АМИДИНПРОИЗВОДНЫЕ Российский патент 1999 года по МПК C07C257/14 A61K31/155 

Изобретение касается амидинпроизводных, способов их получения, содержащих их фармацевтических составов и их использования для лечебных целей, в частности в качестве ингибиторов NO-синтазы.

С начала 1980-х годов известно, что уменьшение напряжения сосудов (релаксация), вызванное ацетилхолином, зависит от наличия эндотелия, а его активность приписывают лабильному гуморальному фактору, именуемому фактором релаксации, производимым эндотелием /ФРЭ/. Активность оксида азота /NO/ как сосудорасширяющего средства, известна уже свыше 100 лет, NO является активным компонентом амилнитрита, глицерилтринитрита и других сосудорасширяющих средств на основе азота. Недавняя идентификация этого фактора как NO совпадает с открытием биохимического пути синтеза NO из аминокислоты 1-аргинина под влиянием фермента NO-синтазы.

NO представляет собой эндогенный стимулятор растворимой гуанилатциклазы и участвует в различных биологических процессах в дополнение к зависимой от эндотелия релаксации, включая цитотоксичность фагоцитных клеток и межклеточной связи в центральной нервной системе /см. Moncada и сотр., Biochemical Pharmacology, 38, 1709-1715 /1989/ и Moncada и сотр., Pharmacological Reviews, 43, 109-142 /1991//. В настоящее время считается, что избыток продуцирования NO может участвовать в различных состояниях, в частности состояниях, включающих системную гипотензию, например, таких, как токсический шок и лечение некоторыми цитокинами.

Синтез NO из L-аргинина можно ингибировать с помощью аналога L-аргинина L-N-монометиларгинина /L-NMMA/. Предлагается терапевтическое использование L-NMMA для лечения токсического шока и других типов системной гипотензии /WO 91/04024 и GB-A-2240041/. Предлагается также терапевтическое использование некоторых других ингибиторов NO-синтазы кроме L-NMMA для тех же целей /см. WO 91/04024 и EP-A0446699/.

Недавно были получены свидетельства того, что существует, по меньшей мере, два типа NO-синтазы, а именно:
1/ Конститутивный, Ca⁺⁺ /кальмодулин-зависимый фермент, который выделяет NO в ответ на раздражение или физическую стимуляцию;
2/ Независимый от Ca⁺⁺ - фермент, образующийся после активации сосудистой гладкой мышцы, макрофагов, клеток эндотелия и множества других клеток под влиянием эндоксина или цитокинов. Однажды выделенная эта вызванная NO-синтаза синтезирует NO в течение длительного периода времени.

NO, выделяющаяся под действием конститутивного фермента, действует по механизму трансдукции, лежащему в основе некоторых физиологических реакций. NO, образующаяся под влиянием индуцируемого фермента можно рассматривать как цитотоксическую молекулу для клеток опухоли и инфицирующих микроорганизмов. Очевидно также, что вредное действие избытка продуцируемого NO, в частности, патологического расширения сосудов и поражения тканей, может быть, в основном, результатом действия NO, синтезированного под влиянием индуцируемой NO-синтазы.

Предлагаемые до сих пор ингибиторы NO-синтазы, используемые для целей лечения, и в частности L-NMMA, являются неселективными, в том смысле, что они ингибируют как конститутивную, так и индуцируемую NO-синтазу. Используя такой неселективный ингибитор NO-синтазы следует принимать достаточно серьезные меры предосторожности во избежание потенциальных серьезных последствий перепродуцирования конститутивной NO-синтазы, включая гипотензию и возможный тромбоз и поражение тканей. В частности, в случае терапевтического использования L-NMMA для лечения токсического шока рекомендуется в процессе всего периода лечения держать под контролем давление крови пациента. Таким образом, хотя неселективные ингибиторы NO-синтазы и имеют применение в медицине при условии принятия соответствующих мер предосторожности, ингибиторы NO-синтазы, являющиеся селективными в том смысле, что они оказывают ингибирующее действие на NO индуцируемую синтазу в значительно большей степени, чем на конститутивную NO-синтазу, будут иметь более высокий терапевтический эффект и более удобны в использовании.

Настоящее изобретение касается амидинпроизводных формулы I

их солей и фармацевтически приемлемых эфиров и амидов, в которой R¹ представляет собой C_1-6-прямую или разветвленную алкильную группу, группу C_2-6-алкенила, C_2-6-алкинила, C_3-6-циклоалкила или C_3-6-циклоалкил C_1-6-алкильную группу,
Q представляет собой алкилен, алкенилен или алкинилен, имеющий 3-6 атомов углерода, который может быть необязательно замещен одной или несколькими C_1-3-алкильными группами;
Группу формулы -(CH₂)_pX(CH₂)_q, в которой p представляет собой число 2 или 3, q - число 1 или 2 и X представляет собой S(O)_x, где x - 0, 1 или 2, O или NR², где R² является H или C_1-6-алкилом, или же
Группу формулы -(CH₂)_rA(CH₂)_s, где r - число 0, 1 или 2, s - соответственно число 0, 1 или 2 и A представляет собой 3-6-членное карбоциклическое или гетероциклическое кольцо, которое необязательно может быть замещено одним или более из подходящих заместителей, например, таких как C_1-6-алкил, C_1-6-алкокси, гидрокси, галоген, нитро- и циано-группы, трифтор C_1-6-алкил, амин, C_1-6-алкиламино или ди-C_1-6-алкиламино.

