СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 1999 года по МПК C12Q1/04 A61B10/00 G01N33/569 C12Q1/04 C12R1/32 

Изобретение относится к области биотехнологии и медицинской микробиологии и может быть использовано в диагностике туберкулеза.

Туберкулез, являясь инфекционным заболеванием, вызывается специфическим возбудителем - микобактерией туберкулеза. При образовании в легких или других тканях микроколоний возбудителя в организме развивается клиническая форма специфического процесса. Поэтому обнаружение в мокроте или другом материале микобактерий является основным диагностическим критерием у пациента туберкулеза.

Известен способ обнаружения микобактерий туберкулеза, включающий взятие лимфоидной ткани, измельчение и обработку ее искусственным желудочным соком для максимального высвобождения возбудителя из биоматериала с последующим исследованием обогащенного материала бактериологическим методом (SU 1734699, A 61 B 10/00, 23.05.92).

Однако известный способ не обеспечивает высокой точности диагностики туберкулеза.

Известен также способ выявления микобактерий при внеклеточных формах туберкулеза, включающий внесение в исследуемый материал (кровь, соскоб эндометрия) гемолизатора, последующую обработку ультразвуком, приготовление мазков из полученного осадка и флотационного кольца, окраску люминофором и выявление микобактерий по люминесценции клеток (SU 1286933, A 61 B 10/00, 30.01.87).

Однако известный способ используется только для диагностики туберкулеза женских половых органов.

Наиболее близким аналогом является способ обнаружения микобактерий туберкулеза, заключающийся в том, что нативный исследуемый материал или отцентрифугированный посевной осадок наносят на предметное стекло, фиксируют, окрашивают флуорохромами и производят микроскопию мазка (Шесточенко М.А., Кузьмин Н. А. Люминесцентный анализ в ветеринарии. -М.: Колос, 1979, с.96-98).

К недостаткам аналога относят следующее:
- при наличии в препарате обильного клеточного пула часть микобактерий либо вовсе не окрашивается, находясь в толще мазка, либо, окрашиваясь, не определяется микроскопистом, оказываясь прикрытыми клеточными пластами;
- большая плотность популяции при внутриклеточном размножении возбудителя не позволяет детально идентифицировать форму кислотоустойчивых микобактерий;
- в традиционно приготовленном мазке невозможно определить соотношение внутри- и внеклеточно расположенных форм возбудителя, что снижает информативность исследования.

Техническим результатом изобретения является повышение точности способа за счет более полного выявления микобактерий в пробах, в том числе L-трансформированных, а также возможности детальной идентификации формы внутриклеточного расположения кислотоустойчивых образований и определения внутри- и внеклеточно расположенных форм возбудителя.

Сущность изобретения заключается в следующем: из исследуемого материала (мокрота, мазок с надгортанника или миндалин) готовят парные мазки, один из которых обрабатывают в течение не менее 24 часов раствором, вызывающим осмотический цитолиз, а другой используют как контрольный. После окраски флуорохромами микроскопируют оба мазка. Обнаружение типичных, морфологически сохранных микобактерий позволяет считать препарат позитивным, а пациента опасным. Обнаружение отличий в популяции обнаруженных микобактерий туберкулеза в контрольном (без обработки дезинтегрирующим раствором) и в опытном (обработанном) мазках-отпечатках позволяет идентифицировать видоизмененные (L-трансформированные) клетки.

В качестве раствора, вызывающего осмотический цитолиз, используют раствор следующего состава:
Сахароза - 2,0-16,0 г
Натрий хлорид - 0,1-0,8 г
Динатрий этилендиаминтетраацетат - 0,1-0,8 г
Натрий фосфат двузамещенный - 0,1-0,8 г
Натрий фосфат однозамещенный - 0,05-0,4 г
Натрий ортофосфат - 0,05-0,4 г
Кислота лимонная - 0,05-0,4 г
Диметилсульфоксид - 0,02-0,2 мл
Вода бидистиллированная - До 1 л
Способ позволяет максимально освободить микобактерии из клеточного пула и тем самым повысить эффективность бактериовыделения при туберкулезе.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Для исследования отбирают мокроту и/или мазки с надгортанника и миндалин. Забор мазков производит квалифицированный отоларинголог. Из полученного материала готовят парные мазки-отпечатки известным методом. Один из парных мазков-отпечатков служит контролем. После фиксации на один из мазков (опытный) наносят 0,1 мл раствора, вызывающего осмотический цитолиз, и помещают во влажную камеру на 24 часа. После этого мазок высушивают и повторно фиксируют. Контрольный мазок - идентичный, но без добавления дезинтегрирующего раствора. После окраски флуорохромами микроскопируют оба мазка. При обнаружении типичных, морфологически сохранных микобактерий препарат считают позитивным, а пациента - эпидемиологически опасным. При обнаружении внутриклеточно или внеклеточно расположенных кислотоустойчивых зернистых или иных форм (L-трансформированных) идентифицируют "клеточный" или "тканевый" туберкулез или их сочетание.

