СПОСОБ БИОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА ЭКОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ И ОБЪЕКТОВ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/00 G01N33/18 C12Q1/04 

Изобретение относится к области экологии, биологии, медицины, ветеринарии, санитарной экспертизы, стандартизации и сертификации.

Предложенный способ биологического мониторинга экологических систем и объектов (в дальнейшем экспресс-биотест) позволяет быстро, с минимальными затратами, унифицированно определять токсичность, полноценность и специфическую активность почвы, воды, воздуха, пищи для человека, кормов для животных, лекарств, неизвестных веществ, предметов быта, неизвестных предметов и т. д. Это особенно важно санитарно-эпидемиологической, ветеринарно-лабораторной, таможенной службам, органам стандартизации и сертификации, центрам мониторинга земельных ресурсов, водных и воздушных бассейнов, лесов.

Известен способ оценки токсичности жидкостей с помощью двухсуточных дафний [1].

Известен способ определения биологической активности лекарственных средств с помощью перамеций [2].

Известен способ определения биологической активности биопрепаратов с помощью инфузории-тетрахимена пириформис [3].

Известен способ определения биологической оценки продуктов животноводства и кормов с помощью инфузории-тетрахимена пириформис [4].

Известны способы определения биологической активности химических соединений с помощью зеленых одноклеточных водорослей [5, 6].

Способ мониторинга объектов путем отбора веществ-адаптогенов с помощью инфузории-парамециум каудатум, который предусматривает отбор веществ на тест-организмах с последующей их оценкой на белых мышах (7).

Общим недостатком вышеперечисленных аналогов и прототипа является то, что каждый из них предназначен для оценки веществ проверяемого объекта только по какой-либо одной биологической характеристике (например, токсичности или бактерицидной, фунгицидной, стимулирующей активности), требует длительного времени, использует в качестве тест-организмов для каждой операции разные культуры микроорганизмов.

Ближайшим аналогом заявляемого изобретения является использование инфузорий, в том числе и парамециум каудатум, для индикации загрязнений пищевых продуктов микотоксинами (З.А. Курбацская. Биологические тесты индикации микотоксинов).

Авторы используют для тестирования аналогичные среды. Но метод менее информативен и тестирование пассивно, т.к. при его проведении отсутствуют функциональные нагрузки, которые быстрее и точнее выявляют направленность биологического действия испытуемых объектов на инфузории и он применяется исключительно для индикации контаминации грибами и проявления токсичности грибов-продуцентов, тогда как заявляемый способ позволяет тестировать любые объекты внешней среды, а также используемые человеком для своих потребностей.

Целью предложенного изобретения является создание универсального и информативного способа биологического мониторинга экологических систем и объектов.

В сборнике учебно-методических материалов под ред. Тутеляна В.А. "Оценка загрязнений пищевых продуктов микотоксинами", т. III, м., 1983, с. 279-280
Отличием заявляемого способа от прототипа является то, что он поэтапно, быстро и точно оценивает состояние и безопасность любых экологических систем и объектов с помощью однотипных тест-организмов.

Поставленная цель достигается тем, что биологическое действие вещества проверяемого объекта на экологические системы и объекты определяют с помощью инфузории-парамециум каудатум (Paramecium caudatum) в три этапа:
- на первом вносят вещество проверяемого объекта в стандартную среду с тест-организмами и через 0,5 - 24,0 ч оценивают наличие или отсутствие биологической активности вещества по сравнению с действием контрольной стандартной среды на тест-организмы;
- на втором инкубированные в течение 24 ч смесь раствора тест-организмов с веществом проверяемого объекта и контрольный раствор тест-организмов в стандартной среде подвергают функциональным нагрузкам до полной гибели тест-организмов, регистрируют продолжительность их жизни с момента начала воздействия функциональных нагрузок и по полученным данным оценивают стимулирующую или ингибирующую активность вещества проверяемого объекта по сравнению со стандартной средой;
- на третьем смесь раствора тест-организмов с веществом проверяемого объекта, проявившим биологическую активность, инкубируют в течение 3-4 дней, после чего подсчитывают количество тест-организмов в фиксированном объеме смеси и по полученному результату оценивают влияние вещества проверяемого объекта на скорость размножения тест-организмов (определяют индекс биологической активности вещества проверяемого объекта).

