ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЙ ПРЕПАРАТ "БЕТАЛЕЙКИН" Российский патент 1999 года по МПК C12N15/24 C12N15/25 A61K38/20 A61K45/05 C12N15/25 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к лекарственным препаратам иммуномодулирующего действия.

Известно использование препаратов, воздействующих на иммунную систему, препаратов женьшеня, элеутерококка, облепихи, котовника, мумие, прополиса и т. п. (В.И.Машанов, А.А.Покровский. Пряно-ароматические растения, М., Агропромиздат, 1991, И.С.Соколова и др. Дикорастущие и культурные растения, М., Медицина, 1990). Указанные препараты применяются, как правило, перорально в виде растворов или таблеток.

Недостатком указанных препаратов является ограниченность природных ресурсов, нестандартность сырья, наличие побочных эффектов, невозможность использования внутривенно, что наиболее эффективно при ряде патологий, в частности, при онкологических заболеваниях.

Известен ряд биохимических иммуномодуляторов, в частности тималин, нуклеинат натрия, продигиозан и т.п. Препараты выпускают в виде порошка, который либо принимается перорально, либо разводится, например физиологическим раствором, и используется внутримышечно. (Земсков Ф.М. и др. Иммунология, 1981, N 1, с. 52-55, Морозов В.Г. и др. ДАН СССР, 1977, т. 233, N 3, с. 491-494, Машковский М.Д. Лекарственные средства, М., Медицина, 1993, т. 2, с. 169-177).

Недостатком препаратов является невозможность использования их внутривенно, побочные эффекты, относительно невысокая эффективность.

Известно использование в виде иммуномодуляторов цитокинов, в частности альфа-интерферона. Препарат вводится больному внутримышечно или интраназально в виде аэрозолей. Функционирование системы интерферона при различных способах и дозах введения альфа-2-интерферона зависит от активации экспрессии генов гистосовместимости и в основном связано с противовирусным действием (Малиновская В.В., Мурзабаева Р.Т., Манахова Л.С. и др. Вопросы вирусологии. - 1989. - Т. 34. - N 2. - С. 180-183).

Известно иммуностимулирующее действие и других цитокинов, в частности интерлейкинов (ИЛ), например интерлейкина-1 (ИЛ-1). В частности, известно, что развитие инфекционных заболеваний у человека может сопровождаться повышением уровня ИЛ-1, синтез которого, очевидно, связан с развитием защитных механизмов и активацией иммунной системы.

ИЛ-1 является индуцибельным белком, продукция которого осуществляется главным образом моноцитами и макрофагами (Кетлинский С.А и др., Бюлл.экспре. биол.мед., 1988, N 11, С. 581; Симбирцев А.С. и др., Иммунология, 1995, N 3, С. 48). Синтез ИЛ-1 начинается в ответ на внедрение микроорганизмов либо при повреждении тканей и необходим для осуществления всего комплекса защитных реакций, именуемых острофазовым ответом (Dinarelio, Rev.Inf.Dis. 1984, V. 6, P. 51).

Основное биологическое действие ИЛ-1 заключается в увеличении числа лейкоцитов крови за счет стимуляции костномозгового кроветворения и повышении иммунологической реактивности. Кроме того, ИЛ-1 вызывает подъем температуры тела, изменяет продукцию белков острой фазы воспаления и содержание ионов металлов в плазме крови, воздействует на функции фибробластов и эндотелиальных клеток, влияет непосредственно на мозг, обеспечивая участие практически всех систем организма в защите от патогенов.

Ближайшим аналогом изобретения является препарат ИЛ-1, используемый для стимуляции, пролиферации клеток-предшественников костного мозга и стимуляцию функциональной активности иммунокомпетентных клеток. Действие ИЛ-1 связано с индукцией синтеза и усилением биологического действия колониестимулирующих факторов. Данное свойство ИЛ-1 находит свое применение в восстановлении костномозгового кроветворения после воздействия токсических веществ, химиотерапевтических препаратов и облучения (Neta et al., J.Immunol. 1986, v. 136, p. 2483-2485). Используемый препарат представляет собой раствор интерлейкина-1 в физиологическом растворе, вводимый в исследуемый биологический объект. При этом ИЛ-1 способен оказывать защитное действие при введении как до, так и после повреждающего агента.