Пример 2. Обследовано 42 больных стационара и поликлиники. Контингент обследованных состоял как из подтвержденных ранее бацилловыделителей, составивших 20% исследований, так и лиц, бацилловыделение у которых ранее не отмечалось, - 80% исследований.

У всех больных, относящихся к категории бацилловыделителей, микобактерии туберкулеза были обнаружены согласно изобретению как в мазке с надгортанника, так и в мазке с миндалин. Известным методом (Циль - Нильсона) микобактерии были обнаружены только дважды и только в мазках с надгортанника. Среди пациентов, не относящихся к категории бацилловыделителей, микобактерии туберкулеза были обнаружены заявленным изобретением в 32 мазках с миндалин, что составило 60% от всех произведенных исследований, в мазках с надгортанника - в 5 случаях, в мокроте - в одном. При этом методом Циля - Нильсона микобактерии у указанного контингента не обнаруживались ни разу.

Наряду с обнаружением морфологически сохранных форм у ряда пациентов способом согласно изобретению находили шаровидные варианты L-форм. Интенсивность свечения L-форм была меньше выраженной в сравнении с палочковидными микобактериями (яркая рубиново-оранжевая окраска). Окраска L-форм варьировала от умеренно-лимонной до слабо-желтой с зеленоватым оттенком.

У двух больных при наличии типичных палочковидных микобактерий в мазках с надгортанника в препаратах с миндалины были найдены зернистые формы, расположенные вне- и внутриклеточно. У двух других больных при неоднократных исследованиях каждый раз выявлялись кислотоустойчивые зернистые формы в мазках как с надгортанника, так и с миндалин.

Таким образом, изобретение позволяет значительно увеличить процент выявления микобактерий туберкулеза в исследуемом материале и идентифицировать их L-трансформацию.

Изобретение касается диагностики туберкулеза. Из исследуемого материала (мокрота, мазок с надгортанника или миндалин) готовят парные мазки. Один из мазков обрабатывают в течение не менее 24 часов раствором, вызывающим осмотический цитолиз. Другой мазок используют как контрольный. После окраски флуорохромами микроскопируют оба мазка. Обнаружение типичных, морфологически сохранных микобактерий позволяет считать препарат позитивным, а пациента опасным. Обнаружение отличий в популяции обнаруженных микобактерий туберкулеза в контрольном (без обработки дезинтегрирующим раствором) и в опытном (обработанном) мазках-отпечатках позволяет идентифицировать видоизмененные (L-трансформированные) клетки. В качестве раствора, вызывающего осмотический цитолиз, используют раствор следующего состава:
Сахароза - 2,0-16,0 г
Натрий хлорид - 0,1-0,8 г
Динатрий этилендиаминтетраацетат - 0,1-0,8 г
Натрий фосфат двузамещенный - 0,1-0,8 г
Натрий фосфат однозамещенный - 0,05-0,4 г
Натрий ортофосфат - 0,05-0,4 г
Кислота лимонная - 0,05-0,4 г
Диметилсульфоксид - 0,02-0,2 мл
Вода бидистиллированная - До 1 л
Способ позволяет максимально освободить микобактерии из клеточного пула и тем самым повысить эффективность бактериовыделения при туберкулезе. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ обнаружения микобактерий туберкулеза, включающий изготовление мазков-отпечатков из исследуемого материала, их фиксацию, окраску флуорохромами с последующим учетом результатов при люминесцентной микроскопии, отличающийся тем, что в качестве исследуемого материала используют мокроту, мазки с надгортанника и/или миндалин, готовят из них парные мазки-отпечатки, один из которых обрабатывают в течение не менее 24 ч раствором, вызывающим осмотический цитолиз, а другой используют как контрольный, при этом учет результатов проводят по обнаружению характерно светящихся образований в обработанном мазке-отпечатке. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве раствора, вызывающего осмотический цитолиз, используют раствор следующего состава:
Сахароза - 2,0 - 16,0 г
Натрий хлорид - 0,1 - 0,8 г
Динатрий этилендиаминтетраацетат - 0,1 - 0,8 г
Натрий фосфат двузамещенный - 0,1 - 0,8 г
Натрий фосфат однозамещенный - 0,05 - 0,4 г
Натрий ортофосфат - 0,05 - 0,4 г
Кислота лимонная - 0,05 - 0,4 г
Диметилсульфоксид - 0,02 - 0,2 мл
Вода бидистиллированная - До 1 л.