ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ОБЕЗВОЛАШИВАНИЯ И МЯГЧЕНИЯ КОЖЕВЕННО-МЕХОВОГО СЫРЬЯ Российский патент 1999 года по МПК C12N9/58 C12S7/00 C12S7/00 C12R1/56 

Изобретение относится к биотехнологии и касается обработки кожевенно-мехового сырья с помощью нового комплексного ферментного препарата.

Известны предлагаемые фирмой Rohm ферменты Erhazyms и Erhavit HST, применяемые для обезволашивания шкур крупного рогатого скота в процедурах отмоки при pH 9,0-10 и pH 10, соответственно (Кожевенно-обувная промышленность, N4, с. 41, 1992).

Однако известные ферментные препараты позволяют осуществлять обезволашивание кожевенно-мехового сырья в присутствии высоких концентраций сульфида натрия (1,3-1,7% от массы сырья), что ухудшает качество шерсти, санитарно-гигиенические условия труда, осложняет очистку сточных вод. Кроме того, необходимо добавление фермента мягчения - панкреатина.

Для обезволашивания кожевенного сырья используют ферментный препарат - щелочная грибная протеаза, продуцируемая штаммом Acremorium chrysogenum и щелочная протеаза гриба (см. авторское свидетельство 1640169, кл. C 12 C 1/04, 1991).

Недостаток известного препарата заключается в том, что он способен осуществлять только обезволашивание, но не мягчение кожевенного сырья и также требует высоких концентраций сульфида натрия. Кроме того, при его использовании имеет место повреждение голя, нарушение природного строения мереи сосочкового слоя дермы шкуры и увеличение размеров волосяных сумок. Препарат имеет также недостаточно высокую активность.

Ближайшим аналогом по технической сущности является использование фермента - щелочной протеазы, протосубтилина ИОХ и тестикана, взятых в равных соотношениях для обезволашивания шкур. Общая величина протеолитической активности и мукополисахаридазной составляет 300 ед/г и 1280 ед/г соответственно. Процесс не требует присутствия сульфида натрия, отрицательных измерений в слое дермы не обнаружено (SU, авторское свидетельство 1244181, кл. C 14 C 1/04, 1986).

Задачей предлагаемого изобретения является расширение арсенала ферментов, способных осуществлять две функции - обезволашивание и мягчение, сохранение шерсти для войлочной промышленности и увеличение выхода готовых шкур по площади до 5%.

Достигаемый технический результат: получают более активный препарат "Прок", продуцируемый штаммов Streptomyces lavenduale ИНМИ-36-SV (SU, авторское свидетельство 1735364, кл. C 12 N 9/52, 1992), при использовании которого имеет место стабильный одновременный эффект обезвоживания и мягчение сырья без добавления панкреатина, снижение расхода сульфида натрия (0,2-1,0% от массы сырья) и сохранение шерсти, получение кожи высокого качества с большим выходом по площади (5%) при улучшении условий труда.

Получение препарата и его характеристика иллюстрируются следующим примером.

Пример.

Посевной материал штамма Streptomyces lavendulae ИНМИ-36-SV выращивают в течение двух суток на питательной среде следующего состава (г/л): кукурузный экстракт - 8,0; крахмал - 10; мел технический - 4,0; NaCl - 5,0; (NH₄)₂SO₄ - 5,0; вода водопроводная; температура 28^oC; время культивирования - 48 часов на качалке (180-200 об/мин). Посевной материал вносят в количестве 10 об.% + 0,1 в ферментационную среду следующего состава (г/л): кукурузная мука - 18; белковый препарат N 1 (ГОСТ 17536-82) - 7,0; MgSO₄ • 7H₂O - 0,02; вода водопроводная; при pH 6,8% температура 28^oC в течение 72 часов, на качалке (200 об/мин). Затем культуральную жидкость отделяют от мицелия фильтрованием. Фильтрат культуральной жидкости высушивают с помощью распылительной сушки при температуре 120-125^oC на входе и 60-65^oC на выходе. К сухому препарату добавляют 1% NaCl и получают ГЗХ-форму препарата, который используют в технологии обработки кожевенно-мехового сырья.