Соединения формулы I могут содержать несколько асимметричных центров в молекуле в зависимости от конкретного значения различных групп, а формула I распространяется на все возможные изомеры. Если группа Q представляет собой группу алкенила, например -CH₂CH=CHCH₂-, то включаются оба E и Z изомера. Все соединения формулы I содержат в своем составе асимметричный центр в группе и, хотя естественная L или /S/ хиральность аргинина более предпочтительна, предполагается, что формула включает все возможные изомеры.

Группа A, представляющая собой карбоциклическое или гетероциклическое кольцо, может быть насыщенной, может иметь ненасыщенность этиленового типа и может быть ароматической. В случае гетероциклического кольца последнее может содержать один или более гетероатомов, которые обычно выбирают из группы N, O или S.

Фармацевтически приемлемые эфиры и амиды соединений формулы I могут иметь -CO₂H-концевую группу, замещенную на -CO₂R³, в которой R³ представляет собой, например, C_1-6-алкил, арил или арил C_1-3-алкил или -COR⁴, в которой R⁴ - остаток приемлемой натуральной или синтетической аминокислоты.

В соответствии с одним из аспектов настоящее изобретение представляет использование соединения формулы I с указанными выше значениями или его фармацевтически приемлемых солей, эфиров и амидов для производства лекарственных средств для лечения состояний, при которых показано ингибирование продуцирования NO из L-аргинина под действием NO-синтазы.

В соответствии с одним из аспектов, настоящее изобретение представляет способ лечения человека или животных, страдающих заболеванием, при котором рекомендуется ингибирование продуцирования из L-аргинина под действием NO-синтазы, включающий введение субъекту эффективного количества соединения формулы I, облегчающего это состояние, или его фармацевтически приемлемой соли, эфира или амидов.

Активность соединения в качестве ингибитора фермента NO-синтазы можно определить с помощью метода, при котором линию клеток макрофагоцитов /J774/ стимулируют к экспрессии NO-синтазы с помощью липополисахаридов /ЛПС/ и гамма-интерферона и образующийся оксид азота измеряют посредством его взаимодействия с гемоглобином или нитритом. Этот анализ очень удобен, однако он не дает возможности различать селективные и неселективные ингибиторы NO-синтазы. Селективные различия можно выявить при использовании метода анализа с использованием колец аорты крысы в опытах in vitro. Изначальный тканевый тонус используют для индикации активности конститутивной NO-синтазы, в то время как индуцированное липополисахаридами снижение тканевого тонуса, вызванного NO, используют для индикации активности индуцируемого фермента в клетках гладкой мышцы сосудов. Селективные различия можно также продемонстрировать с помощью анализа, основанного на измерении крови у крыс (конститутивный фермент) и давления крови у крыс, обрабатываемых липополисахаридами (индуцируемый фермент). Соединения формулы I проявляют активность как ингибиторы NO-синтазы в линии клеток J774 и как также удалось установить, множество соединений являются селективными ингибиторами кольцевой структуры аорты крыс, в частности, они являются в 10-40 раз более сильными ингибиторами индуцируемой NO-синтазы, чем конструктивной синтазы.

Состояния, при которых целесообразно ингибирование продуцирования NO из L-аргинина, включают в себя системную гипотензию на фоне септического и/или токсического шока, вызванного целым рядом агентов, лечение цитокинами, такими как TNF, IL-1 и IL-2, применение в качестве адъюванта для краткосрочного подавления иммунитета при трансплантации.

Существует также все увеличивающееся число данных, свидетельствующих о том, что существует также третий фермент NO-синтазы, участвующий в процессе перерождения хрящей, который может происходить при некоторых состояниях, таких как артрит; известно также, что NO-синтез увеличивается при ревматоидном артрите. Соответственно другие заболевания, при которых показано ингибирование производства NO из L-аргинина, включают аутоиммунные или воспалительные состояния, поражающие суставы, например артрит.

Термин "лечение", используемый здесь, включает также и профилактику пациента.

Ряд соединений формулы I являются новыми веществами; и в соответствии с другим аспектом изобретения предлагаются амидинпроизводные формулы IA

их соли, фармацевтически приемлемые эфиры и амиды, в которых:
R¹ представляет собой прямоцепной или разветвленный алкил, группу C_2-6-алкенила, C_2-6-алкинила, C_3-6-циклоалкила или C_3-6-циклоалкил-C_1-6-алкильную группу,
Q представляет собой алкилен, алкинилен или алкенилен с 3-6 C-атомами, который необязательно может быть замещен одним или несколькими C_1-3-алкильными группами.

Группу формулы -(CH₂)_pX(CH₂)_q, где p представляет собой число 2 или 3, q - соответственно 1 или 2 и X представляет собой S(O)_x, где x - 0, 1 или 2, кислород или NR², где R² является H или C_1-6-алкилом, или же
Группу формулы -(CH₂)_rA(CH₂)_s, в которой r - представляет собой число 0, 1 или 2, s - 0, 1 или 2 и A представляет собой 3-6-членное карбоциклическое или гетероциклическое кольцо, которое необязательно может быть замещено одним или более приемлемыми заместителями, такими как C_1-6-алкил, C_1-6-алкокси, гидрокси, галоген, нитро, циан, трифтор C_1-6-алкил, амин, C_1-6-алкиламино или ди-C_1-6-алкиламин; при условии, что Q не является ни CH₂CH₂CH₂, ни CH₂CH₂CH₂CH₂, в случае, если R¹ представляет собой метил.

