Способ получения коллагеназы Советский патент 1993 года по МПК C12N9/58 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению ферментов микробного происхождения, и может быть использовано в медицине при терапии ожоговых ран, обморожений (препарат Ирук- сол, Югославия), некоторых заболеваний печени, грыжи интервертебрального диска позвоночника, для получения и культивирования клеточных культур человеческих и животных тканей, являющихся источником активаторов плазминогена в тромболитиче- ской терапии, а также в парфюмерной промышленности и НИР, например, для определения структуры коллагенов.

Цель изобретения - увеличение активности фермента, удешевление процесса его получения.

Указанная цель достигается тем, что в качестве продуцента коллагеназы используют актиномицет Streptomyces lavendulae ВКГ1М-5-910 (ИНМИ-36-SV). культивирование которого осуществляют в течение 48-72 ч при температуре (28±2)°С и рН 6,4-6,8 на

питательной среде следующего состава, г/л: кукурузная мука 18-20, препарат № 1 (мука кормовая животного происхождения, отходы ГОСТ 17536-82) 15-20. желатин 2,5- 3,0, MgS04 -7Н20 0,2-0.4, вода водопроводная. Среду разливают по 50 мл в колбы Эрленмейера обьемом 250 мл. Посевной материал вносят в количестве 10%. Выращивание проводят на качалке (200 об/мин) при (28 ±2)° С в течение 48-72 ч. Мицелий отделяют центрифугированием при 6000 об/мин. Осаждение ферментов из культураяьной жидкости осуществляют ацетоном при температуре 0 - 5°С.Коллагеназную активность осажденного ферментного препарата определяют с помощью нингидринового метода и выражают в ед. лей/мл к.ж. или мг препарата.

Коллагеназная активность в культуральной жидкости составляет 10-20 ед.лей/мя, а в осажденном лиофилизированном препарате -135-185 ед.лей/мг (в мкмоль лейцина) за 18 ч инкубации реакционной смеси.

Ј

00

ю ю

00

VJ ю

i : и .тельными признаками предлагаемого способа является то, что в качестве продуцента коллэгеназы используют акти- номицет Streptomyces lavendulae ВКПМ-S- 910 (ИНМИ-36-SV), который выращивают в течение 48-72 ч при температуре (28±2)°С и рН 6,4-6,8 на питательной среде следующего состава, г/л: кукурузная мука 18-20, препарат N 1 (мука кормовая животного происхождения, отходы, ГОСТ 17536-82) 15-20, желатин 2.5-3,0, MgSCM -7Н20 0,2- 0,2, вода водопроводная. Среду разливают по 50 мл в колбы Эрленмейера объемом 250 мл. Посевной материал вносят в количестве 10%. Выращивание проводят на качалке (200 об/мин) при (28±2)°С в течение 48-72 ч. Мицелий отделяют центрифугированием при 6000 об/мин. Осаждение ферментов из культуральной жидкости осуществляют ацетоном при 0-5°С. Коллагеназная актив- ность осажденного ферментного препарата определялась с помощью нингидринового метода и выражалась в ед. лей/мл к.ж. илк мг препарата.

Коллагеназная активность в культураль- ной жидкости составляет 10-20 ед. лей/мя в осажденном лиофилизировзнном препарате - 135-185 ед. лей/мг (в мкмоль лейцина), за 18 ч инкубации реакционной смеси

Увеличение или уменьшение вышеука- занных концентраций компонентов среды отрицательно влияет на синтез коллагенаэы - активность снижается на 10-50%. При температуре ниже и выше указанных пределов, исходных значениях рН ниже 6,4 и выше 6,8 снижается скорость роста и ферментативная активность. При сокращении менее 48 ч или увеличении более 72 ч времени нырлщивания активность также снижается.

Изобретение иллюстрируется следую щими примерами.