Однако известный препарат не нашел применения в клинической практике, в частности при внутривенном введении, в связи с его высокой себестоимостью.

Технический результат изобретения заключается с создании высокоактивного иммуномодулирующего препарата, свободного от аллергизирующих примесей и балластных белков, нереактогенного и с хорошей толерантностью конечной формы.

Сущность изобретения заключается в том, что иммуномодулирующий препарат "Беталейкин" состоит из смеси человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) и интерлейкина-1-бета (ИЛ-1 б) в соотношении масс 20-60:1.

Возможно использование больших или меньших по сравнению с указанными интервалами количеств интерлейкина, однако использование меньших относительных количеств ИЛ-1б снижало эффективность лечебного действия, а применение больших количеств вызывало гипертермию при введении, а кроме того, было нецелесообразно из экономических соображений.

По-видимому, препарат представляет комплекс, в котором молекулы ИЛ-1б частично окружены оболочкой из молекул ЧСА, что обеспечивает более мягкое и пролонгированное действие вследствие оптимального режима введения ИЛ-1 в организм за счет растворения комплекса в плазме крови или лимфе. В результате исключается протекание в зоне введения гипертермических и аллергических реакций, что является существенным преимуществом по сравнению с использованием чистого ИЛ-1.

Применяемый в композиции интерлейкин-1 бета может быть препаратом различного происхождения, оптимальным исходя из экономических соображений являлось использование в качестве ИЛ-1б генно-инженерного продукта, полученного авторами культивированием бактерии Escherichia coli штамм C600, в частности, по технологии, описанной в пат. РФ N 2045575, 1992 и последующим выделением из культуральной жидкости с помощью ионгидрофобной хроматографии.

Наряду с использованием чистого препарата возможно введение в него дополнительно фармацевтически приемлемых веществ, выполняющих служебные функции, таких как, например, лактоза, вводимая в ампулу в количестве 1-3 мг на 1 мкг "Беталейкина" для улучшения внешнего вида препарата и придания ему большей стабильности при хранении.

Полученный препарат, как показали эксперименты, может быть использован как для наружного применения, так и для подкожного или внутривенного введения в виде раствора в изотоническом растворе хлорида натрия, дистиллированной воде, растворах глюкозы и других фармацевтически приемлемых жидкостях. Он оказался эффективен при лечении инфекционных заболеваний, последствий травм, ожогов, а также нарушений костномозгового кроветворения после курсов радио- и химиотерапии. Получено разрешение МЗ РФ на его клиническое использование (рег. N 97/51/6).

Препарат применяли, как правило, следующим образом. Ампулу, содержащую комплекс из 0.001 мг ИЛ-1б и 0.02-0.06 мг ЧСА, растворяли непосредственно перед введением сначала в 1 мл стерильного изотонического 0,9% раствора натрия хлорида либо воды для инъекций и доводили общий объем раствора до 100 мл изотоническим 0,9% раствором натрия хлорида или 5% раствором глюкозы.

Лечение препаратом при использовании внутривенно проводят в виде курса из 5 ежедневных капельных внутривенных инфузий в дозе 5-20 нг/кг массы тела пациента на 500 мл изотонического 0,9% раствора натрия хлорида или 5% раствора глюкозы. Продолжительность инфузии может варьировать от 30 до 90 минут.

Подкожный способ введения осуществляется аналогичным образом в тех же дозах.

Наружно препарат используют в виде растворов, наносимых на раневую поверхность, аппликаций или эмульсий в маслах.

Как показали проведенные эксперименты, "Беталейкин" обладает способностью стимулировать лейкопоэз в условиях его глубокого угнетения при токсической лейкопении, в том числе при так называемой "фебрильной нейтропении", обусловленной применением отдельных цитостатиков или их комбинаций при терапии злокачественных опухолей. Препарат оказывает аналогичное действие при лейкопении, вызванной воздействием ионизирующего излучения, и обладает радиозащитными свойствами.

