ИММУНОСТИМУЛЯТОР И ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ Российский патент 1998 года по МПК A61K38/05 

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммуностимуляторам и препаратам на их основе.

Известно применение в медицине большого количества иммуностимуляторов, таких как препараты женьшеня и лимонника, производные никотиновой кислоты, тималин и т.д. /Машковский М.Д. Лекарственные средства, т.II, М., Медицина, 1988 г. , стр. 169/. Недостатком большинства природных препаратов является невысокая активность в связи с низким содержанием активного начала, наличие побочных эффектов.

Известно значительное количество иммуностимуляторов пептидной природы, например, тактивин /пат. Франции, N 2570278, кл. A 61 K 39/41/, тимозин /Goldstein A. L. et al, Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 1972, v. 69, p. 1856-1863/, полученных из природного сырья. Эти препараты представляют собой набор полипептидов различной длины, воздействующих на различные звенья иммунного ответа, а также на ряд других физиологических функций организма, что ведет к появлению нежелательных побочных эффектов. Кроме того, практическое использование таких препаратов затруднено в связи со сложностью способов их извлечения из природного сырья, малым выходом, значительной вариабельностью их физико-химических свойств.

Поиск синтетических пептидов с селективной активностью на счет изменений структуры представляется более целесообразным. Синтетическими пептидными иммуностимуляторами являются пептид Glu-Asp-Ser-Ser-Thr-Gly-Trp-Asp-OH /пат. США N 4478828, кл. A 61 K 37/00, C 07 C 103/52, 1984/, аналоги тимопентина /Евр. пат., кл. C 07 K 7/64, 1985, пат. США 5013723, кл. A 61 K 37/02, 1991 г./ и т.п.

Еще больший интерес представляет создание пептидных иммуностимуляторов на основе коротких, селективно действующих высокоактивных пептидов, синтез которых является экономически выгодным.

Прототипом заявляемого изобретения являлся препарат "Тимоген", полученный на основе пептидной субстанции H- α -L-Glu-L-Trp-OH.

Задачей, стоящей перед авторами, являлось создание более эффективного иммуностимулятора на основе "коротких" пептидов и разработка препарата, в который он входит в качестве активного начала.

Задача решалась созданием дипептида H- γ -L-Glu-L-Trp-OH, который оказался активным иммуностимулятором, получившим условное наименование "Бестим" (заявка на торговую марку N 94008579 от 15.03.94) и послужившим активным началом лекарственного препарата, содержащего 0,001-0,01 мас% указанного пептида в виде соответствующей соли и разбавитель.

Получение лекарственного препарата осуществляют по стандартным технологиям получения лекарственных форм фармпрепаратов, а именно путем добавок к действующему началу фармацевтически подходящих солей и неорганических и органических кислот, например, хлористоводородной, серной, фосфорной, гликолевой, молочной, лимонной и соответствующего растворителя, не вызывающего нежелательных побочных эффектов, таких, например, как желудочно-кишечные дискомфорты, лихорадки и т.п.

В качестве разбавителя в зависимости от формы введения препарата используют раствор, содержащий 0,9% NaCl и 0,5% новокаин для внутреннего и внутримышечного введения, или крахмал, глюкозу, глицин и их смеси для перорального применения.

Действие препаратов на основе "Бестим" оказалось наиболее эффективным для лечения вторичных иммунодефицитов, развивающихся, например, у больных с хирургической инфекцией и онкологических больных. Под влиянием препарата наблюдается значительное усиление экспрессии θ -антигена и продукции интерлейкина-2 лимфоцитами, а также увеличение процентного и абсолютного содержания CD3 и CD4 лимфоцитов.

Препарат не токсичен, так как при 1000-кратном превышении терапевтической дозы (1 мг/кг) летальный исход не был обнаружен ни у одного животного.

