РАНОЗАЖИВЛЯЮЩЕЕ СРЕДСТВО ГУБКА ЦИТОТИМОКОЛ, ЕЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ФОРМЫ (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 1999 года по МПК A61L15/38 A61L15/32 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения ожогов и гнойных ран в условиях прогрессирующей раневой флоры.

Известны препараты для лечения язв, ожогов, ран и других поражений кожи, в которых коллаген, как высокомолекулярный фибрильный белок соединительной и костной ткани, комбинируют с другими высокомолекулярными веществами животного происхождения.

Известно, что коллаген может выполнять одновременно роль основы для фармацевтических композиций и лекарственных веществ. В противоожоговые и ранозаживляющие композиции вводят активаторы плазминогена тканевого и урокиназного типа (1), гормональные вещества (2), обладающие антимикробной активностью - диоксидин, фурагин.

Известен препарат тималин (3), способствующий восстановлению иммунологической реактивности (регулирующий количественное соотношение T- и B- лимфоцитов и их субпопуляций, усиливающий фагоцитоз), улучшающий процессы клеточного метаболизма, а также стимулирующий реакции клеточного иммунитета и процессы регенерации и кроветворения в случае их угнетения.

Известен ферментный препарат цитохром С (4), получаемый путем экстракции сердец крупного рогатого скота, внутримышечное введение которого способствует улучшению энергетического обмена. Являясь водорастворимым компонентом, цитохром С, по сравнению с другими ферментами дыхательной цепи, наиболее легко вымывается из митохондриальных мембран при их деструкции. Выход цитохрома С из митохондрий сопровождается резким нарушением процессов поглощения кислорода клеткой и синтеза в ней АТФ.

Известно перевязочное средство, выполненное из биоструктурируемой матрицы (5). Однако структурные особенности этого средства не позволяют формировать его многослойным, что снижает диапазон его функциональных свойств.

Однако при использовании пречисленных препаратов в виде порошкообразных лекарственных форм определенную трудность доставляют дозировка их применения и неудобство фиксации на участках тела, требующих лечения.

Известна гемостатическая губка, содержащая коллаген (6), и способ ее получения в форме пластин, которые структурируются в парах формальдегида, являющаяся наиболее близким аналогом заявляемого изобретения.

Следует отметить, что в процессе лечения ран важное значение приобретают лекарственные формы, которые обладают гемостатическим, дренирующим действием, обеспечивая отток из раны микробной флоры и благотворно влияющие на местные иммунные процессы.

В связи с этим задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, состоит в создании средства для лечения травм различного характера (ран, ожогов), обладающего комплексом заданных свойств, в том числе сорбционных, дренирующих, гемостатических, защитных.

Задача решена путем создания ранозаживляющего средства на основе коллагена, дополнительно содержащего тималин и цитохром С, при следующем соотношении, мас.%:
Коллаген - 94,5 - 98,25
Тималин - 1,25 - 3,0
Цитохром С - 0,5 - 2,5
Согласно изобретению целесообразно для усиления местного подавления инфекции, чтобы раневое покрытие включало в свой состав дополнительно до 4% антибиотиков и/или до 2% антисептиков соответственно от количественного содержания коллагена.

Согласно заявляемому изобретению раневое покрытие может быть выполнено как в однослойной форме, так и в форме двухслойной губки.

Согласно изобретению лекарственная форма ранозаживляющего средства для покрытия раны, выполнена в виде однослойных губчатых пластин, содержащих кроме коллагена, тималин и цитохром С, при этом компоненты взяты в следующем соотношении, мас.%:
Коллаген - 94,5 - 98,25
Тималин - 1,25 - 3,0
Цитохром С - 0,5 - 2,5
Согласно изобретению лекарственная форма ранозаживляющего средства для покрытия раны, выполненная в виде губчатых пластин, содержащит кроме коллагена, тималин и цитохром С, причем пластины выполнены двухслойными, содержащими слой коллагена с тималином и едой коллагена с цитохромом С, при этом компоненты взяты в следующем соотношении, мас. %:
Коллаген - 94,5 - 98,25
Тималин - 1,25 - 3,0
Цитохром С - 0,5-2,5
Коллагеновая губка с тималином и цитохромом (далее цитотимакол) является комбинированным препаратом. Входящие в ее состав лекарственные средства уже применяются в медицинской практике, например, путем парентерального введения как средств комплексной терапии. При этом ни коллаген, ни цитохром, ни тималин не относятся к группе токсических веществ.