Пример 1. Культуру Streptomyces lavendulae ВКПМ-5-910 (ИНМИ-36-SV) вы

ращивают на среде следующего состава,

г/л: кукурузная мука 18, препарат № 1 1,5, желатин 2,5, MgSCM -7Н20 0,2, остальное - вода водопроводная, рН 6,6. Посевной материал вносят в количестве 10%. Выращивание проводят при 28°С в колбах на 250 мл в 50 мл среды на качалке (200 об/мин) в течение 48 ч. Культуральную жидкость отде- ляют центрифугированием (6000 об/мин) при охлаждении. Осаждение ферментов проводят при температуре 0 - 5°С. Осадок лиофилизируют и определяют коллагеназ- ную активность по нингидриновому методу по лейцину (15) через 18 ч инкубации реакционной смеси.

5 0

5

0 5

5

0 5

Коллагеназная активность культуральной жидкости равна 12ед/мл,лиофилизиро- ванного препарата - 135 ед/мг.

П р и м е р 2. Культуру Streptomyces lavendulae ВКПМ-5-910 (ИНМИ-36-SV) выращивают на среде следующего состава, г/л: кукурузная мука 20, препарат 1st 1 20, желатин 3,0, -7Н20 0,4, остальное - вода водопроводная, рН 6,8. Посевной материал вносят в количестве 10%, Выращивание проводят при 30°С в колбах на 50 мл в 50 мл среды, на качалке (200 об/мин) в течение 48 ч. Культуральную жидкость отделяют центрифугированием (6000 об/мин) при охлаждении. Осаждение ферментов проводят при 0-5°С. Осадок лиофилизируют.

Коллагеназная активность культуральной жидкости равна 16 ед/мл, а лиофилизи- рованного препарата - 150 ед/мг за 18 ч инкубации реакционной смеси.

П р и м е р 3. Культуру Streptomyces lavendulae ВКПМ-5-910 (ИНМИ-36-SV) выращивают на среде следующего состава, г/л: кукурузная мука 20, препарат № 1, 20, желатин 3,0, MgSO-j -7Н20 0,4, остальное - вода водопроводная, рН 6.5. Выращивание проводят по примеру 2, но в течение 72 ч. Холлагенаэная активность в культуральной жидкости равна 20 ед/мл, в лиофилизиро- ванном препарате - 185 ед/мг за 18 ч инкубации реакционной смеси.

Применение предлагаемого способа позволяет получить из культуральной жидкости актиномицета Streptomyces lavendulae ВКПМ-5-910 (ИНМИ-36-SV) активную кол- лагеназу.

Коллагеназная активность осажденного из хультуральной жидкости препарата до 1,5 раза превышает активность препарата, юлученного по известному способу. В предлагаемом способе используют простую и дешевую питательную среду.

Формула изобретения Способ получения коллагеназы, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма на водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота, желатин, сульфат магния семиводный до достижения максимальной активности, отличающийся тем, что, с целью увеличения активности фермента и удешевления способа, в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм Streptomyces lavendulae ВКПМ5- 910, а культивирование ведут при температуре 26-30°С, рН 6,4-6,8 на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода кукурузную муку, источника азота 518228796

белковый препарат Ns 1 при следующем со-Желатин2,5-3,0

отношении компонентов, г/л:Сульфат магния семиводный 0,2-0,4

Кукурузная мука18-20Вода водопроводная Остальное.

Белковый препарат № 11,5-2,0

Использование: биотехнология, в частности получение ферментов микробного происхождения, медицина, парфюмерная промышленность и НИР. Сущность изобое- тения: в качестве продуцента коллагеназы используют актиномицет Streptomyces lavendulaeBKnM-S-910(HHMH-36SV) культивирование которого осуществляют в течение 48-72 ч при температуре (28±2)°С и рН 6,4-6,8 на питательной среде следующего состава, г/л: кукурузная мука 18-20: препарат № 1 (мука кормовая животного происхождения) 1,5-2,0; желатин 2,5-3,0; MgSO 7Н20 0,2-0,4: остальное - вода водопроводная, до достижения активности фермента в культуральной жидкости 10 /0 ед/мл. в препарате 135-185 ед/мг