"Бестим" получают стандартной технологией пептидного синтеза на твердой фазе /J.M.Steward and J.D.Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969/, или путем синтеза в растворе/ E.Schroder and K. Lubke, "The Peptides", Vol.1, Academic Press (New York), 1965/ с последующим отщеплением защитных групп и очисткой конечного продукта с использованием гель- и обращеннофазовой хроматографии. Индивидуальность полученной пептидной субстанции подтверждается данными ВЭЖХ и аминокислотного анализа гидролизата пептида.

Полученная субстанция пептида в виде соответствующих солей и добавок соответствующих наполнителей и разбавителя используется для приготовления препарата "Бестим".

Практическая применимость изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Синтез пептида "Бестим"
0,6 г (0,0018 мол) α -бензилового эфира N-трет.-бутилоксикарбонил-L-глутаминовой кислоты растворяют в 2.0 см³ диметилфорамида, прибавляют 0,2 г (0,0018 мол) N-оксисукцинимида, охлаждают до минус 5^oC и при сильном перемешивании приливают к реакционной смеси раствор 0,37 г (0,0018 мол) N,N-дициклогексилкарбодиимида в 2,0 см³ диметилформамида. Смесь перемешивают при 0^oC 1 час и оставляют на 12 часов при комнатной температуре. Отфильтровывают дициклогексилмочевину, прибавляют к фильтрату 0,72 г (0,0022 мол) гидрохлорида бензилового эфира L-триптофана и 0,3 см³ (0,0023 мол) триэтиламина и перемешивают реакционную смесь 16 часов при комнатной температуре. Раствор фильтруют, разбавляют 50,0 см³ воды и экстрагируют три раза 40 см³ этилацетата. Объединенные органические экстракты промывают последовательно 20,0 см³ воды, два раза по 20,0 см³ 2 н серной кислоты, два раза по 20,0 см³ насыщенного раствора хлористого натрия и сушат безводным сернокислым натрием.

Упаривают полученный органический раствор при пониженном давлении, остаток обрабатывают 16,0 см³ 50% раствора трифторуксусной кислоты в хлористом метилене в течение 45 минут, снова упаривают при пониженном давлении и прибавляют 25,0 см³ изопропилового спирта.

К полученному раствору 0,3 г (0,00048 мол) трифторацетата дибензилового эфира γ -дипептида прибавляют 0,16 г (0,00096 мол) кислого углекислого натрия и 0,18 г (0,0024 мол) формиата аммония. Реакционную смесь нагревают до 50^oC, прибавляют небольшими порциями 5,0 г 10% палладия на угле, суспензированного в 25,0 см³ воды и перемешивают в течение 30 минут. Отфильтровывают катализатор, упаривают изопропиловый спирт при пониженном давлении, водный раствор лиофилизуют, прибавляют к остатку 20,0 см³ воды и снова лиофилизуют.

Полученный лиофилизат очищают обращеннофазовой хроматографией на колонке Ultraprep C18, в градиенте (10-30%) ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте. Содержание основного вещества по данным оптической плотности не менее 97%. Соотношение аминокислотных остатков в гидролизате пептида соответствует теоретическому.

Пример 2. Сравнительный анализ влияния препаратов "Бестим" и "Тимоген" на дифференцировку предшественников T-лимфоцитов костного мозга мышей.

Взвесь клеток костного мозга мышей, умерщвленных дислокацией шейных позвонков, получают путем промывания бедренных костей физиологическим раствором. Пептиды в различных концентрациях добавляют к полученным клеткам в среде Игла и инкубируют в течение часа при 37^oC. Уровень экспрессии маркера дифференцировки T-лимфоцитов θ -антигена определяют методом комплемент зависимого цитолиза с помощью антител к θ -антигену. /Merasabi P.I. et al. in Manual of Tissue Tuping Techniques, National Institute of Health, Bethesda, 1972, p.50-55/. данные приведены в таблице 1.