Входящие в состав композиции: коллаген - выполняет формообразующую функцию и оказывает стимулирующее влияние на процессы ранозаживления после резорбции клетками организма по типу обратной связи; цитохром - оказывает выраженное действие на процессы заживления, воздействуя на энергетику клетки и улучшая микроциркуляцию крови; тималин - активно стимулирует иммунную систему организма. При этом необходимо отметить, что ранозаживляющее действие веществ, входящих в состав композиции при указанном соотношении ингредиентов, значительно выше, чем при применении губки, содержащей только коллаген, т.е. наблюдается синергизм.

Согласно изобретению способ получения лекарственной формы ранозаживляющего средства для покрытия раны в виде однослойных губчатых пластин включает получение гомогенного раствора коллагена с тималином и цитохромом С, замораживание его, осуществление сублимационной сушки, обработку сухой пластины в парах формальдегида при температуре 20 - 25^oC не более 20 часов и стерилизации, при этом компоненты берут в следующем соотношении, мас.%:
Коллаген - 94,5 - 98,25
Тималин - 1,25 - 3,0
Цитохром С - 0,5-2,5
Согласно изобретению способ получения лекарственной формы ранозаживляющего средства для покрытия раны в виде губчатых пластин заключается в получении двухслойных пластин, для чего в замороженный раствор коллагена с цитохромом С добавляют раствор коллагена с тималином, замораживают, осуществляют сублимационную сушку, сухую пластину обрабатывают в парах формальдегида при температуре 20 - 25^oC не более 20 часов и подвергают стерилизации, при этом компоненты берут в следующем соотношении, мас.%:
Коллаген - 94,5 - 98, 25
Тималин - 1,25 - 3,0
Цитохром С - 0,5 - 2,5
Для выбора оптимального соотношения цитохрома и тималина в коллагеновой основе для биологического скрининга получили губки, содержащие в исходной композиции цитохрома С от 0,5% до 3,0% и тималина 1,25% и 3,0% (по активному веществу). Варианты композиции представлены в табл.1.

Эти варианты композиции были изучены в эксперименте на животных (кроликах). Отбор оптимального состава композиции проводили на основе способности стимулировать процессы заживления ран и степени стимуляции. В процессе исследования выявлено, что наибольшей эффективностью на процессы заживления обладали губки, содержащие 1,5% цитохрома и 3,0% тималина порошкообразного.

Способ получения ранозаживляющего покрытия включает образование гомогенного раствора коллагена, тималина и цитохрома С, с последующим замораживанием, сублимационной сушкой и стерилизацией. Для придания стабильности раневому покрытию осуществляют структурирование его в парах формальдегида при температуре +20 -25^oC в течение не более 20 часов. Эта обработка удлиняет время между сменами повязки в 2-3 раза в зависимости от состояния раны.

Для получения двухслойного покрытия в замороженный раствор коллагена с цитохромом наливают раствор коллагена с тималином и до проведения сублимационной сушки осуществляют замораживание.

Препарат представляет собой лекарственную форму - губчатое раневое покрытие (губка Цитотимакол) в виде пластины как однослойной, так и двухслойной, которая будучи помещенной на раневую поверхность постепенно рассасывается (в течение 1-3 суток), обеспечивая равномерное поступление цитохрома и тималина в ткани раны. Кроме того, разработанное покрытие - губка Цитотимакол хорошо моделируется на раневой поверхности, трансформируется в пленочное покрытие, обеспечивая защиту раны от инфицирования.

Ниже приведены примеры получения губки Цитотимакол.

Пример 1 (получение однослойной губки).

1. В емкость с мешалкой заливают 1 кг 1% уксуснокислого раствора коллагена и при перемешивании добавляют 50 мг цитохрома С, затем 400 мг тималина, растворенных в 100 мл воды. Тщательно перемешивают в течение 30 минут.

2. Раствор коллагена с цитохромом и тималином разливают в плоские кюветы с толщиной слоя 8 мм.

3. Кюветы с раствором переносят в аппарат сублимационной сушки и замораживают до температуры -30 -35^oC в течение 2 часов, затем включают вакуум и высушивают в течение 18 - 20 часов, вакуум 0,7 мм рт. столба, температура подогрева материала при досушке +40^oC.

4. Сухой пористый материал разрезают на пластины 50х50 мм, герметично упаковывают в полимерные пакеты и стерилизуют облучением дозой 2,5 мрад.