В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение представляет также соединения формулы /IA/, имеющие указанные выше значения, из фармацевтически приемлемые соли, эфиры и амиды, применяемые в лечебных целях, в частности для лечения состояний, при которых целесообразно ингибирование продуцирования NO из L - аргинина под действием NO-синтазы.

Специфическими примерами для группы R¹ являются метил, этил, н-пропил, изопропил, циклопропил, пропенил, н-бутил, третбутил, циклобутил и циклопропилметил.

Специфическими примерами группы A, представляющей собой карбоциклическое или гетероциклическое кольцо, являются циклогексил, циклопентил, циклобутил, циклопропил, циклогексил, циклопентенил, циклобутенил, фенил, пиридил, пиперидинил, пирролил, пирролидинил, фуранил, тетрагидрофуранил, тиазолил, имидазолил и оксазолил. В любом случае кольцо может быть необязательно замещено на один или несколько приемлемых заместителей, таких как указанные выше заместители.

В частности, примерами Q могут быть алкилен-, алкинилен- и алкиниленгруппы формул:
-//CH₂/_n -, в которой n = 3 - 5,
-/CH₂/_v = CH/CH₂/_w, и
-/CH₂/_v ≡ C/CH₂/_w, в которых в любом случае v = 0 - 3 и w - соответственно 0 - 3, при условии, что сумма v + w равняется числу от 2 до 4.

Предпочтительной группой соединений формулы /I/ являются соединения, в которых:
R¹ представляет собой метил,
Q представляет собой -(CH₂)_n, где n = 3-5, более предпочтительно 3 или 4, -CH₂CH=CHCH₂-,
-(CH₂)_pX(CH₂)_q - , где p = 2 или 3, q - соответственно 1 или 1, X представляет собой S/O/_x, где x представляет собой число 0,1 или 2, более предпочтительно 0, кислород или NR², где R² является водородом или C_1-6-алкилом, особенно предпочтительно C_1-3-алкилом; или
-(CH₂)_r A(CH₂)_s, где r = 1 или 2, s = 1 или 2 и A представляет собой карбоциклическое или гетероциклическое кольцо, особенно предпочтительно одно из указанных выше специфических колец, в частности циклобутил, фенил или пиридил, с оговоркой, что группа имеет природную L или (S) хиральность, и их фармацевтически приемлемые соли, эфиры и амиды.

В частности, предпочтительной является группа соединений формулы /I/, в которых:
R¹ - метил,
Q представляет собой -(CH₂)_n - , где n = 3 или 4, =CH₂CH = CHCH₂-,
- (CH₂)₂SCH₂- или
-CH₂ACH₂ -, где A -циклопропил,
а также их фармацевтически приемлемые соли, эфиры и амиды.

Специфические предпочтительные соединения формулы /I/:
(S)-N⁵-(1-иминоэтил)орнитин,
(S)-N⁶-(1-иминоэтил)лизин,
(±)-E-2-амино-6-(1-иминоэтиламино)-гекс-4-еновая кислота и
(S)-S-2-(1-иминоэтиламино)этилцистеин,
а также их фармацевтически приемлемые соли, эфиры и амиды.

Настоящее изобретение охватывает соединения формулы /I/ в виде солей, в частности кислотно-аддитивных. Подходящие соли включают в себя соли, образуемые как с органическими, так и неорганическими кислотами. Такие соли обычно являются фармацевтически приемлемыми, хотя при получении и очистке предполагается использование и фармацевтически неприемлемых солей. Таким образом, предпочтительные соли включают в себя соли, образуемые при взаимодействии с соляной, бромистоводородной, серной, лимонной, винной, фосфорной, молочной, пировиноградной, уксусной, янтарной, щавелевой, фумаровой, малеиновой, щавелевоуксусной, метансульфоновой, этансульфоновой, п-толуолсульфоновой, бензолосульфоновой и изтионовой кислотами. Соли соединений формулы /I/ могут быть получены путем реакции соответствующего соединения в форме свободного основания с соответствующей кислотой.

Хотя соединения формулы /I/ можно вводить и сами по себе, предпочтительно их введение в виде фармацевтического состава. В соответствии с еще одним аспектом, настоящее изобретение представляет фармацевтический состав, включающий соединение формулы /I/ или /IA/ или фармацевтически приемлемую соль или раствор его, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями или носителями и необязательно одним или несколькими другими терапевтическими ингредиентами. Носитель или наполнитель должен быть "приемлем" в смысле совместимости с другими ингредиентами состава и не должен оказывать вредного действия или реципиента.

Составы представляют собой формы, приемлемые для орального, парэнтерального (включая подкожное, внутрикожное, внутримышечное, внутривенное и внутрисуставное), ректального и локального (включая кожное, защечное, подъязычное и внутриглазное) применения, хотя в большинстве случаев приемлемая форма определяется, например, состоянием здоровья и тяжестью заболевания реципиента. Составы обычно готовят в форме единичной дозы, и они могут быть получены в соответствии с методами, хорошо известными каждому специалисту. Все методы включают стадию объединения соединения формулы /I/ или его фармацевтически приемлемой соли или раствора /"активный ингредиент"/ с носителем, содержащим один или несколько дополнительных ингредиентов. В основном, составы готовят одинаково и хорошо знакомые формы активного ингредиента соединяют с жидкими наполнителями или тонко размельченными твердыми наполнителями или с тем и с другим, после чего, если это необходимо, придают продукту форму, необходимую для данного состава.