Кроме того, препарат оказывает иммуностимулирующее действие путем увеличения функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов и лимфоцитов, направленное против сопутствующей или самостоятельно существующей инфекции. Клинические испытания продемонстрировали высокую эффективность применения препарата "Беталейкин" в качестве иммуностимулятора для коррекции вторичных иммунодефицитных состояний у больных с гнойно-септическими процессами.

Оценка иммунного статуса пациентов, получавших терапию "Беталейкином", проведенная после окончания курса лечения, показала, что препарат вызывал возрастание содержания T-лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих поверхностные CD3, B-лимфоцитов (CD20) и увеличивал число клеток, несущих мембранные рецепторы к интерлейкину-2 (CD25).

Наиболее существенные изменения под влиянием терапии "Беталейкином" наблюдались при анализе бластной трансформации лимфоцитов в культуре под влиянием ФГА. Препарат в несколько раз усиливал пролиферативный ответ лимфоцитов. По-видимому, эти результаты могут быть связаны с усилением под влиянием "Беталейкина" продукции цитокинов, особенно интерлейкина-2, синтез которого был существенно снижен до начала лечения по сравнению с нормальными показателями. "Беталейкин" вызывал также увеличение функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов, а именно миграции, бактерицидности и фагоцитоза клеток.

Сущность и возможность промышленного применения изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение "Беталейкина".

Для получения препарата в мерную емкость объемом 0.5 л помещают 1,2 мл водного раствора, содержащего 2,5 мг интерлейкина-1 бета, 150 мг ЧСА и при необходимости дополнительно 3,0 г лактозы, после чего доливают стерильной апирогенной водой до метки. Полученный раствор разливают во флаконы или ампулы ШП-1 емкостью 1 мл с помощью шприца-дозатора, подвергают лиофильной сушке и запаивали в условиях соблюдения стерильности.

Пример 2. Применение "Беталейкина" в опытах ин витро.

Препарат Беталейкин обладает дозозависимым лимфоцитактивирующим действием в культуре. При оценке биологической активности в стандартном комитогенном тесте на тимоцитах мышей и лимфоцитах человека (Симбирцев и др. Иммунология, 1990, N 6, С. 39). "Беталейкин" значительно усиливает пролиферацию клеток, индуцированную субоптимальными дозами лектинов или антителами к поверхностному антигену СД3. Результаты отражены в таблицах 1 и 2 (см. в конце описания).

Пример 3. Применение "Беталейкина" для лечения лейкопении, вызванной применением цитостатиков, у больного раком легкого.

Больной Р. поступил в клинику. Института онкологии им. Н.И.Петрова с диагнозом "Рак легкого IIIб стадии". Проведенная схема полихимиотерапии по поводу основного заболевания привела к снижению числа лейкоцитов до 1,4•10^-9/л, что затрудняло продолжение противоопухолевой терапии и привело к ухудшению самочувствия больного.

Препарат "Беталейкин", содержащий ЧСА: ИЛ-1б = 40:1, вводился после разведения в 500 мл изотонического 0,9% раствора натрия хлорида путем 30-90 минутной внутривенной капельной инфузии один раз в день ежедневно в течение 5 дней в дозе 20 нг/кг веса больного. В результате применения препарата наблюдалось прогрессивное нарастание числа лейкоцитов периферической крови, которое после окончания курса лечения превысило исходный уровень (до назначения химиотерапии) на 311%. Больной отмечал улучшение самочувствия, снижение симптомов интоксикации. Через неделю после окончания курса лечения "Беталейкином" число лейкоцитов периферической крови составляло 4,8•10^-9/л.

Применение препарата позволило в короткие сроки восстановить сниженное до критического уровня число лейкоцитов и проводить больному плановую противоопухолевую терапию.

Пример 4. Влияние "Беталейкина" на содержание лейкоцитов в периферической крови у больных с миелодепрессией, вызванной цитостатиками.

По методике примера 3 с использованием различных доз препарата проводилось лечение группы больных с миелодепрессией. Полученные результаты приведены в таблице 3-5 (см. в конце описания).