По результатам работ вышеописанных этапов делают заключение о возможности применения проверяемых объектов в быту, медицине, ветеринарии, о состоянии и безопасности проверяемой экологической системы или объекта (почвы на выбранной территории, воды в выбранном источнике, атмосферы в выбранном окружающем пространстве, растительности на выбранной территории).

Пример 1. Культивирование и хранение тест-организмов (инфузории-парамециум-каудатум).

В мерный стакан нарезают сено (без цветков, заливают средой Лозино-Лозинского (в г: натрия хлорида - 0,1; калия хлорида - 0,01; магния хлорида - 0,01; натрия гидрокарбоната - 0,02; кальция хлорида - 0,01; воды дистиллированной (pH = 7) - 1 литр) в соотношении 1:2 по объему, прикрывают алюминиевой фольгой и кипятят 20 минут. После небольшого отстаивания сенной настой помещают в термостат на 72 часа при температуре 37^oC (для накопления в среде сенной палочки). Через трое суток в сенной настой вносят 10 мл маточной культуры тест-организмов, хорошо перемешивают, закрывают марлей, датируют посев. Культивируют тест-организмы при температуре 22 - 25^oC. Для получения тест-организмов в экспоненциальной фазе роста (3-х дневных) культуру пересевают в новую среду каждые 3-4 дня, а в стационарной фазе роста (2-х недельная) - 2 раза в месяц.

Пример 2. Подготовка вещества проверяемого объекта к исследованию
2.1. Твердые объекты.

Твердые объекты могут иметь самую различную форму: плотную, мягкую, сыпучую, структурированную. Независимо от этого подготовку вещества твердых объектов ведут по следующей (однотипной) схеме.

Просушивают вещество при температуре 30^oC и берут из него порцию в 10 г, которую измельчают (при необходимости) и просеивают через сито для получения частиц размером не более 225 мк. Отбирают из полученных частиц 3 навески по 0,1 г, помещают их в пробирки и заливают 10 мл дистиллированной воды. Смесь выдерживают в течение 24 часов, 2-3 раза встряхивая, затем центрифугируют в течение 15 минут при 3-5 тыс. об/мин. Для дальнейшей работы используют центрифугат, представляющий собой раствор испытуемого вещества 1:100.

Мягкие формы твердых объектов гомогенизируют и выполняют с ними вышеописанные операции.

С твердых объектов, не поддающихся измельчению, делают смыв минимальным количеством дистиллированной воды, который используют как раствор вещества проверяемого объекта.

2.2. Жидкие объекты.

Из вещества проверяемого объекта берут 3 навески по 0,1 г, размешивают каждую из них в 10 мл дистиллированной воды (1:100) и выдерживают раствор в течение 24 часов, периодически встряхивая. Если вода с веществом не смешивается, перед работой их тщательно взбалтывают до равномерной взвеси, которую используют в дальнейшей работе.

2.3. Газообразные объекты.

Барботер емкостью 10 мл заливают дистиллированной водой и пропускают (барботируют) через нее не менее 10 литров газообразного проверяемого объекта, т. е. растворяют в воде испытуемый газообразный объект до равновесного газонасыщения воды. Таким образом готовят три образца, которые являются исходным материалом для дальнейшей работы.

Пример 3. Первый этап. Оценка наличия биологической активности или токсичности вещества проверяемого объекта. 3.1. Ход работы.

В 5 пробирок наливают по 9 мл раствора тест-организмов (инфузории-парамециум каудатум) в стационарной фазе роста. В первую пробирку добавляют 1 мл дистиллированной воды, перемешивают. Во вторую пробирку добавляют 1 мл подготовленного по примеру 2 раствора вещества проверяемого объекта, перемешивают. Получают концентрацию 1:1000. Перенося по 1 мл жидкости из второй пробирки в третью, из третьей в четвертую, из четвертой в пятую получают в пробирках, соответственно, концентрацию вещества проверяемого объекта 1:10 000; 1: 100 000; 1:1 000 000. После этого пробирки помещают в термостат с температурой 25^oC.

Через 0,5, 1,0, 3,0, 6,0 и 24 часа из каждой пробирки берут по 0,1 мл раствора с тест-организмами (не менее 400 клеток) и заполняют им пять микроаквариумов. Под бинокулярной лупой оценивают состояние тест-организмов в каждом микроаквариуме по следующим критериям:
- ИН - индефферентность (тест-организмы совершают равномерные броуновские движения);
- БА - биоактивность (тест-организмы совершают неравномерные движения с ускорениями);
- БЦ-50 - биоцидность-50 (погибло 50 ± 10% тест-организмов);
- БЦ-100 - биоцидность-100 (погибло 90 ± 10% тест-организмов).