Представляемые изобретением составы, предназначенные для орального применения, могут иметь форму, состоящую из отдельных единиц, таких как капсулы, саше или таблетки, каждая из которых содержит заранее определенное количество активного ингредиента, а также порошков или гранул, растворов или суспензий в водосодержащих и не содержащих воду жидкостях, или же в форме жидких эмульсий масло в воде или вода в масле. Активный ингредиент может присутствовать в составе в виде шариков, лекарственных кашек или паст.

Таблетки можно получать, используя методы прессования или формовки, необязательно с одним или несколькими дополнительными ингредиентами. Для таблетирования пользуются специальной таблетирующей машиной, в которой активные ингредиенты подают в виде свободного потока, например в форме гранул, необязательно смешанного со связующими средствами, смазывающими /скользящими/ средствами, инертными разбавителями, маслянистыми добавками, поверхностно-активными веществами или диспергирующими веществами. Изготовление таблеток по принципу формования производят в спефиальной формовочной машине, куда загружают порошкообразное соединение, смоченное жидким инертным разбавителем. Таблетки необязательно могут иметь покрытие или шероховатую поверхность, они могут быть приготовлены таким образом, чтобы обеспечить медленное или контролируемое выделение активного ингредиента из формы.

Составы для парентерального применения включают водосодержащие и не содержащие воды стерильные растворы для инъекций, которые могут иметь в своем составе антиоксиданты, буферные средства, средства, препятствующие размножению бактерий и растворенные вещества, которые делают составы изотоническими в отношении крови реципиента; водосодержащие и не содержащие воды стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие и загущающие агенты. Составы могут быть представлены в стандартной дозовой форме или иметь вид многодозовых форм, запаянных ампул и пузырьков, которые можно хранить в замороженном /лиофилизированном/ состоянии, требующем разбавления стерильным жидким носителем, например солевым раствором, водой для инъекций, непосредственно перед использованием. Без предварительной подготовки растворы и суспензии для инъекций можно получать из стерильных порошков, гранул и таблеток по ранее описанным методам.

Составы для ректального применения могут представлять собой свечи, с обычным носителем, например, таким как масло какао или полиэтиленгликоль.

Составы для локального введения, например, в рот, за щеку или под язык, представляют собой лепешки, содержащие активный ингредиент на вкусовой основе, такой как сахароза и аравийская камедь или трагакант, или пастилки, содержащие активный ингредиент на основе, такой как желатин и глицерин или сахароза и камедь.

Предпочтительные стандартные дозовые составы представляют собой составы, содержащие эффективную дозу, указанную ниже, или соответствующую ее часть, в качестве активного ингредиента.

Совершенно очевидно, что кроме ингредиентов, указанных выше, представляемые изобретением составы могут включать и другие стандартные добавки в зависимости от типа состава, например, составы, предназначенные для орального применения могут включать вкусовые вещества.

Представляемые изобретением составы можно вводить через рот или в виде инъекций при дозе от 0.1 до 500 мг/кг в день. Дозовый диапазон для взрослого человека составляет, как правило, от 5 мг до 35 г/день. Таблетки или другие дозовые формы, представляющие собой отдельные единицы, могут обычно содержать количество представляемого изобретением соединения, эффективного для лечения именно в такой дозе или же разделенной на отдельные многократные дозы, например, единицы, содержащие 5 - 500 мг, около 10 - 200 мг.

Соединения формулы /I/ предпочтительно вводить через рот или путем инъекций (внутривенных или подкожных). Точное количество вводимого пациенту соединения должно быть определено рекомендациями лечащего врача. Однако рекомендуемая доза зависит также от множества факторов, в том числе от возраста и пола пациента, уточненного диагноза нарушения и его тяжести. Способ введения также зависит от множества различных факторов, включая состояние больного и тяжесть заболевания.

Соединения формулы /I/ можно получать путем реакции аминокислоты формулы II

или ее защищенного производного с соединением формулы /III/

в которой L представляет собой отщепляемую группу и R¹ и Q представляют собой значения, указанные выше, с последующим удалением защищающих групп.

Приемлемые защищающие группы L включают в себя -OR⁵ и -SR⁵, в которых R⁵ представляет собой низшую алкильную группу, например, C_1-4-алкил, предпочтительно метил или этил.

Соединение формулы /II/ обычно используют в форме, в которой аминокислота функционально защищена подходящей защищающей группой или группами, в связи с чем следует сослаться на публикацию T.W. Green и P.C.M. Wuts, "Защищающие группы в органическом синтезе", 2 изд. Д.Уайли и сыновья Инкорп. , 1991. Защищающие группы можно затем удалять обычными способами /цитируемыми здесь/ на конечной стадии процесса с получением соединения формулы /I/. Например, аминокислоту можно функционально защищать в виде соли меди с последующим снятием защиты, которое проводят на колонке с ионообменной смолой, рекомендуемой для удаления неорганических ионов из реакционной смеси.

Соединения формулы /III/ можно использовать в форме свободного основания или в виде соли-продукта кислотного присоединения, например гидрохлоридной или гидройодидной соли.

