Способ получения плазмидной ДНК Советский патент 1984 года по МПК C12N15/00 C07H21/04 

to

со

00 Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для решени научно-исследовательских и прикладны задач при выделении и очистке плазми ной ДНК в упомянутой области, а такж в микробиологии, медицине, генной инженерии. Плазмидная ДНК является объектом., используемым в генной инженерии в качестве векторных молекул, а также как субстрат для многих ферментов, в том числе эндонуклеаз рестрикции, как тест-ДНК. Известен способ получения плазмид ной ДНК из бактериальных клеток., Кле ки суспендировали в буфере, разрушал лизоцимом, балластные белки отделяли с помощью додецилсульфата натрия. Дл очистки препарата использовали хлоро форм, изоамиловый спирт и фенол. Пополучаемый препарат ДНК содержит много примесей хромосомальной ДНК и РНК D Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ получения ковалентно-замкнутой кольцевой плазмидной ДНК, включающий еледущие стадии; суспендирование бактериальных клеток в трис-буфере содержащем глюкозу, лизоцим, инкубирова ние при О, лизис щелочным раствором додецилсульфата натрия, нейтрализад ш ймеси ацетатом натрия и центрифугиррвание. Плазмидную ДНК дважды переосаждают спиртом и гшкубируют с .РНКазой 2. Однако для известного способа характерен недостаточно высокий выход целевого продукта. Целью изобретения является увеличение выхода плазмидной ДНК. Постайленная цель достигается тем, что согласно способу получения плазмидной ДНК из микробной биомассы включающему лизис клеток, центрифу гирование, осаждение целевого про;дукта из надосадочной жидкости спиртом очистку от примесей РНК с помощью РНКазы, лизис клеток проводят щелочным раствором додецилсульфата натрия при соотношении биомасса : буферньй раствор : щелочной раствор додецилсульфата натрия 1:19(37-45), а очист ку от РНК осуществляют РНКазой в присутствии 1,0-2,0 мМ ЭДТА. Способ осуществляют следующш образом. Повышение выхода обеспечивается за счет сохранения суперспирапьной структуры ДНК в процессе лизиса. Понижение количества додецилсульфата натрия и натра едкого, которые в среду вводятся в определенных соотношениях, т.е. в количествах, определяющих возможность регулирования лизиса с целью сохранения ковалентно связанной кольцевой плазмидной ДНК, а условия инкубации обеспечивают разделение ковалептно-замкнутой кольцевой . плазмидной ДНК от балластных веществ. Условия лизиса и инкубации предотвращают релаксацию ковалентно-замкнутой кольцевой плазмидной ДНК в линейную и открытую кольцевую ДНК. Предлагаемый способ обеспечивает накопление ковалентно-замкнутой кольцевой плазмидной ДНК 95-96%. Процесс очистки от РНК проводят ферментом РНКазой (0,8-0,81 мкг на 1 мг суммаррых рибонуклеиновых кислот) в присутствии 1,0-3,0 мМ ЭДТА (динатриевая соль этилендиамин N - N - N - N -тётрауксусной кислоты). Введение ЭДТА подавляет активность нуклеаз, так как нуклеазы являются металлозависимыми ферментами, Э/ГГА связывает ионы металла и ферментный центр инактивируется. В предлагаемых условиях присутствие ЭДТА активирует каталитическую способность РНКазы, так как РНКаза не является металлозависимым ферментом- Присутствие ЭДТА напротив повышает ее активность. Предлагаемый способ направлен на сохранение структ;уры плазмидной ДНК, конфигурации ее цепи, на предотвращение раскручивания цепи. Цепи удерживаются