Препарат "ПРОК" имеет следующие свойства:
- порошок от светло-серого до светло-бежевого цвета (ГОСТ 20264.1-74);
- общая протеолитическая активность 300 ед/г (по Кунитцу) или 3000 ед/г (по Ансону);
- белок по Лоури - 850 мг/г препарата;
- связывается с монообменниками (ДЕАЕ-целлюлоза, ДЕАЕ-сефароза);
- преципитирует при 80% насыщения сульфата аммония;
- гидролирует казеин;
- оптимальная для работы ферментного препарата концентрация стабилизирующего агента NaCl - 1%;
- изоэлектрическая точка: 5,9 и 6,0 (при определении методом электрофокусирования);
- pH-оптимум:
6,8-7,8 (условия: в трис-HCl-буфере, pH-метр);
-диапазоны рН-стабильности:
pH 6,8-7,8 (условия: в трис-HCl-буфере при 37^oC в течение 60 мин., субстрат - казеинат натрия);
при pH 6,0 - за 10 мин остаточная активность 30%;
при pH 8,0 - за 10 мин остаточная активность 80% (условия те же);
- pH-термостабильность:
активен при температуре 37^o-45^oC, pH 6,8-7,8;
при температуре выше 45^oC активность резко падает при любых значениях pH;
при температуре от +4^oC до +25^oC и pH 6,8-7,8 активность стабильна;
при температуре выше +25^oC до 45^oC активность нестабильна (pH 6,8-7,8);
- термостабильность:
активность падает с +45^oC (трис-HCl-буфер, pH 6,8-7,8):
+45^oC в течение 60 мин 100%
+50^oC за 10 мин 90%
+60^oC за 10 мин 30%
- константа Михаэлиса:
0,9 • 10^-6, субстрат - казеинат натрия;
- ингибиторы:
ЕДТА, фенилметилсульфанилфторид, о-фенантролин при концентрации выше 10^-4 М.

Сравнительные данные по свойствам предложенного и известного препаратов для обработки кожевенно-мехового сырья представлены в таблице.

Из таблицы видно, что активность предложенного препарата превышает активность известного, в отличие от которого он, кроме того, осуществляет наряду с обезволашиванием и мягчение кожевенно-мехового сырья.

Получена опытно-промышленная партия ферментного препарата. Ферментация проведена на 15-кубовом ферментере в течение 72 часов с выходом 90 кг сухого препарата с активностью 300 ед/г препарата (по Кунитцу) или 300000 ед/г препарата (по Ансону).

Использование: биотехнология, обработка кожевенно-мехового сырья. Сущность изобретения: предлагается новый микробный ферментный препарат "ПРОК" с общей протеолитической активностью 300 ед/г (по Кунитцу) или 300 000 ед/г по тирозину (метод Ансона), гидролизующий казеин, с изоэлектрической точкой 5,9 и 6,0; рН-оптимум 6,8-7,8; диапазоны рН-стабильности 6,8-7,8; термостабильность-активность падает с 45^oC; константа Михаэлиса 0,9•10^-6, субстрат-казеинат натрия; ингибиторы - ЕДТА, фенилметилсульфанилфторид, о-фенилтролин (при концентрации выше 10^-4 M); по активности превышает препарат щелочной протеазы из Bacillus subtilis, но в отличие от него осуществляет не только обезволашивание, но и мягчение кожевенно-мехового сырья, что исключает использование панкреатина; сокращает расход экологически вредного загрязнителя - сульфида натрия в 2-3 раза; сохраняет шерсть для войлочной промышленности; отличается мягким воздействием на лицевую мембрану шкуры; увеличивает выход готовых кож по площади до 5%. Ферментный препарат (ГЗХ-форма) получают из фильтрата культуральной жидкости штамма Streptomyces lavendulae ИНМИ-36- SV о помощью высушивания на распылительной сушке при температуре 120-125^oC на входе и 60-65^oC на выходе и добавления к сухому порошку 1% NaCl. 1 табл.

Ферментный препарат для обезволашивания и мягчения кожевенно-мехового сырья из Streptomyces lavendulae ИНМИ-36-SV, обладающий протеолитической активностью и имеющий следующие свойства:
субстратная специфичность:
гидролизует казеин;
изоэлектрическая точка: 5,9 и 6,0 (при определении методом электрофокусирования);
рН-оптимум: 6,8 - 7,8 (в трис-HCl-буфере, рН-метр);
диапазоны рН - стабильности: рН 6,8 - 7,8 (в трис-HCl-буфере при температуре 37^oC в течение 60 мин, субстрат - казеинат натрия); при рН 6,0 - за 10 мин остаточная активность 30%; при рН 8,0 - за 10 мин остаточная активность 80% (условия те же);
рН-термостабильность: активен при температуре 37 - 45^oC, рН 6,8 - 7,8;
при температуре выше 45^oC активность резко падает при любых значениях рН;
при температуре от 4 до 25^oC и рН 6,8 - 7,8 активность стабильна;
при температуре выше 25 до 45^oC активность нестабильна (рН 6,8 - 7,8);
термостабильность: активность падает с 45^oC (в трис-HCl-буфер, рН 6,8 - 7,8); 45^oC в течение 60 мин 100%, 50^oC за 10 мин 90%, 60^oC за 10 мин 30%;
константа Михаэлиса: 0,9 • 10^-6 (cубстрат - казеинат натрия); ЕДТА, фенилметилсульфанилфторид, 0-фенантролин(при концентрации выше 10^-6М).