Реакцию обычно проводят в подходящем для этой цели растворителе в присутствии основания, например, гидроокиси щелочного металла, такой как гидроокись натрия, предпочтительно при pH около 9 - 11 и обычно при температуре от 0^oC до температуры перегонки растворителя, предпочтительно от 0 до 50^oC. Предпочтительным растворителем является вода, хотя реакцию можно проводить также в полярном растворителе, таком как низшие спирты, например, метанол или этанол или амиды, например, диметилформамид, один или в смеси с водой, причем это может быть целесообразным при определенных обстоятельствах.

Соединения формулы /II/ представляют собой обычно хорошо известные соединения, которые можно преобразовать в соответствующие защищенные производные по известной методике. Имидаты или тиоимидаты формулы /III/ /L представляет собой -OR⁵ и -SR⁵ соответственно/ также являются хорошо известными соединениями и реакция таких соединений с первичным амином обсуждается, например, в публикации "Химия амидинов и имидатов", т. 2, издание Saul Patai и Zvi Rappaport, Д.Уайли и сыновья Инкор., 1991.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Примеры.

Пример 1.

/S/-N⁵-/1-иминоэтил/орнитингидрохлорид.

L - орнитингидрохлорид /10.1 г, 60.0 ммолей/ растворяют в горячей воде /10 мл/ и полученный раствор продолжают перемешивать в течение 15 минут при 100^oC, добавляя порциями карбонат меди /7 г/. Темно-голубой раствор охлаждают до комнатной температуры, фильтруют и образовавшийся остаток промывают водой /20 мл/.

Объединенный фильтрат и промывные воды перемешивают при 5^oC, продолжая добавлять этилацетимидат гидрохлорид /11.1 г, 90 ммолей/, в процессе добавления раствор поддерживают на уровне pH 10.5 при одновременном добавлении 2N водного раствора гидроокиси натрия. Затем раствор выдерживают при комнатной температуре в течение часа, подкисляют 2N водным раствором гидроокиси до pH 3 и обрабатывают на колонке /150 мл/ с катионообменной смолой BiO - Rad AG 50W-X8 /в форме водорода/. Колонку промывают водой, пока элюат не приобретет нейтрального характера, а затем элюируют 0.5N водным раствором аммиака. Позитивные нингидриновые фракции объединяют и выпаривают при пониженном давлении при 40^oC короткое время с целью удаления аммиака. Затем раствор осторожно подкисляют до pH с помощью 2N водного раствора соляной кислоты и выпаривают досуха при пониженном давлении.

Остаток выкристаллизовывают путем растворения в небольшом количестве воды, добавляя большой объем этанола с последующим выдерживанием смеси при 4^o в течение нескольких часов. Осадок фильтруют, промывают этанолом и сушат в эксикаторе при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного кристаллического твердого вещества с т.пл. 226-228^oC.

Пример 2
(S)-N⁶-(1-иминоэтил)лизингидрохлорид.

Руководствуясь, в основном, методикой, описанной в примере 1, L - лизингидрохлорид /7.3 г, 40 ммолей/ преобразуют в комплекс меди, который вступает во взаимодействие с этилацетимидатгидрохлоридом /7.5 г, 60 ммолей/. Получают указанное в заголовке соединение, выделенное по аналогии с примером 1, представляющее гигроскопический аморфный порошок.

Пример 3.

Гидрохлорид
(+)-E-2-амино-6-(1-иминоэтиламино)-гекс-4-еновой кислоты.

Методы примера 1 используют для преобразования E-4,5-дегидролизингидрохлорида в указанное в заголовке соединение, выделяемое в виде аморфного продукта, гомогенного в соответствии с методом тонкослойной хроматографии, в смеси ацетонитрил/вода/уксусная кислота /5:3:2/. Данные ЯМР - спектроскопии /D₂O/ и масс-спектра совпадают с предлагаемой (желаемой) структурой.

Пример 4
(S)-S-2-(1-иминоэтиламино)этилцистеингидрохлорид
При использовании методов примера 1 /S/-S-2-/1-аминоэтилцистеингидрохлорид /2 г, 10 ммолей/ преобразуют в комплекс меди с последующей реакцией с этилацетимидатгидрохлоридом /1.88 г, 15 ммолей/. Продукт выделяют по методике, описанной в примере 1, с получением указанного в заголовке соединения в виде бледно-желтого аморфного твердого вещества, гомогенного в соответствии с ТСХ в смеси ацетонитрил/вода/уксусная кислота /5:3:2/. Данные ЯМР- и масс-спектроскопии совпадают с желаемой структурой.

В основном в соответствии с методами примера 1 получают соединения из примеров 5-11, используя для этой цели реакцию комплекса меди соответствующей аминокислоты формулы /II/ с подходящим этилалканимидатгидрохлоридом.

Пример 5.

/S/-N⁶-/1-иминопропил/лизингидрохлорид.

Указанное в заголовке соединение выделяют в виде белого гигроскопического аморфного порошка, гомогенного в соответствии с ТСХ в смеси ацетонитрил/вода/уксусная кислота /5:3:2/.

Масс-спектр продукта: /M+1/⁺, 202.0.

Пример 6.

/S/-N⁶-/ α- иминоциклопропилметил/лизингидрохлорид.

Выделяют указанное в заголовке соединение, представляющее собой белый, гигроскопический аморфный порошок с последующей его гомогенизацией в соответствии с ТСХ.

Масс-спектр продукта: /M+1/⁺, 214.0.

Пример 7
Гидрохлорид
/+/-2-амино-7-/1-иминоэтиламино/-гептановой кислоты.