В контрольной пробирке, при каждом наблюдении в течение суток, также как и в микроаквариумах, должно быть не менее 400 тест-организмов (клеток), совершающих равномерные броуновские движения.

3.2. Оценка результатов.

ИН - объект биологически не активен.

БА - объект биологически: (1:1000) - слабоактивен; (1:10 000 - среднеактивен; (1:100 000) - активен; (1:1 000 000) - высокоактивен.

БЦ-50 - объект токсичен.

БЦ-100 - токсическое действие: (1:1000) - слабое; (1:10 000) - среднее; (1:100 000) - сильное; (1:1 000 000) - очень сильное.

БА-24 часа - биологическая активность очень стабильная.

БА-3,0-6,0 часов - биологическая активность стабильная.

БА-0,5-1,0 часа - биологическая активность слабо стабильная.

БЦ-100 - 0,5 - 1,0 час - быстрое повреждение жизненных механизмов.

БУ-100 - 3,0 - 6,0 час - постепенное повреждение жизненных механизмов.

БЦ-100 - 24 часа - медленное повреждение жизненных механизмов.

Пример 4. Второй этап. Оценка биологической активности вещества проверяемого объекта методом разрешающего воздействия.

Сущность метода заключается в выявлении с помощью дополнительного разрешающего неблагоприятного фактора биологического действия вещества проверяемого объекта на механизмы адаптации и резистентности тест-организмов (клеток). В работе используют тест-организмы из первого этапа, контактировавшие с различными концентрациями вещества проверяемого объекта в течение 24 часов, и не контактировавшие (контрольные).

4.1. Ход работы.

Из контрольной пробирки берут в несколько пробирок по 1 мл раствора тест-организмов и добавляют в них 8% раствор хлористого натрия (от 0,1 до 0,5 мл), либо раствор другого электролита или спирта, с таким расчетом, чтобы 100% тест-организмов погибли в течение 5 минут. Контроль гибели тест-организмов ведут в микроаквариумах под бинокулярной лупой с помощью секундомера. Затем берут в несколько пробирок по 1 мл смеси раствора тест-организмов с веществом проверяемого объекта, добавляют в него такое же количество раствора хлористого натрия и измеряют продолжительность жизни тест-организмов до 100% их гибели. Опыты повторяют необходимое количество раз и для дальнейшей работы используют среднюю арифметическую величину.

4.2. Оценка результатов.

Расчеты ведут по формуле ИБА = Т_О/Т_К,
где
ИБА - индекс биологической активности вещества проверяемого объекта;
Т_О - продолжительность жизни тест-организмов (в минутах) под действием разрешающего фактора, проживших предварительно 24 часа в среде с выбранной концентрацией вещества проверяемого объекта;
Т_К - продолжительность жизни контрольных тест-организмов (в минутах) под действием разрешающего фактора, проживших предварительно 24 часа в контрольной среде.

Полученные ИБА оценивают следующим образом.

ИБА = 1,000 ± 0,1000 - вещество объекта биологически не активно.

ИБА > 1,000 ± 0,1000 - вещество объекта повышает жизнеспособность тест-организмов.

ИБА < 1,000 ± 0,1000 - вещество объекта снижает жизнеспособность тест-организмов.

Величина ИБА вещества проверяемого объекта и его концентрация в раствор с тест-организмами характеризуют степень его биологической активности.

Пример 5. Третий этап. Оценка биологической активности вещества проверяемого объекта по интенсивности размножения тест-организмов.

5.1. Ход работы.

Используют тест-организмы в экспоненциальной фазе роста.

Для подсчета тест-организмов в 1 мл раствора, т.е. для определения плотности инокулята, в пробирку с 1 мл раствора вносят 20 мкл раствора Люголя или 5% спиртового раствора йода, тщательно перемешивают, заправляют полученным раствором камеру Фукса-Розенталя, подсчитывают количество тест-организмов в 10 квадратах, делением их на 10 вычисляют среднее число тест-организмов в одном квадрате (объем одного квадрата - 0,0001 мл) и умножают на 10 000. Полученная цифра показывает количество тест-организмов в 1 мл раствора, т.е. плотность инокулята - ПИ.

