СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, конкретно - к иммунологии, и касается способов определения функциональной активности лимфоцитов периферической крови.

Известен способ определения функциональной активности лимфоцитов периферической крови путем реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) с предварительным выделением суспензии лимфоцитов [2]. Однако данный способ предполагает выделение чистой суспензии лимфоидных клеток, которое приводит к нарушению соотношения различных форм лейкоцитов, к потере лимфоцитов к изменению их реактивности [3].

Наиболее близким по технической сущности является способ определения функциональной активности лимфоцитов периферической крови в РБТЛ с цельной кровью с использованием в качестве митогена фитогемагглютамина (ФГА), заключающийся в заборе крови, помещении ее в питательную среду и проведении РБТЛ с митогеном ФГА [1].

Однако предлагаемый способ основан на использовании в качестве митогена вещества, не контактирующего обычно в физиологических условиях с лимфоцитами (ФГА), что снижает информативность способа.

Целью изобретения является повышение информативности способа путем приближения условий опыта к физиологичным. Поставленная цель достигается путем забора венозной крови и проведения РБТЛ с цельной кровью, причем в качестве митогена используют предварительно обработанную и пропущенную через антибактериальный фильтр слюну.

Предлагаемое решение является новым, т.к. в проанализированной автором патентной и научно-медицинской литературе не найдено данной совокупности отличительных признаков.

Предлагаемый способ соответствует критерию изобретения "изобретательский уровень", т.к. данная совокупность отличительных признаков не вытекает явным образом для специалистов.

Предлагаемый способ соответствует критерию изобретения "промышленно применимо", т.к. он может успешно использоваться в клинической иммунологии.

Способ осуществляют следующим образом:
1. Забирают из вены 4 - 5 мл венозной крови и смешивают ее с 0,5 мл гепарина в концентрации 50 ЕД/мл. Содержимое пробирки тщательно перемешивают.

2. Подготовка питательной среды.

В качестве питательной среды используется среда 199 с гепарином (конечная концентрация гепарина 5 ЕД/мл) и растворами антибиотиков (пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/мл каждого антибиотика на 1 мл среды).

3. Обработка слюны.

Нестимулированную слюну (1 мл) собирают утром натощак после однократного полоскания водопроводной водой. В центрифужной пробирке слюну помещают на лед. После замораживания оттаивают при комнатной температуре и центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин на холоде (4^oC) для осаждения балластных белков. Супернатант собирают и в стерильных условиях пропускают через антибактериальный фильтр.

4. Проведение РБТЛ.

В стерильные флаконы наливают 2 мл среды 199 с антибиотиками, вносят 0,2 мл гепаринизированной крови и 0,2 мл аутологичной слюны. Флаконы помещают на 3 суток в термостат при 37^oC. Каждый день флаконы встряхивают.

5. Учет интенсивности бласттрансформации лимфоцитов.

Содержимое флаконов переливают в центрифужные пробирки, центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин. Надосадок отбрасывают, а осадок ресуспендируют и готовят мазки, которые фиксируют и окрашивают по методу Романовского-Гимза. Подсчитывают число бластных форм на 100-300 клеток. Рассчитывают отношение бластных форм к общему количеству лимфоцитов и выражают результат в процентных единицах.

Обоснование.

Митогенные свойства слюны, в первую очередь, обусловлены продуктами жизнедеятельности микроорганизмов, колонизирующих слизистые оболочки ротовой полости. При нарушениях в системе иммунитета меняется качественный и количественный состав микрофлоры слизистых, следствием чего является изменение митогенной активности слюны. Использование в качестве митогена в РБТЛ аутологичной слюны позволяет, таким образом, ценить индивидуальный для каждого обследуемого уровень сенсибилизации лимфоцитов периферической крови к антигенам микроорганизмов, заселяющих слизистые оболочки ротовой полости, и косвенно оценить степень выраженности нарушений в функционировании иммунной системы.

Предварительное фильтрование слюны через антибактериальный фильтр позволяет исключить внесение живых бактерий в культуру лимфоцитов и их размножение, которое существенно и непредсказуемо исказило бы результаты способа.

Конкретный пример выполнения способа.

В январе-феврале 1995 года на кафедре клинической иммунологии и аллергологии СГМУ проведено обследование 4 здоровых добровольцев и 4 пациентов с аутоиммунным диатезом в возрасте от 17 до 30 лет с использованием РБТЛ с аутологичной слюной и РБТЛ, стимулированной ФГА. Результаты исследования приведены в таблицах 1 и 2.

Интенсивность РБТЛ в группе здоровых добровольцев.

Примечание:
X - средняя выборочная характеристика показателей;
x - ошибка выборочной средней.

Предлагаемый способ обладает в сравнении с известными способами большей точностью и информативностью. По результатам РБТЛ, стимулированной ФГА, две клинические группы не различаются между собой. Среднестатистические значения интенсивности РБТЛ с ФГА в обеих группах и у каждого из пациентов в отдельности соответствуют норме РБТЛ для здоровых людей. Интенсивность РБТЛ с аутологичной слюной у больных с аутоиммуным диатезом более, чем в пять раз превышает уровень РБТЛ со слюной в группе здоровых с достоверностью P < 0,001 и подтверждает наличие иммунопатологического процесса у пацентов данной группы.

Список цитируемой литературы
1. Пастер Е.У., Овод В.В. Пазур В.К. Иммунология: Практикум - К.: Выща шк. Изд-во Киев. ун-та, 1989, 304 с.

2. Иммунологические методы/ Под ред. Г.Фримеля. Пер. с нем. - М.: Медицина, 1987, 472 с.

3. Report of UNIS/WHO working group: Use and abuse of laboratory tests in clinical immunology. Critical consideration of eight widely used diagnostics procedures: Geneva. - 1981. - v. 5. - p. 18-20.

Способ может быть использован в области медицины, в частности в иммунологии и позволяет повысить информативность за счет приближения условий опыта к физиологичным. Осуществляют забор венозной крови и проводят реакцию бласттрансформации лимфоцитов с митогеном, в качестве которого используют аутологическую слюну, предварительно обработанную путем однократного полоскания, помещения на лед для замораживания, затем оттаивания при комнатной температуре и центрифугирования на холоде при 4^oС и пропущенную через антибактериальный фильтр. 2 табл.

1. Способ определения функциональной активности лимфоцитов периферической крови, включающий забор венозной крови, проведение реакции бласттрансформации лимфоцитов с митогеном и учет интенсивности бласттрансформации лимфоцитов, отличающийся тем, что в качестве митогена используют аутологичную слюну, предварительно обработанную путем однократного полоскания, помещения на лед для замораживания, затем оттаивания при комнатной температуре и центрифугирования на холоду при 4^oC. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что предварительно обработанную слюну пропускают через антибактериальный фильтр.