Указанное в заголовке соединение получают в виде аморфного материала и гомогенного в соответствии с ТСХ, в смеси ацетонитрил/вода/уксусная кислота /5:3:2/.

Масс-спектр: /М+1/⁺, 202.0.

¹H-ЯМР /200 МГц, D₂O): 1.22-1.43 /m, 2CH₂/, 1.50-1.70 /м, CH₂/, 1.75-1.90 /м, CH₂/, 2.1 /с, CH₃/, 3.10-3.20 /т, CH₂/, 3.60-3.72 /т, CH/.

Пример 8
Гидрохлорид /+/-Z-2-амино-6-/1-иминоэтиламино/-гекс-4-еновой кислоты
Указанное в заголовке соединение выкристаллизовывают из смеси этанол/вода с получением бесцветных кристаллов, т.пл. 223-225^oC гомогенного по ТСХ. 880 аммиак /7:3/.

Масс-спектр: /M+1/⁺, 186.0 ²H-ЯМР/200 МГц, D₂O/: 2.22 /с, CH₃/, 2.66-2.76 /м, CH₂/, 3.80-3.90 /т, CH/, 3.80-4.00 /д, CH₂/, 5.70-5.80 /м, 2H/.

Пример 9:
/S/-N⁵-/1-иминопроп-1-ил/орнитингидрохлорид.

Указанное в заголовке соединение получают в виде бледно-желтого аморфного твердого вещества и гомогенного по ТСХ в смеси ацетонитрил/вода/уксусная кислота /5:3:2/.

Масс-спектр: /M+1/⁺, 188.0. ²H-ЯМР) 200 МГц, D₂O/: 1.05-1.08 /т, CH₃/, 1.55-1.90 /м, 2CH₂/, 2.30-2.45 /кв., CH₂/, 3.13-3.28 /т, CH₂/, 3.62-3.72 /т, CH/.

Пример 10.

/S/-N⁵-/1-иминобут-2-ил/орнитингидрохлорид
Указанное в заголовке соединение выкристаллизовывают из смеси этанола, содержащего следовые количества воды с получением твердого кристаллического вещества с т.пл. 202^o и гомогенного по ТСХ в смеси ацетонитрил/вода/уксусная кислота /5: 3: 2/. ¹H - ЯМР /200 МГц/, D₂О/: 1.21-1.29 /д, 2CH₃/, 1.61-1.85 /м, CH₂/, 1.82-2.01 /м, CH₂/, 2.65-2.88 /с, CH/, 3.25-3.39 /т, CH₂/, 3.74-3.84 /т, CH/.

Пример 11.

/S/-N⁵-/ α- иминоциклопропилметил/орнитингидрохлорид.

Указанное в заголовке соединение выкристаллизовывают из смеси этанол/вода с получением бесцветного твердого кристаллического вещества с т.пл. 2.75-2.77^o и гомогенного по ТСХ в смеси ацетонитрил/вода/уксусная кислота /5:3:2/
Масс-спектр: /М+1/⁺, 200. ¹Н-ЯМР /200 МГц, D₂O/: 1.0-1.30 /м, 2CH₂/, 1.60-2.05 /м, 2CH₂, CH/, 3.25-3.40 /т, CH₂/, 3.70-3.85 /т, CH/.

Данные биологических исследований.

Активность некоторых соединений формулы /I/ как ингибиторов NO-синтазы определяют с помощью следующих методов анализа: Конститутивная NO-синтаза - метод Rees и сотр., Br. J. Pharmacol, 101, 746-752 /1990/.

Индуцируемая /вызванная/ NO-синтаза - по существу в соответствии с методом Rees и сотр. Biochеm, Biophijs. Res. Comm., 173, 541-547 /1990/.

Были получены результаты, приведенные в конце описания.

Пример 12
Получение трет-бутил-N-(третбутоксикарбонил)-3-(5-(1-иминоэтил)амино)- 2-тиенил-DL-аланината
К охлаждаемому (0^oC), перемешиваемому раствору третбутил-N-(третбутоксикарбонил)-3-(5-амино-2-тиенил)-DL-аланината (590 мг, 1,72 ммоля) в EtOH (15 мл) добавляют бромид 1-бензилтиоэтаниминия (420 мг, 1,71 ммоля), полученного по методике Takido, Y., Itabashi, K. Synthesis, 1987, 817-819. После перемешивания в течение 10 минут, смесь концентрируют при пониженном давлении, разбавляют водой и промывают диэтиловым эфиром. Водный слой выливают в насыщенный раствор NaHCO₃ и экстрагируют диэтиловым эфиром. Органический слой сушат над MgSO₄, концентрируют до объема 30 мл и обрабатывают 1 н этерированной HCl (1,8 мл, 1,80 ммоля). Полученную белую суспензию перемешивают в течение 10 минут, при этом она превращается в вязкое масло. Растворитель удаляют при пониженном давлении. Полученную пену растворяют в воде и лиофилизируют в течение ночи, получая 539 мг (75%) целевого соединения в виде его хлористоводородной соли - белый порошок.

200 МГц ¹ЯМР (D₂O) δ: 1,35 (9H, с); 1,41 (9H, с); 2,34 (3H, с); 3,21 (2H, м); 4,27 (1H, м); 6,84 (1H, д); 6,91 (1H, д).

Получение 3-(5-(1-иминоэтил)амино)-2-тиенил-DL-аланина
Соединение, полученное на предыдущей стадии подвергают снятию защитной группы, используя стандартные методики, получая 336 мг (68%) гигроскопичного порошка.