Далее работу осуществляют по первому абзацу п. 3.1. примера 3, после чего пробирки помещают в термостат с температурой 25^oC на 3 суток. При выдержке проводят аэрацию смеси путем периодического встряхивания пробирок несколько раз в сутки.

Через 3 суток определяют в каждой пробирке вышеописанным способом плотность инокулята ПИ. При необходимости ставят несколько опытов и осредняют результаты для достоверности.

5.2. Оценка результатов.

Расчеты ведут по формуле:

где
ИИР - индекс интенсивности размножения тест-организмов;
ПИОК - плотность инокулята в опыте в конце инкубации;
ПИКН - плотность инокулята в контроле в начале инкубации;
ПИКК - плотность инокулята в контроле в конце инкубации;
ПИОН - плотность инокулята в опыте в начале инкубации.

Полученные расчетом ИИР оценивают следующим образом.

ИИР = 1,000 ± 0,1000 - вещество объекта биологически не активно.

ИИР > 1,000 ± 0,1000 - вещество объекта стимулирует размножение тест-организмов.

ИИР < 1,000 ± 0,1000 - вещество объекта угнетает размножение тест-организмов.

Величина ИИР в сочетании с концентрацией вещества проверяемого объекта в смеси характеризует степень его влияния на механизм размножения тест-организмов.

Пример 6. Оценка биологической активности кормов для животных.

Оценка биологической активности кормов была проведена на примере жмыха и силоса. Образцы кормов готовились по п. 2.1. примера 2, после чего испытуемые образцы исследовали по пп. 3.1. и 3.2. примера 3, п.п. 4.1. и 4.2. примера 4, п.п. 5.1. и 5.2. примера 5. Результаты испытаний представлены в таблице.

Выводы о биологической безопасности и надежности проверяемых экологических систем и объектов делают на основании анализа результатов работ по вышеизложенным этапам.

Предложенный способ (экспресс-биотест) позволяет:
1. Быстро, недорого, массово определять токсичность почвы, воды, воздуха, кормов, пищевых продуктов, кормов для животных, неизвестных веществ с градацией по степени опасности типа - Внимание! Осторожно! Биоцид! Яд! В этих случаях экспресс-биотест позволяет определить, что объект нельзя использовать во избежание возникновения чрезвычайной ситуации и что он требует детального исследования для окончательного заключения о безопасности и пригодности к использованию.

2. Быстро, недорого, массово определять заданную полноценность пищевых продуктов, кормов, неспецифическую активность лекарственных смесей и др. с градацией по степени их полноценности типа - Неполноценно! Избыток стимуляции! В этих случаях экспресс-биотест позволяет определить, что проверяемый объект не соответствует сертификату и для принятия окончательного решения необходимо оценить конкретные параметры несоответствия.

3. Быстро, недорого, массово, постоянно вести биологический мониторинг экологических систем любого уровня с градацией по степени опасности типа - Внимание! Экологическая система в опасности! В этих случаях экспресс-биотест позволяет определить, что недалеко до чрезвычайной ситуации, грозящей человеку и природе, и что необходимы срочные меры по пресечению разрушающего воздействия и восстановлению стабильности экосистемы.

4. Создавать банки данных биологического мониторинга экологических систем, что позволяет обеспечить реальные возможности прогнозирования возможных ситуаций, разработки научно обоснованных путей управления безопасностью и надежностью экологических систем, учитывая их главное качество - биологическую сущность.

5. Быстро и эффективно выявлять недоброкачественную продукцию при ввозе ее на охраняемую территорию, и в других случаях, когда необходимо быстро определить, обладает ли объект биологической активностью, представляет ли он угрозу здоровью людей и животных (до проведения всестороннего исследования и экспертизы на соответствие сертификату), чтобы недопустить ввоз через границу и использование.

Литература
1. Авторское свидетельство СССР N 1234770, G 01 N 33/18.

2. Авторское свидетельство СССР N 1623426, G 01 N 33/15.

3. Методические рекомендации. Н.Н. Максимюк, Л.Я. Телишевская/ Под ред. А. П. Простякова. - М.: 1996. Определение биологической активности биопрепаратов с использованием тест-культуры инфузории- тетрахимена пириформис и тест-штаммов микроорганизмов).

4. Методические рекомендации по биологической оценке продуктов животноводства и кормов с использованием тест-организма тетрахимена пириформис. ВАСХНИЛ, - М,: 1972.

