Данное изобретение было сделано частично на средства Национального института здоровья (субсидия N NS 26109). Правительство США может иметь определенные права на это изобретение.
Настоящее изобретение относится к методам и композициям для усовершенствованной биологической борьбы с насекомыми-вредителями. Более конкретно, настоящее изобретение относится к использованию и манипулированию генами, кодирующими специфические к насекомым паралитические нейротоксины, для разработки усовершенствованных агентов по биологической борьбе с насекомыми. Настоящее изобретение специально касается бакуловирусов, полученных методами генной инженерии для экспрессии гена, специфического к насекомому паралитического токсина, который получен из клеща, паразитического для насекомых.
Pyemotes tritici, клещ пузатый, является одним из тринадцати известных видов клещей рода Pyemotes, причем все они являются хищными и обладают ядами, вызывающими от умеренной до крайней токсичность у насекомых-мишеней. Тринадцать известных видов можно разделить на две морфологические группы, которые также отличаются по кругу хозяев, методам рассеивания и токсичности в отношении их хозяев, а также по эффектам, которые оказывают их токсины на насекомых и человека. Группы scolyti и ventricosus приведены в табл. 1. Большинство членов группы ventricosus обладает ядами, крайне токсичными для насекомых. Клещи группы scolyti являются все форетическими и обычно обнаруживаются на короедах; они могут вырабатывать паралитические токсины.
Жизненный цикл клещей продолжается только 7-14 суток, при этом 100-300 новорожденных сексуально зрелых клещей появляется из матери. Когда появляется самка, она немедленно спаривается и находит нового хозяина. Время паралича насекомого-хозяина варьирует, как полагают, в зависимости от вида, размера, стадии развития и количества нападающих клещей. Все стадии роста насекомого-хозяина могут привлекать клещей, однако взрослые, как правило, менее восприимчивы вследствие их более склеротизированных (то есть, утолщенных) оболочек, которые более трудно преодолеваются ротовыми частями клещей.
Сами яды клещей, по-видимому, не являются специфическими для определенных насекомых, поскольку яды токсичны для широкого круга хозяев и нехозяев насекомых видов. Токсин(ы) вызывает необратимый паралич, не разрушая респираторные механизмы (Weiser and Slama (1964), Ann. Ent. Soc. Am. 57:479).
Токсины, специфические к насекомым, которые присутствуют в яде P. tritici, очищены и охарактеризованы (Tomalski et al. (1988), Toxicon 26:127-132; Tomalski et al. (1989), Toxicon 27:1151-1167). Эти токсины продуцируются в самках клещей и инъецируются в тело жертвы в качестве компонентов яда, что приводит к параличу насекомого. Паралич позволяет самке клеща стать полностью беременной, что обеспечивает получение достаточных питательных веществ для воспроизводства. Компоненты токсина с низкой молекулярной массой вызывают быстрый паралич сокращающихся мышц, тогда как высокомолекулярная фракция токсина вызывает вялый паралич мышц.
Один компонент токсина, обозначенный ТхР-I, очищен до кажущейся гомогенности; он имеет кажущуюся молекулярную массу 27000, определенную электрофорезом в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия. Анализ аминокислотного состава ТхР-I представлен в работе Tomalski et al. (1989) supra. Относительно высокое содержание цистеина может привести к образованию ряда дисульфидных связей в молекуле токсина. N-концевая последовательность ТхР-I опубликована и имеет следующий вид: N-asp-asn-gly-asn-val-glu-ser-val-arg-ala-val-val-ile-asp-tyr-[X] -asp-ile-arg-his-pro-. Обнаружено, что N-концевая аминокислотная последовательность является гомологичной любой белковой последовательности (Ресурсы идентификации белков, выпуск Национального биомедицинского фонда, N 13 от 30 июня 1987 года).
Пептизированы два других компонента, которые проявляют молекулярную массу, равную 28000 и 29000; эти два компонента включают ТхР-II. На основе пептидного картирования и иммуноблоттинга постулировано, что белковые компоненты ТхР-I и ТхР-II являются изопротеинами (Tomalski et al. (1989) supra). Смесь ТхР-I и ТхР-II содержит TxP-III.
Препараты токсинов P. tritici фактически не являются токсичными для млекопитающих, что подтверждается в результате проверки на мышах с использованием и внутрибрюшинного, и интрацеребрального введения. Дозы, которые вызывают паралич у 50% испытуемых насекомых (ПД50), для ТхР-I, ТхР-II и Тхр-III составляют 330, 550 и 500 мкг/кг соответственно при проверке на личинках моли большой восковой (Galleria mellonella). ТхР-I и ТхР-II вызывают быстрый мышцесокращательный паралич.
Получено поликлональное антитело с использованием очищенного ТхР-I в качестве антигена. Это антитело является реакционноспособным против и ТхР-I, и ТхР-II, и антитело нейтрализует паралитическую активность частично очищенных препаратов TxP-III (Tomalski et al. (1989) supra).
Специфические к насекомым белковые нейротоксины обнаружены в яде других членистоногих, включая скорпионов, ос и пауков (Zlotkin (1985) в работе Comprehensive Insect Prosiology, Biochemistry and Pharmacology. I. Insects, I. Kervut and L.I. Gilbert (eds.) Pergamon Press, Oxford, U.R., p. 499-546). Несколько пептидных токсинов от скорпионов оказывают специфические к насекомым нейротоксические эффекты, и они секвенированы. Эти токсины скорпионов имеют относительно низкую молекулярную массу, то есть от примерно 3000 до примерно 8000 дальтон, что существенно отличается от показателей токсинов клещей. Между токсинами клещей и скорпионов нет никакого видимого взаимоотношения в последовательности, однако и токсины клещей, и токсины скорпионов имеют высокое содержание цистеина. Компактные структуры белков токсинов стабилизированы дисульфидными связями.