Пример 2.

1. В емкость с мешалкой заливают 1 кг 1% уксуснокислого раствора коллагена и при перемешивании добавляют 250 мг цитохрома С, затем 100 мг тималина. Тщательно перемешивают в течение 30 минут. Остальные операции процесса проводят как указано в примере 1.

Пример 3.

1. В емкость с мешалкой заливают 1 кг 1% уксуснокислого раствора коллагена и при перемешивании добавляют 100 мг цитохрома С, затем 300 мг тималина, предварительно растворенных в 100 мл. воды. Тщательно перемешивают в течение 30 минут. Затем дополнительно вводят 750 мг антибиотика гентамицина и перемешивают. Остальные операции процесса проводят как указано в примере 1.

Пример 4 (получение двухслойной губки).

1. В емкость с мешалкой заливают 1 кг 1% уксуснокислого раствора коллагена и при перемешивании добавляют 200 мг цитохрома, перемешивают.

2. Раствор коллагена с цитохромом разливают в плоские кюветы с толщиной слоя 4 мм и замораживают до температуры -20 - 25 ^oC.

3. В емкость с мешалкой заливают 1 кг уксуснокислого раствора коллагена и доливают 300 мг тималина, перемешивают.

4. В кювету с замороженным раствором коллагена с цитохромом наливают раствор коллагена с тималином до общей толщины 8 мм и замораживают до температуры продукта -30 -35^oC.

5. В аппарате сублимационной сушки процесс проводят при вакууме 0,1 мм рт. столба, температуре досушки +40^oC. Время сушки 18 - 20 часов.

6. Сухую губку разрезают на пластины 50х50 мм или других размеров, герметично упаковывают в полимерные пакеты и стерилизуют облучением дозой 2,5 мрад.

Пример 5.

1. В емкость с мешалкой заливают 1 кг уксуснокислого раствора коллагена и при перемешивании добавляют 100 мг цитохрома и 300 мг тималина. Тщательно перемешивают. Затем дополнительно вводят 100 мг сангвирина или 150 мг хинодиксина и перемешивают. Остальные операции процесса осуществляют как в примере 1.

Пример 6.

1. Операции проводят в соответствии с п.п. 1-5 примера 4.

6. Сухую губку помещают в пары формальдегида на 8 часов, при температуре 20 - 22^oC.

7. Проветривание, губку выдерживают в темном месте 24 часа.

8. Структурированную губку разрезают на пластины размером 50х50 мм или других размеров, герметично упаковывают в полимерные пакеты и стерилизуют облучением дозой 2,5 мрад.

Губка Цитотимакол упруга, не растворяется в воде и органических растворителях. В форме пластин различного размера губка Цитотимакол может успешно выполнять роль раневого покрытия или тампона, заполняющего различные полости.

Лечебную эффективность губки Цитотимакол сравнивали на модели глубокого термического ожога у кроликов породы "Шиншила", массой 2,50 ±0,13 кг. Ожог вызывали металлической пластиной площадью 400 мм² на коже спины кролика, температура ожога в подкожно-жировом слое 55^oC. Морфологически показано, что глубина ожога соответствует ШБ-IV степени тяжести. В каждой серии было по 10 ожогов. На 5 сутки после нанесения ожога производили иссечение поврежденных тканей до глубины собственной фасции, раны заметно увеличились в размере, просушены и закрыты коллагеновыми губками с тималином, цитохромом и их комбинацией. Через сутки повязки сменили, так как они полностью растворились. Затем повязки меняли через 7 - 14 дней. Динамика ранозаживления и результаты испытаний губки в различных модификациях представлены в табл. 2.

Клинические наблюдения и морфологический контроль показали, что в варианте 4 на 20 день раны зажили у всех животных, грануляционная ткань была более зрелой, реорганизация рубца выражена ярче, эпитализация полнее, а эпителий дифференцирован по слоям, чем в других вариантах. Лечебная эффективность комбинированной коллагеновой губки с тималином и цитохромом на 10% выше, чем при использовании губки с цитохромом и на 20% выше, чем при использовании губки с тималином.

Изучение хронической токсичности губки Цитотимакол проводили при ее подкожной имплантации на двух видах лабораторных животных: белые лабораторные крысы обоего пола массой 150 - 200 г и кролики породы "Шиншилла" массой 3,0 - 3,5 кг. В результате испытаний установлено, что имплантация образцов препарата с эквивалентными дозами цитохрома и тималина (разовая, общекурсовая, 10- кратная курсовая) не вызывает изменений и нарушений функций жизненноважных органов и систем.