Согласно приведенным данным, препарат "Бестим" вызывает усиление дифференцировки предшественников T-лимфоцитов в широком диапазоне доз от 100 до 0,001 мкг/мл и более активен по сравнению с препаратом "Тимоген".

Пример 3. Сравнительный анализ влияния препаратов "Бестим" и "Тимоген" на продукцию интерлейкина-2 мышиными спленоцитами.

Иммуномодулирующая активность препарата "Бестим" оценивалась также по индукции синтеза главного ростового фактора T-лимфоцитов-интерлейкина-2 /Gillis S.et al., J.Imminol., 1978, v.120, p.2027-2032/.

Данные приведены в таблице 2.

Согласно приведенным данным, препарат "Бестим" вызывает усилие продукции интерлейкина-2 в дозах от 100 до 0,001 мкг/мл.

Пример 4. Использование препарата "Бестим" для коррекции иммунодефицита, вызванного сепсисом.

Больной Т-в, 70 лет поступил в клинику ГКБ N 24 г. Москвы с диагнозом: "Сепсис" в тяжелом состоянии. У больной лабораторно подтвержден иммунодефицитный синдром, возникший на фоне бактериального сепсиса. Препарат "Бестим" применен для иммунокоррегирующего лечения в виде курсовой терапии (5 ежедневных внутримышечных инъекций по 0,1 мг ацетата пептида в изотоническом растворе хлористого натрия). Результаты лечения приведены в таблице 3.

Согласно приведенным данным, использование препарата "Бестим" вызывало увеличение содержания в периферической крови общих лимфоцитов, фракции T-лимфоцитов и субпопуляции T-лимфоцитов хелперов. На фоне улучшения иммунологических показателей состояние больного удовлетворительное, отмечено снижение лифорадки и улучшение гемодинамических показателей.

Пример 5. Использование препарата "Бестим" для коррекции иммунодефицита у онкологических больных.

Больная Х-а, 44 года, находилась в клинике ГКБ и 24 г. Москвы с диагнозом: "Рак толстой кишки". У больной отмечалось иммунодефицитное состояние, развившееся на фоне основного заболевания. Препарат "Бестим" применен для коррекции иммунодефицита в виде курсовой терапии (5 ежедневных внутримышечных инъекций по 0,1 мг ацетата пептида в 5% водном растворе глицина). Результаты лечения приведены в таблице 4.

Пример 6. Использование препарата "Бестим" для коррекции иммунодефицита, связанного с удалением вилочковой железы.

Больная Г-а, 18 лет, поступила в клинику ГКБ N 24 г. Москвы по поводу иммунодефицитного состояния, развившегося в связи с удалением вилочковой железы. Препарат "Бестим" применен для коррекции иммунодефицита в виде курса из 5 ежедневных внутримышечных инъекций по 0,1 мг ацетата пептида в 6% растворе полиглюкина в изотоническом растворе хлористого натрия. Результаты лечения приведены в таблице 5.

В результате лечения препаратом "Бестим" у больной отмечено восстановление содержания общей фракции лимфоцитов и субпопуляции T-лимфоцитов до уровня нормальных показателей. Больная выписана в удовлетворительной состоянии.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммуностимуляторам и препаратам на их основе. Сущность изобретения заключается в том, что в качестве иммуностимулятора предлагается препарат, содержащий активное начало - пептид H-γ-L-GLu-L-Trp-OH, при его содержании в препарате 0,001-0,01 мас.%, и соответствующий разбавитель. Технический результат заключается в создании более эффективного иммуностимулятора на основе "коротких" пептидов. 2 с.п. ф-лы, 5 табл.

1. Пептид H-γ-L-Glu-L-Trр-OH, обладающий иммуностимулирующей активностью. 2. Средство, обладающее иммуностимулирующей активностью, содержащее дипептид и фармакологически приемлемую добавку, отличающееся тем, что в качестве дипептида содержит H-γ-L-Glu-L-Trр-OH в количестве 0,001 - 0,01 мас.%.