вместе благодаря образованию трех водородных связей 1ежду гуанином (G) и цитозином (Ц) и двух водородных связей между аденином (А) и тимином (т). Однако стабильность двойной спирали в основном определяется взаимодействием параллельно-J(-злектронных систем оснований. Пример 1.40г биомассы Eicherichia coli НВ 101 ресуспендируют в 750 г буфера, состоящего из мМ:ЭДТА 10, глюкоза 50, трис-HCf 25, рН 8,0. Добавляют 1,5 кг 0,8%-ного додецилсульфата натрия в 0,1 н МаОН и перемешивают в течение 5 мин при комнатной температуре. Смесь нейтрализуют добавлением 1,075 кг ЗМ ацетата натрия, рН 4,8. Оставляют при О - -4С в течение 1 ч.рсадок отделяют центрифуги311рованием. Супернатант, содержащий плазмидную ДНК, дважды переосаждают охлажденньп этанолом (6,65 кг). Полу ченньй осадок после центрифугировани ресуспендируют в 50 мл буфера, состо ящего из мМ: трис-НС 10, рН 7,6, МаСв 10, ЭДТА 10, добавляют активированную РНКазу из расчета 50 мкг на 700 млсумма-таых рибонуклеиновых кислот и инкубируют 30 мин при . Инкубат дваждь перёосаждают охлажден ным эталоном.Осадок ресуспендируют, в 20 мл буфера, состоящего из, мМ: трис--нсе 10, рН 7,6, NaCC 10, 10. Концентрацию ДНК плазмиды определяют по формуле С А 260 -а 50, где С - концентрация плазмидной ДНК, мкг/мл;. А-.,..- оптическая. плотность при длине волны 260 нм; а - кратность разбавления; 50 - коэффициент, соответствующий 1 оптической единице йри .цлине волны 260 нм, мкг/мл; 1520 мкг/мл С 0,76-40:50 1,52 мг/мл. Общий выход ДНК плазмиды 30,4 мг при объеме 20 мл 0,076%. Содержание ковалентно-замкнутой кольцевой ДНК 95%. Пример 2. 40 г биомас.сы Eicherichia coli НВ 101 ресуспендиРЗЖ)Т в 750 г буфера, состоящего из, мМ: ЭДТА 10, глюкоза 50,трис-НС 25, рН 8,0. Добавляют 1,7 кг 0,8%-ного 3 .4 додецилсульфата натрия в 0,1 н. NaOH и перемешивают, в течение 5 мин при комнатной температуре. Смесь нейтрализуют добавлением 1,2 кг ЗМ ацетата, натрия,.рН 4,8. Далее процесс проводят по примеру 1 , но в буфере для инкубации с РНКазой концентрацию ЭДТА доводятдо 2,0 мМ. Концентрацию ДНК определяют по Формуле С з 50 0,68-4050 1360 мкг/мл 1,36 мг/мл. Общий выход ДНК плазмиды 28 мг при объеме 20,6 мл 0,07 %. Содержание кoвaлeнтнo-зa кнyтoй кольцевой ДНК 95,5%. Приме р 3. 40 г биомассы Eicherichia coli НВ 101 ресуспендируют в 750 г буфера, состоящего из, мМ: ЭДТА 10, глюкоза 5П, трис-НСе 25, рН 8,0. Добавляют 1,82 кг 0,8%-ного додецилсульфата натрия в 0,1 н. NaOH и перемешивают в течение 5 мин при комнатной температуре. Смесь нейтрализуют добавлением 1,3 кг ЗМ ацетата натрия, рН 4,8.я. Далее процесс проводят по примеру 1, но R буфере для инкубации с РНКазой концентрацию ЭДТА доводят до 3,0 мМ. Концентрацию ДНК плазмиды s мкг/мл определяют по формуле С Az60-a-50 0,05-40-50 1300 мкг/мл 1,3 мг/мл. Общий выход ДНК плазмиды 27,3 мг при объеме 21,0 мл 0,068%. Содержание ковалентно-замкнутой кольцевой ДНК 96%.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Ш1АЗМВДНОЙ ДНК из микробной биомассы, включающий лизис клеток, центрифугирование, осаждение целевого продукта из надосадочной жидкрсти спиртом, очистку от примесей РНК с помощью РНКазы, о тличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, лизис клеток проводят щелочным раствором додецилсульфата натрия при соотношении биомасса : буферный раствор : щелочной; раствор додецилсульфата натрия 1 : 19 :