Как следует из вышеприведенных данных, пятидневный цикл применения "Беталейкина" в разовых дозах 10 - 17 нг/кг массы тела вызывает быстрый (в среднем через 3 дня) и выраженный подъем числа лейкоцитов в периферической крови у больных с индуцированной цитостатиками лейкопенией II-III степени. Этот подъем (в среднем на 173%) колеблется в пределах 123-357% от лейкопенического фона, причем содержание лейкоцитов в периферической крови составляет в среднем 4,7•10⁹/л, т.е. 273% от наблюдавшегося перед применением "Беталейкина" и доходит до 90% от исходного ("нормального"), зарегистрированного перед началом химиотерапии.

Пример 5. Лечение лейкопении, вызванной применением цитостатиков и облучения, у больного лимфомой при подкожном введении препарата Беталейкин.

Больной А. поступил в клинику Института онкологии им. Н.Н.Петрова с диагнозом "Лимфома". Проведенная схема комбинированной химиотерапии и радиотерапии по поводу основного заболевания привела к снижению числа лейкоцитов до 0,7•10^-9/л. Самостоятельно число лейкоцитов не имело тенденции к восстановлению в течение 2 недель, что затрудняло продолжение противоопухолевой терапии и привело к ухудшению самочувствия больного.

"Беталейкин", содержащий 2 мг лактозы на ампулу, при соотношении ЧСА: ИЛ-1б = 30:1, вводился после разведения ампулы с препаратом в 2,0 мл изотонического 0,9% раствора натрия хлорида путем ежедневных подкожных инъекций один раз в день в течение 5 дней в дозе 12,5 нг/кг веса больного.

По окончании курса лечения число лейкоцитов достигло исходного уровня до начала комбинированной противоопухолевой терапии (4,2•10^-9/л), а через 5 дней превысило его на 38%. Лабораторные показатели состояния иммунной системы свидетельствовали, что помимо лейкоцитостимулирующего эффекта "Беталейкин" увеличивал количество тромбоцитов в периферической крови, а также оказывал системное иммуностимулирующее действие.

Применение препарата позволило в короткие сроки восстановить сниженное до критического уровня число лейкоцитов и тромбоцитов и повысить иммунологическую реактивность. Проведенное лечение "Беталейкином" позволило избежать геморрагических и инфекционных осложнений и проводить больному запланированную схему противоопухолевой терапии.

Пример 6. Применение препарата "Беталейкин" для лечения вторичного посттравматического иммунодефицита.

Раненый К., 20 лет, поступил в клинику Военно-полевой хирургии Военно-медицинской академии по поводу огнестрельного ранения таза с повреждением мочевого пузыря, внебрюшинного отдела прямой кишки, осложнившегося острой массивной кровопотерей, шоком 2 степени. После проведения первичной хирургической обработки ран течение травматической болезни у данного больного осложнилось нагноением раны ягодичной области, развитием двухсторонней бронхопневмонии, синдрома системной воспалительной реакции. Указанные осложнения возникли на фоне вторичного посттравматического иммунодефицита и были резистентны к традиционному лечению в течение 2 месяцев. Комплекс лечебных мероприятий был дополнен курсом иммунокорригирующей терапии с применением препарата "Беталейкин", полученным по примеру 1, в виде курса из 3-х внутривенных инфузий препарата с интервалом в один день в дозе 5 нг/кг массы тела больного. После курса применения "Беталейкина" у больного отмечено быстрое улучшение общего состояния за счет нормализации температуры тела, очищения и активного заживления раны ягодичной области, разрешения бронхопневмонии, улучшения сна и аппетита. При иммунологическом обследовании выявлено, что после лечения "Беталейкином" у больного наблюдалась отчетливая активация клеточного звена иммунитета, что выражалось в увеличении количества T-лифоцитов периферической крови, нормализации продукции цитокинов, стимуляции макрофагальной активности. Анализ динамики показателей формулы крови выявил снижение лейкоцитоза, лейкоцитарного индекса интоксикации и уменьшение сдвига формулы крови влево после проведенного курса терапии "Беталейкином". Течение восстановительного периода было благоприятным. Больной выписан и вернулся к активной жизни.

Пример 7. Местное применение препарата "Беталейкин" для лечения хирургической вяло текущей гнойной раны.

