Способ выделения бактериальной ДНК Советский патент 1988 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано в генно- инженерных работах и бактериологических исследованиях.

Целью изобретения является упрощение способа выделения ДНК из бактериальных клеток, улучшение качества целевого продукта и повьюение безопас- ю нести работы с патогенными микроорга- низмамио

По предлагаемому способу весь процесс выделения ДНК проводят в один этап в закрытой центрифужной пробир- 15 ке. После одномоментной загрузки всех компонентов не требуется никаких по- следуЮ1цих манипуляций с лизатом вплоть до сбора целевого продукта. Этим дос- тигается сокращение числа операций в 20 ходе процедуры выделения целевого продукта, а также уменьшение времени контакта исследователя с исходным материалом, что приобретает особое значение при использовании для выде- 25 ленйя ДНК патогенных штаммов.

Бактериальные клетки вносят в центрифужную пробирку между двумя слоями лизирующей смеси, нижний из которых наслоен непосредственно на зО поверхность раствора хлористого цезия. Этим достигается мягкий и глубокий лизис, при котором ДНК полностью освобождается из клетки и легко отделяется от прочих продуктов деструкции клетки при последующем ультрацентрифугировании.

Такое внесение материала позвохи- ет отказаться от перемешивания лиза- 40 та и предотвратить повреждающие гидродинамические воздействия на освобо - дившуюся ДНК, В результате применения указанного методического приема пол-учаемьй продукт содержит меньше 00-45 вреждений и в меньшей степени, чем в случае использования известного ело-- соба, загрязнен примесями ДНК и б(ш- ка.

Предлагаемый способ позволяет ре- о гулировать полноту лизиса путем изменения времени инкубации клеток с лизирующей смесью, а следовательноо в отличие от известного может быть использован не только для получениягг плазМИД, но и для выделения хромосомной ДНК, Дополнительное обогащение продукта н: ткным типом ДНК (хромосомной или 1-шазмидной) осуществляется за счет изменения температурного режима при центрифугировании.

Пример 1. Выделение плазмиды рПС 4К из Escherichia coli НЕ 101.

Культуру бактериальных клеток выращивают на двух флаконах с 75 мп скошенного агара Хоттингера, рН 7,2, в течение суток при 37 С. Клетки смывают с агара 3 мл физиологического раствора.

В 36-миллилитровую полиапломерную центрифужную пробирку вносят 25 мл раствора: хлористьй цезий 25 г, бромистый этидий 2 мл (из основного расвора 5 мг/мп), TES-буфер 15 мл (состав TES-буфера: трис(гидроксиметил- аминометан) 5 мМ,динатриевая соль зтилендиаминтетрауксусной кислоты ЭДТА 0,5 мМ, NaCl 5 мМ, рН 8,0). На поверхность раствора хлористого цезия наслаивают 3 мл лизирующей смеси: бридж-58 1%, дезоксихолат натрия 0,5%, додецилсульфат натрия 0,1%, ЭДТА 10 мМ, лизоцим 5 мг/мл, бромистый этидий 0,5 мг/мл, трис 50 tM, рН 8,0. Уравновешивают пробирки, затем наслаивают 3 мл взвеси культуры в физиологическом растворе и еще 2 мл лизирующей см.еси. Помещают , про бирки в ротор, вьщерживают 3 ч при комнатной температуре, затем центрифугируют в ультрацентрифуге при 40000 об/мин (140000 g) при 10 с в течение 40 ч.

После центрифугирования пробирки облучают ультрафиолетовым светом и визуально определяют наличие плаз- мидной суперспирализованной ДНК, Затем прокалывают стенку пробирки иглой от шприца и собирают ДНК.

Собранную ДНК освобождают от бромистого этидия и переосаждают этанолом по известной методике. Преципита растворяют в 500 мкл TES-буфера и 1 мкл этого раствора подвергают анализу методом электрофореза в 0,7%-но агарозном геле.

П р и м е р 2. Выделение плазмид большой молекулярной массы.

Используют штаммы lersinia pestis несущие плазмиды pFtra/Tox ( 65 MD) pCad (47 МД), R.Pu (38 МД).

Культуру выращивают аналогично примеру 1, но при 28 С 2 сут. Выделение ДНК проводят в тех же условиях, что и в примере 1,

В отличие от мультикопийной плаз- ды рИК 4К крупные плазмиды представпены в клетке лишь единичным репли- коном, поэтому выход ДНК из одинакового количества биомассы соответственно меньше.

Пример 3. Выделение хромосо- мальной ДНК из Vibrio cholerae eltor RV 79.

Выделение ведут аналогично примеру 1, но время лизиса составляет 1,5 ч, а центрифугирование проводят при 20°С.

Таким образом, использование изобретения дает возможность получать высокоочищенную плазмидную и хромосомную ДНК более простым и безопасным, по сравнению с известными, способом.

Формула из обрет ения

1. Способ выделения бактериальной ДНК, включающий лизис клеток смесью детергентов и лизоцима и ультрацентрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия с бромистым этидием, отличающий ся тем, что, с

целью упрощения способа, улучшения

качества целевого продукта и повьппения безопасности работ с патогенными микроорганизмами, бактериальные клетки помещают.между двумя слоями лизирующей смеси, наслоенной на поверхность раствора хлористого цезия, и процесс выделения ДНК проводят в один этап в закрытой центрифужной пробирке.

2. Способ по п. 1, отличающий с я тем, что дпя выделения плазмидной ДНК лизис проводят в течение 3-4 ч.

3. Способ по п. 1, отличаю щ и и с я тем, что для выделения хромосомной ДНК лизис проводят в течение 1-1,5 ч, а центрифугирование - при температуре 18-22 с.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано в ген но-инженерных работах и бактериологических исследованиях. Целью изобретения является упрощение способа вьще- ления ДНК из бактериальных клеток, улучшение качества целевого продукта И повышение безопасности работы с патогенными микроорганизмами. Основное отличие предложенного способа состоит в том, что весь процесс выделения ДНК проводят в один этап в закрытой центрифужной пробирке. После одномоментной загрузки всех компонентов не требуется никаких манипуляций с лизатом вплоть до сбора целевого продукта. Этим достигается сокращение числа операций в ходе процедуры вьще- ления, а также уменьшение времени контакта, исследователя с исходным материалом. Принципиально важным методическим приемом, обеспечивающим возможность одноэтапного вьщеления ДНК, является способ внесения бактериальных клеток в центрифужную пробирку. Материал помещают между двумя слоями лизирующей смеси, нижний из которых наслоен непосредственно на поверхность раствора хлористого цезия. Предложенный метод лизиса клеток позволяет отказаться от перемешивания лизата и предотвратить повреждающие гидродинамические воздействия на освобождающиеся молекулы ДНК, а также обеспечивает полное освобождение ДНК из связи с РНК и белком. Вследствие этого целевой продукт содержит меньше повреждений и в меньшей степени, чем в случае использования известного способа, загрязнен примесями. Благодаря тому, что полнота лизиса в данном случае может регулироваться путем изменения времени контакта клеток с лизирующей смесью, изобретение может быть использовано не только для получения плазмидной ДНК, но и для вьщелейия хромосомного материала. 2 3 . п. лы. S (Л 4; со