Определение биологической активности комбинированной губки, содержащей цитохром С и тималин основано на определении активности кислой фосфотазы в гистиоцитах, щелочной фосфотазы в лейкоцитах и сосудах тканей, активности ЛТФ-азы в сосудах и цитохрома С в макрофагах у животных с гнойно- резано-разможженными ранами в динамике раневого процесса.

Исследование проводили на модели гнойно резано-разможженой раны мягких тканей бедра кроликов породы "Шиншила"обоего пола массой тела от 2 до 3кг, использовали по 8 кроликов в опытной и контрольной группах. С этой целью у кроликов выбривали область мягких тканей и производили разрез глубиной 2 см и длиной 5 см. Мягкие ткани (мышцы, подкожную клетчатку) раздавливали концом зажима Кохера. Ткани инфильтровали смесью возбудителя Staphilococcus aurcus штамм 186. На кожу накладывали швы. Через 72 часа непрорезавшиеся швы снимали. Проводили туалет ран 3% раствором перекиси водорода. Животным опытной группы на раны накладывали комбинированную губку, содержащую цитохром С и тималин. На раны кроликов контрольной группы накладывали повязки с чистой коллагеновой губкой. Пористый перевязочный материал извлекался из стерильной упаковки и накладывался на раневую поверхность таким образом, чтобы края пластин выступали примерно на 0,5 см за пределы раны. Сверху накладывали сухую асептическую повязку. Через сутки пропитанный раневым эксудатом перевязочный материал удалялся. Проводился туалет раны, которая снова покрывалась стерильным пористым материалом. Смена повязок проводилась ежедневно по мере пропитывания материала раневым отделяемым (с учетом стадии раневого процесса).

В результате исследования установлено, что при применении комбинированной губки, содержащей цитохром С и тималин, на протяжении всей фазы воспаления (4-6 суток) уровень цитохрома С в макрофагах был значительно выше, чем в контрольной серии, что свидетельствует о проникновении экзогенного цитохрома С в поврежденные клетки. Характерным является увеличение активности щелочной фосфотазы в лейкоцитах, что свидетельствует об усилении бактерицидных свойств этих клеток. Активация ЛТФ-азы в сосудах свидетельствует об усилении процессов внутриклеточного энергообразования.

В фазу профилерации (14 - 21 сутки) активируется функция эндотелиальной стенки сосудов, о чем свидетельствует повышение активности щелочной фосфотазы сосудов, принимающей активное участие в процессах транскапиллярного обмена, и активности ЛТП-азы. Отмечается высокая активность цитохрома С макрофагов, хотя число этих клеток снижается по сравнению с предыдущей фазой. Реакция тканей в эту фазу характеризуется высокой активностью кислой фосфотазы - в незначительных очагах лейкоцитарной инфильтрации.

В фазе рубцевания (28 - 40 сутки) стабилизировалось на высоком уровне содержание кислой фосфотазы в гистиоцитах, а щелочной фосфотазы - в лейкоцитах и сосудах, ЛТФ-азы - в сосудах и цитохрома С - в макрофагах. Следует отметить, что применение комбинированной губки, содержащей цитохром С и тималин, свидетельствует о более интенсивных процессах клеточного метаболизма в тканях, усилении иммунологической реактивности, способствующих более интенсивному очищению раневой поверхности от некротизированных тканей и эпитализации раны.

По результатам исследования комбинированную губку, содержащую цитохром С и тималин, можно считать биологически активной, поскольку она способствует увеличению активности кослой и щелочной фосфотазы в тканях на 14 - 21 сутки, а ЛТФ-азы в сосудах и цитохрома С в макрофагах на 21 - 40 сутки раневого процесса не менее, чем на 25 - 30% по сравнению с контролем (чистой коллагеновой губкой). Через три недели от начала в опытной серии с аппликацией губки Цитотимакол у всех животных наступало полное заживление ран, наблюдались полная эпитализация и реорганизация рубца. Рубец образовывался по типу "первичного натяжения" мягкий, подвижный, не стягивающий окружающие ткани. В контроле под чисто коллагеновой губкой заживление наблюдалось только у 40% животных.

