1H, H-4'); 6,0 (m, 1H, H-3'); 6,6 (t, 1H, H-1'); 7,65 (m, 1H, H-6); 8,25 (m, 5H, C₆H₅); 10,2 (m, 1H, NH).

Гидролитическое отщепление бензоильной группы, как описано в примере 1, приводит к образованию 3'-(5-метилтетразол-2-ил)тимидина с выходом 44%. T_пл 206 - 207^oC.

Найдено, %: C 46,85; H 4,98; N 27,48. C₁₂H₁₆N₆O₄. Вычислено, %: C 46,75; H 5,23; N 27,25. ИК-спектр ( ν, см^-1): 2350, 2340, 1710, 1660, 1650, 1460, 1440, 1270, 1260, 1090, 1050, 1000. Масс-спектр, m/z, (I_отн, %): 309 (0,05) [M+H] ⁺. Спектр ЯМР ¹Н, δ, м.д. (DMCO-d₆): 1,8 (s, 3H, CH₃); 2,5 (s, 3H, CH₃); 2,7 (m, 2H, H-2'); 3,65 (m, 1H, H-5'); 4,2 (m, 1H, H-4'); 5,3 (t, 1H, OH); 5,55 (m, 1H, H-3'); 6,4 (t, 1H, H-1'); 7,8 (s, 1H, H-6); 10,5 (m, 1H, NH). Спектр ЯМР ¹³С, δ_c, м.д. (DMCO-d₆): 163,8 (C-4), 162,8 (C-5''), 150,5 (C-2), 136,1 (C-6), 109,9 (C-5), 84,1 (C-1'), 84,0 (C-4'), 62,7 (C-3'), 61,1 (C-5'), 36,2 (C-2'), 12,3 (CH₃-5), 10,63 (CH₃-5'').

Пример 3. 3'-(5-Фенилтетразол-2-ил)тимидин.

Процесс проводят аналогично примеру 1 при молярном соотношении исходных соединений, указанном в примере 1. В качестве исходного соединения используют 5-фенилтетразол. Получают на первой стадии 5'-O-бензоил-3'-(5-фенилтетразол-2-ил)тимидин с выходом 32%. T_пл 218 - 220^oC.

Найдено, %: C 58,89; H 4,34; N 17,22. C₂₄H₂₂N₆O₅. Вычислено, %: C 60,75; H 4,67; N 17,71. ИК-спектр ( ν, см^-1): 2340, 2300, 1700, 1680, 1450, 1440, 1270, 1110, 1080, 1050. Масс-спектр, m/z, (I_отн, %): 474 (6,9) [M⁺]. Спектр ЯМР¹H δ м.д. (DMCO-d₆): 1,7 (s, 3H, CH₃); 3,01 (m, 2H, H-2'); 4,78 (m, 1H, H-4')' 6,15 (m, 1H, H-3'); 6,65 (t, 1H, H-1'); 7,75 (s, 1H, H-6); 8,15 (m, 5H, C₆H₅); 11,7 (m, 1H, NH).

Гидролитическое отщепление бензоильной группы, как описано в примере 1, приводит к образованию 3'-(5-фенилтетразол-2-ил)тимидина с выходом 61%. T_пл204 - 207^oC.

Изобретение относится к химии нуклеозидов, в частности к соединениям, применяемым в медицине как противовирусные препараты для лечения заболеваний, вызываемых, например, вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), миелобластоза птиц (ВМП). Описываются новые 3'-(5-R-тетразол-2-ил)тимидины формулы I, где R - водород или низший алкил, проявляющие антивирусную активность, и способ получения 3'-(5-R-тетразол-2-ил)тимидинов, включающий обработку 5'-О-защищенного -2,3'-ангидротимидина производным тетразола общей формулы II, где R имеет указанные значения, в присутствии триалкиламина в среде апротонного диполярного растворителя с последующим гидролитическим отщеплением защитной - 5'-О-бензоильной группы и выделением целевого продукта. 2 с.п.ф-лы, 3 табл.

(

1. 3'-(5-R-Тетразол-2-ил)тимидины общей формулы

где R - водород или низший алкил, проявляющие антивирусную активность. 2. Способ получения 3'-(5-R-тетразол-2-ил)тимидинов по п.1, отличающийся тем, что 5'-0-защищенный-2,3'-ангидротимидин подвергают обработке производным тетразола общей формулы

R - имеет указанные значения,
в присутствии триалкиламина в среде апротонного диполярного растворителя с последующим гидролитическим отщеплением защитной -5'-0-бензоильной группы и выделением целевого продукта.