200 МГц ¹ЯМР (D₂O) δ: 2,35 (3H, с); 3,43 (2H, д); 4,13 (1H, т); 6,93 (2H, м).

Биологическая активность вышеуказанного соединения, выраженная в K_i индуцируемой NO-синтазы, составляет ≤ 10 мкм.

Пример 13
Получение (S)-N-6-(1-иминоэтил)-4-окса-лизина
N-2-третбутилоксикарбонил-4-оксализина-метиловый эфир подвергали взаимодействию с S(1-нафтилметил)этилтиоимидатгидрохлоридом в этаноле. Растворитель выпаривали и остаток распределяли между эфиром и водой. Концентрирование органических слоев под вакуумом позволило получить защищенное соединение, которое нагревали в 2 н водном растворе HCl. После выпаривания остатка и очистки с применением твердофазной экстракции с обращенной фазой, получали соединение, названное в заглавии в виде гигроскопического аморфного твердого вещества белого цвета.

Масс-спектрометрия C₇H₁₅N₃O₃MH⁺ = 190
¹H ЯМР (D₂O): 2,38 (2H), 3,62 (2H), 3,90 (2H), 4,13 (2H), 4,40 (1H).

Биологические данные примера 13, выраженные в виде значения IC50 по вызываемой (индуцируемой) у человека NO-синтазы, составило 1,3 мкМ.

Примеры 14 и 15
Получение 3-ацетамидино-DL-фенилаланина и 4-ацетамидино-DL-фенилаланина
A. 3-ацетамидино-бензилдиэтилацетамидо-малонат
Раствор карбоната натрия (2,3 г) в воде (10 мл) добавили в суспензию гидрохлорида этилацетимида (2,84 г) в эфире (25 мл), и полученный раствор энергично встряхивали. Органический слой высушивали сульфатом натрия; водный слой затем экстрагировали эфиром (25 мл) и органический слой высушивали сульфатом натрия. Эфирные экстракты объединяли и фильтровали до получения этилацетамидата (1,21 г, 13,97 ммоль). Раствор этилацетимидата в сухом эфире (50 мл) обрабатывали раствором 3-амино-бензилдиэтилацетамидомалоната (3 г, 9,32 ммоль) в сухом тетрагидрофуране (100 мл) и полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 46 дней. Растворитель выпаривали до получения светло-серого твердого вещества, которое очищали флэш-хроматографией, элюируя 40% смесью метанол/этилацетат, 1% (880 мл) аммиака до получения 3-ацетамидинобензилдиэтилацетамидо-малоната (440 мг, 13%) в виде светлого рыжевато-коричневого стекла/смолы.

Аналогичным способом было получено нижеследующее промежуточное соединение (см. пример 15А):
Название промежуточного соединения: - Темп.плавл., ^oC
4-ацетамидино-бензилдиэтилацетамидо-малонат - смола
Б. 3-ацетамидино-DL-фенилаланин
3-ацетамидино-DL-фенилаланин получали из А. 50% раствор концентрированной соляной кислоты в воде (40 мл) добавили в 3-ацетамидино-бензилдиэтилацетамидомалонат (310 мг, 0.85 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при температуре кипения с обратным холодильником в течение 15 часов. Растворитель выпаривали до трети объема и сырой продукт очищали ионообменной хроматографией (DOWEX AG 50W-X8, смола 100-200 меш. 16 мл объем влажного слоя), элюируя 0.1 М раствором аммиака до получения рыжевато-коричневого стекла/масла. После дальнейшей очистки колоночной флэш-хроматографией (10% 880 мл аммиак/метанол) получали названный продукт (170 мг, 90%).

Аналогичным способом было получено нижеследующее соединение (см. пример 15В):
Название соединения - Темп.плавл., ^oC
4-ацетамидино-DL-фенилаланин - 287
Биологические данные по примерам 14 и 15, выраженные в виде K₁ по вызываемой у человека NO-синтазе составляли ≥ 50 мкМ для обоих соединений.

Пример 16
Получение 2-амино-6-(1-иминоэтиламино)-4,4-диокси-4-тиагексановой кислоты
А. 2-амино-6-(1-иминоэтиламино)-4,4-диоксо-4-тиагексановая кислота
Раствор S-[2-(1-иминоэтиламино)-этил] цистеина (3,25 г, 10 ммоль) в 1 М перхлорной кислоты (20 мл) обрабатывали 30% раствором перекиси водорода (6,8 мл, 60 ммоль) и 0,5 М молибдата аммония (1 мл). Температуру реакции поддерживали при 30^oC путем водного охлаждения. Реакционную смесь перемешивали при 25^oC в течение 2 часов, после чего ее поместили в ионообменную колонку AG 1X8 (ацетат) (50 мл, 60 ммоль). Аминокислоту элюировали из колонки водой, выпаривали растворитель из ниннидрин-положительной фракции до получения масла. Масло обрабатывали этанолом и повторно выпаривали под вакуумом. Оставшееся масло (примерно 4 г) очищали флэш-хроматографией с использованием смеси метанол/аммиак (9: 1) в качестве элюента до получения 2-амино-6-(1-иминоэтиламино)-4,4-диоксо-4-тиагексановой кислоты (0,8 г).

Биологические данные для этого соединения, выраженные в виде Ki по вызываемой у человека NO-синтазе, это значение составляло 2,9 мкМ для обоих соединений.