На экспериментальной модели линейной раны (крысы, спина) установили, что выраженным действием на процессы ранозаживления с образованием наиболее прочного и эластичного рубца обладает раневое покрытие, содержащее 96% коллагена, 1,0% цитохрома и 3% тималина порошкообразного. Таким образом ранозаживляющее покрытие губка Цитотимакол в предлагаемых пределах является оптимальным для усиления ранозаживляющих свойств, обеспечивает длительное дозированное воздействие на процессы энергообразования в поврежденных тканях и кроме того, характеризуется высоким водопоглощением.

Источники информации:
1. Патент США N 4600711, 1986 г.

2. Патент США N 4609546, 1986 г.

3. Патент РФ N 1112603, МКИ A 61 K 37/02, 1994 г.

4. ФС 42- 2534-88 на "Цитохром С лиофилизированный"
5. Патент США N 4470962, 1985 г.

6. Патент РФ N 2034572, МКИ A 61 L 15/32, 1995.

Ранозаживляющее средство содержит, мас.%: коллаген 94,5-98,25, тималин 1,25-3,0 и цитохром С 0,5-2,5. Ранозаживляющее средство для покрытия раны может быть выполнено в виде однослойных губчатых пластин или в виде двухслойных губчатых пластин. Двухслойная губчатая пластина содержит слой коллагена с тималином и слой коллагена с цитохромом С. При изготовлении однослойной губчатой пластины получают гомогенный раствор коллагена с тималином и цитохромом С, замораживают его, осуществляют сублимационную сушку, сухую пластину обрабатывают в парах формальдегида при 20-25^oС не более 20 ч и подвергают стерилизации. При изготовлении двухслойных губчатых пластин в замороженный раствор коллагена с цитохромом С добавляют раствор коллагена с тималином, замораживают, осуществляют сублимационную сушку, сухую пластину обрабатывают в парах формальдегида при 20-25^oC не более 20 ч и подвергают стерилизации. Новое средство обеспечивает усиление ранозаживляющих свойств, оказывает дренирующее и противомикробное действие. 5 с. и 2 з.п.ф-лы, 2 табл.

1. Ранозаживляющее средство на основе коллагена, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит тималин и цитохром С, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Коллаген - 94,5 - 98,25
Тималин - 1,25 - 3,0
Цитохром С - 0,5 - 2,5
2. Ранозаживляющее средство по п.1, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит антибиотиков до 4% от массы коллагена. 3. Ранозаживляющее средство по п.1, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит антисептиков до 2% от массы коллагена. 4. Лекарственная форма ранозаживляющего средства для покрытия раны, выполненная в виде однослойных губчатых пластин, содержащих коллаген, отличающаяся тем, что пластины дополнительно сожержат тималин и цитохром С, а компоненты взяты в следующем соотношении, мас.%:
Коллаген - 94,5 - 98,25
Тималин - 1,25 - 3,0
Цитохром С - 0,5 - 2,5
5. Лекарственная форма ранозаживляющего средства для покрытия раны, выполненная в виде губчатых пластин, содержащих коллаген, отличающаяся тем, что пластины дополнительно содержат тималин и цитохром С, причем пластины выполнены двухслойными, содержащими слой коллагена с тималином и слой коллагена с цитохромом С, а компоненты взяты в следующем соотношении, мас.%:
Коллаген - 94,5 - 98,25
Тималин - 1,25 - 3,0
Цитохром С - 0,5 - 2,5
6. Способ получения лекарственной формы ранозаживляющего средства для покрытия раны в виде однослойных губчатых пластин, отличающийся тем, что получают гомогенный раствор коллагена с тималином и цитохромом С, замораживают его, осуществляют сублимационную сушку, сухую пластину обрабатывают в парах формальдегида при 20 - 25^oC не более 20 ч и подвергают стерилизации, при этом компоненты берут в следующем соотношении, мас.%:
Коллаген - 94,5 - 98,25
Тималин - 1,25 - 3,0
Цитохром С - 0,5 - 2,5
7. Способ получения лекарственной формы ранозаживляющего средства для покрытия раны в виде губчатых пластин, отличающийся тем, что при получении двухслойных пластин в замороженный раствор коллагена с цитохромом С добавляют раствор коллагена с тималином, замораживают, осуществляют сублимационную сушку, сухую пластину обрабатывают в парах формальдегина при 20 - 25^oC не более 20 ч и подвергают стерилизации, при этом компоненты берут в следующем соотношении, мас.%:
Коллаген - 94,5 - 98,25
Тималин - 1,25 - 3,0
Цитохром С - 0,5 - 2,5