У больной Т. после плановой операции по поводу рака прямой кишки развилось послеоперационное осложнение в виде несостоятельности послеоперационного шва с развитием вяло текущей гнойной раны. Лечение традиционными методами с использованием промывания раны антибиотиками, наложения повязок с мазью Вишневского или Солкосерилом не дало положительного результата.

"Беталейкин" применялся для нанесения на рану в виде раствора после очищения раны от гноя и некротизированных тканей. С этой целью ампулу с препаратом вначале разводили в 1,0 мл изотонического 0,9% раствора натрия хлорида, а затем доводили концентрацию путем разведения тем же раствором до 10 нг/мл. Полученный раствор наносили на рану ежедневно один раз в день в момент перевязки раны в течение 7 дней.

В результате применения препарата "Беталейкин" отмечалось быстрое очищение раны от гноя, а в последующем ускоренное заживление гранулирующей раны. Применение "Беталейкина" позволило добиться полного заживления раны и отказаться от использования других методов лечения. При местном использовании препарата не отмечалось никаких признаков системных побочных реакций.

Лечение "Беталейкином", как показали проведенные эксперименты, основывается на методах иммунозаместительной терапии, когда в организм больного вводится естественный защитный медиатор, обеспечивающий активацию противоинфекционного иммунитета. Иммунозаместительная терапия цитокинами, в частности интерлейкинами, является новым шагом на пути развития иммунофармакологии, так как применение готового медиатора, синтезируемого клетками организма, отличается от использования различных широко распространенных препаратов индукторов цитокинов. Эффективность последних часто невысока как за счет того, что механизм действия подобных препаратов связан с необходимостью индукции синтеза эндогенных медиаторов иммунитета, так и с превращениями, происходящими с препаратом до поступления его в целевые зоны организма, а при иммунодефицитных состояниях клетки, ответственные за синтез, уже не способны адекватно ответить на внешнюю стимуляцию.

Иммунозаместительная терапия "Беталейкином", напротив, особенно эффективна при иммунодефицитных состояниях, которые сопровождают многие инфекционные заболевания и травмы, или когда локальная инфекция развивается на фоне уже имеющегося иммунодефицита. В этих случаях введенный препарат восполняет дефицит эндогенных медиаторов иммунитета, в первую очередь, самого эндогенного ИЛ-1, и оказывает эффективное лечебное действие.

Изобретение касается лекарственных препаратов иммуномодулирующего действия. Препарат состоит из смеси человеческого сывороточного альбумина и интерлейкина-1-бета при соотношении масс 20-60:1. Препарат может дополнительно содержать лактозу в дозе 1-3 мг на 1 мкг препарата. Препарат "Беталейкин" обладает способностью стимулировать лейкопоэз в условиях его глубокого угнетения при токсической лейкопении, в том числе при так называемой "фебрильной нейтропении", обусловленной применением отдельных цитостатиков или их комбинаций при терапии злокачественных опухолей. Препарат оказывает эффективное лечебное действие при лейкопении, вызванной воздействием ионизирующего излучения, и обладает радиозащитными свойствами. Препарат обладает ярко выраженным иммуностимулирующим действием и применяется для лечения вторичных иммунодефицитных состояний, вызванных хирургическими вмешательствами и травмами. Вьюкоактивный иммуномодулирующий препарат "Беталейкин" свободен от аллергизирующих примесей и балластных белков, нереактогенен и обладает хорошей толерантностью конечной формы. 2 з.п.ф-лы, 5 табл.

1. Иммуномодулирующий препарат на основе интерлейкина, отличающийся тем, что дополнительно содержит человеческий сывороточный альбумин, а из интерлейкинов - интерлейкин-1-бета, взятых в соотношении масс 20 - 60 : 1 соответственно. 2. Препарат по п. 1, отличающийся тем, что он дополнительно содержит лактозу в дозе 1 - 3 мг на 1 мкг препарата. 3. Препарат по п. 1, отличающийся тем, что в качестве интерлейкин -1-бета он содержит генно-инженерный продукт, полученный культивированием бактерии Escherichia coli штамм C600 и выделенный из культуральной жидкости с использованием методов ион-гидрофобной хроматографии.