Пример 17
Получение 2-амино-6-(1-иминоэтиламино)-4-оксо-4-тиагексановой кислоты
А. 2-амино-6-(1-иминоэтиламино)-4-оксо-4-тиагексановая кислота
Раствор S-[2-(иминоэтиламино)этил]цистеина (3 г, 0,0113 моль) в 1 М соляной кислоте (30 мл) перемешивали, а затем обрабатывали 30% раствором перекиси водорода (1,5 мл, 11,6 ммоль). Реакционную смесь оставляли на ночь, после чего тонкослойная хроматография показала, что реакция завершилась. Реакционную смесь поместили на колонку AG 50WX8, промывали водой и элюировали 0,5 М раствором аммиака. Нингидрин-положительные фракции собирали и под вакуумом выпаривали растворитель. Неочищенный продукт очищали флэш-хроматографией с использованием смеси метанол/аммиак (9:1) в качестве элюента до получения 2-амино-6-(1-иминоэтиламино)-4-оксо-4-тиагексановой кислоты (200 мг).

Биологические данные по этому соединению, выраженные в виде Ki по вызываемой у человека NO-синтазе, это значение составляло 9,1 мкМ.

Амидинпроизводные формулы: HN=C(R¹)-NH-Q-C(NH₂)-CO₂H, их соли, фармацевтически приемлемые эфиры и амиды, где R¹-C₁-C₆-алкил, C₂-C₆-алкенил, C₂-C₆-алкинил, C₃-C₆-циклоалкил, C₃-C₆-циклоалкил - С₁-С₆-алкил; Q - C₃-C₆-алкилен-, C₃-C₆-алкенилен-, С₃-С₆-алкиниленгруппа, которая необязательно замещена одним или более С₁-С₃-алкилом: или представляет группу формулы: (CH₂)_p X(CH₂)_q; где p = 2, 3; q = 1, 2: X-S(O)_x, (где х = 0, 1, 2); -O-, NR², где R² - Н, С₁-С₆-алкил; либо Q-(CH₂)_r A(CH₂)_s, где r = 0, 1, 2; s = 0, 1, 2; A - ароматическое, или 3-6-членное гетероциклическое кольцо с атомом серы, при условии, что Q не является СH₂СH₂СH₂ или СН₂СН₂СН₂СН₂, если R¹ - метил, и не является СН₂СН₂CН₂, если R₁ - этил. Могут быть использованы как ингибиторы ферментов, индуцируемой NO-синтазы. 3 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Амидинпроизводные формулы IA

их соли, фармацевтически приемлемые эфиры и амиды,
где R¹ представляет собой C₁ - C₆ прямой или разветвленный алкил, C₂ - C₆-алкенил, C₂ - C₆-алкинил, C₃ - C₆-циклоалкил или C₃ - C₆-циклоалкил C_1-6 -алкил; Q представляет собой C_3-6-алкилен-, C_3-6-алкенилен- или C_3-6-алкиниленгруппу, которая необязательно замещена одним или более C_1-3-алкилом, группу формулы -(CH₂)_pX(CH)_q, в которой p представляет собой число 2 или 3, q - число 1 или 2 и X представляет собой S(O)_x, где x представляет собой число 0,1 или 2,0 или -NR², где R² - H или C₁ - C₆-алкил; либо группу формулы -(CH₂)_rA(CH₂)_s, где r - число 0,1 или 2, s - 0,1 или 2 и A представляет собой ароматическое или 3 - 6-членное гетероциклическое кольцо, которое в качестве одного гетероатома содержит серу, при условии, что Q не является CH₂CH₂CH₂ или CH₂CH₂CH₂CH₂, если R¹ представляет собой метил, или не является CH₂CH₂CH₂, если R¹ - этил. 2. Амидинпроизводное формулы IA по п. 1, отличающееся тем, что R¹ представляет собой метил, этил, н-пропил, изопропил, циклопропил, пропенил, н-бутил, трет-бутил, циклобутил или циклопропилметил, A представляет собой фенил или тиенил; Q представляет собой группу (CH₂)_n, в которой n - число 3 - 5, -(CH₂)_v CH = CH (CH₂)_w и -(CH₂)_vC≡C(CH₂)_w, где в любом случае v представляет собой число 0 - 3 и w - соответственно число 0 - 3, при условии, что общая сумма v + w составляет от 2 до 4. 3. Соединение формулы IA по пп.1 и 2, отличающееся тем, что R² представляет собой метил, Q представляет собой -CH₂ CH = CHCH₂, - (CH₂)_p X(CH₂)_q, где p является число 2 или 3, q - соответственно число 1 или 2 и X представляет собой S(O)_x, где x - число 0,1 или 2, более предпочтительно 0, атом кислорода или NR², где R² представляет собой H или C₁ - C₆-алкил, более предпочтительно C₁ - C₃-алкил; или же - CH₂)_r A(CH₂)_s -, где r - число 1 или 2, s - число 1 или 2 и A представляет собой фенил, при условии, что группа имеет природную L- или (S) - хиральность; а также их фармацевтически приемлемые соли, эфиры и амиды. 4. Соединение формулы IA по пп.1 - 3, отличающееся тем, что R¹ представляет собой метил, Q представляет собой CH₂CH = CHCH₂-, (CH₂)₂SCH₂-, а также его фармацевтически приемлемые соли, эфиры и амиды.