5. Использование инфузории-тетрахимена пириформис как тест-объекта при биологических исследованиях в сельском хозяйстве. Обзорная информация. ВАСХНИЛ. - М,: 1978.

6. Применение реснитчатой инфузории для качественной экспресс-оценки технологий пищевых и кормовых продуктов в условиях Крайнего Севера. - Тюмень: 1979.

7. Методические рекомендации по определению биологической ценности сельскохозяйственных продуктов. ВАСХНИЛ, Южное отделение. - Киев: 1981.

8. Патент Франции N 2141006, G 01 N 33/00.

9. Патент Великобритании N 1358760, C 12 K 1/06.

10. Авторское свидетельство СССР N 990189 A 61 B 10/00.

Изобретение относится к области экологии, биологии, ветеринарии, санитарной экспертизы. Предназначен для определения токсичности экологических систем и объектов - почвы, воды, продуктов питания, лекарственных веществ, бытовых предметов, неизвестных объектов. Способ использует в качестве тест-организмов инфузории парамециум каудатум и мониторинг проводят последовательно в три этапа. На первом оценивают биологическую активность вещества проверяемого объекта. Сравнивают действие данного вещества и контрольной стандартной среды на тест-организмы через 0,5 - 24,0 ч инкубирования. На втором этапе используют инкубированную в течение 24 ч смесь стандартной среды с тест-организмами с веществом проверяемого объекта и контрольную стандартную среду с тест-организмами. Подвергают функциональным нагрузкам до полной гибели тест-организмов, регистрируют последовательность их жизни с момента начала воздействия функциональных нагрузок и по полученным данным оценивают стимулирующую или ингибирующую активность вещества проверяемого объекта по сравнению со стандартной средой. На третьем этапе используют смесь стандартной среды с тест-организмами в возрасте 3 - 4 дней с веществом проверяемого объекта, проявляющим биологическую активность на 1-м этапе. Инкубируют в течение 3 - 4 дней, после чего подсчитывают количество тест-организмов в фиксированном объеме смеси и по полученному результату оценивают влияние вещества проверяемого объекта на скорость размножения тест-организмов. При этом для первого и второго этапов используют в качестве тест-организмов инфузории парамециум каудатум в возрасте 2 - 3 недель. Вещество испытуемого объекта вводят в среду в концентрациях от 1 • 10^-2 до 1 • 10^-6 на 1 мл среды. Инкубируют эту смесь и контрольную стандартную среду с тест-организмами при 18 - 27^oC. Предложенный способ позволяет быстро выявить потенциально опасные объекты, создать банки данных биологического мониторинга экологических систем. Прогнозировать их состояние и разрабатывать научно-обоснованные пути управления ими. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ биологического мониторинга экологических систем и объектов, предусматривающий оценку биологического воздействия вещества проверяемого объекта при введении его в стандартную среду с тест-организмами Paramaecium candatum, отличающийся тем, что мониторинг проводят в три этапа, при этом на первом этапе оценивают биологическую активность вещества проверяемого объекта путем сравнения действия данного вещества и контрольной стандартной среды на тест-организмы через 0,5 - 24,0 ч инкубирования, на втором этапе используют инкубированную в течение 24 ч смесь стандартной среды с тест-организмами с веществом проверяемого объекта, полученную на I этапе, и контрольную стандартную среду с тест-организмами и подвергают функциональным нагрузкам до полной гибели тест-организмов, регистрируют продолжительность их жизни с момента начала воздействия функциональных нагрузок и по полученным данным оценивают стимулирующую или ингибирующую активность вещества проверяемого объекта по сравнению со стандартной средой, и на третьем этапе используют смесь стандартной среды с тест-организмами в возрасте 3 - 4 дней с веществом проверяемого объекта, проявившим биологическую активность на I этапе, инкубируют в течение 3 - 4 дней, после чего подсчитывают количество тест-организмов в фиксированном объеме смеси и по полученному результату оценивают влияние вещества проверяемого объекта на скорость размножения тест-организмов. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для первого и второго этапов используют в качестве тест-организмов инфузории парамециум-каудатум в возрасте 2 - 3 недель, вещество проверяемого объекта вводят в среду в концентрациях от 1 • 10^-2 до 1 • 10^-6 на 1 мл среды, инкубируют эту смесь и контрольную стандартную среду с тест-организмами при 18 - 27^oC.