Интерес к биологической борьбе с насекомыми-вредителями возник в результате неэффективности традиционных химических пестицидов. Химические пестициды, как правило, поражают и полезные, и вредные виды. Насекомые-вредители приобретают резистентность к таким химическим препаратам, так что новые популяции насекомых-вредителей могут получить быстрое развитие с приобретенной резистентностью к этим пестицидам. Кроме того, химические остатки представляют угрозу окружающей среде и возможную опасность для здоровья людей. Биологическая борьба представляет собой альтернативное средство уничтожения вредителей, которое может уменьшить зависимость от химических пестицидов.
Стратегии биологической борьбы включают вовлечение встречающихся в природе микроорганизмов, которые патогенны к насекомым (энтомопатогены), а также разработку сельскохозяйственных культур, которые более резистентны к насекомым- вредителям. Подходы включают идентификацию и определение характеристик генов или генных продуктов насекомых, которые могут служить в качестве пригодных мишеней для агентов по борьбе с насекомыми, идентификацию и использование ранее не нашедших применение микроорганизмов (включая модификацию встречающихся в природе непатогенных микроорганизмов с целью придания им патогенного характера в отношении насекомых), модификацию и переработку используемых в настоящее время энтомопатогенов, а также разработку на генетическом уровне сельскохозяйственных культур, которые проявляют бoлее высокую резистентность к насекомым-вредителям.
Среди энтомопатогенов, разработанных в качестве биологических пестицидов, находятся вирусы, вызывающие естественные эпизоотические заболевания. Энтомопатогенные вирусы включают бакуловирусы, энтомопоксивирусы, реовирусы (вирусы цитоплазматического полиэдроза), иридовирусы, парвовирусы, вирусы бешенства, пикорнавирусы, нодавирусы, асковирусы (все еще не классифицированные) и, вероятно, некоторые ретровирусы.
Бакуловирусы представляют собой большую группу эволюционно родственных вирусов, которые заражают только членистоногих (Miller, L.K. (1981) в работе Genetic Engineering in the Plant Sciences N. Panopoulous (ed.), Praeger Publ. , New York, p. 203-224; Carstens (1980) Trends in Biochemical Science 52: 107-110; Harrap и Payne (1979) в Advances in Virus Research, vol. 25, Lawfer et al. (eds.), Academic Press, New York, p. 273-355, Granados, R.R. and Federici, B. A. eds. (1986) The Biology of Baciloviruses, vol. 1, Biological Properties and Molecular Biology, CRC Press Inc., Boca Raton, Florida). Некоторые бакуловирусы поражают только насекомых, которые являются вредителями коммерчески важных сельскохозяйственных и лесных культур. Известны другие бакуловирусы, которые заражают других насекомых-вредителей, например комаров и блох. Такие бакуловирусы потенциально ценны в качестве агентов по биологической борьбе. Потенциальным преимуществом бакуловирусов в качестве биологическиx пестицидов является их специфичность к хозяевам. Бакуловирусы как группа заражают только членистоногих, а отдельные штаммы бакуловирусов обычно заражают только один или несколько видов насекомых. Поэтому они оказывают незначительное или вовсе не оказывают отрицательное воздействие на человека или окружающую среду и могут быть использованы без какого бы то ни было риска поразить полезные виды насекомых.
Подгруппы бакуловирусов включают вирусы ядерного полиэдроза (NPV), вирусы гранулеза (GV) и "невкрапленные" бакуловирусы. Вo "вкрапленных" формах бакуловирусов вирионы (нуклеокапсиды в оболочке) погружены в кристаллическую белковую матрицу. Эта структура, упоминаемая как тело включения или выключения, представляет собой форму, обнаруживаемую вне организма в природе и отвечающую за распространение инфекции среди организмов. Отличительным признаком группы NPV является то, что многие вирионы погружены в каждое тело выключения, которое относительно крупное (до 5 мкм). Тела выключения группы GV меньше и содержат каждое единственный вирион. Кристаллическая белковая матрица тел выключения обеих форм состоит главным образом из одного полипептида c молекулярной массой 25000-38000 дальтон, который известен как полиэдрин или гранулин. Невкрапленные бакуловирусы не продуцируют белок полиэдрина и не образуют тела выключения (Groner et al. in The Biology of Baculoviruses, vol. 1, supra, и данная работа приведена в качестве отсылки, в главе 9, табл. 2 и 7 приводят обширный перечень хозяев NPV и хозяев GV в качестве примера).
В природе заражение начинается тогда, когда насекомое проглатывает пищу, зараженную бакуловирусными частицами, обычно в форме тел выключения. Тела выключения диссоциируются в щелочных условиях средней кишки насекомого, высвобождая виpионы, которые затем вторгаются в эпителиальные клетки, обкладывая кишку. В пределах клетки-хозяина бакуловирус мигрирует к ядру, где происходит репликация. Первоначально специфические вирусные белки продуцируются в пределах зараженной клетки посредством транскрипции и трансляции так называемых "ранних генов". Среди других функций эти белки требуются для репликации вирусной ДНК, которая начинается через 4-6 ч, после того как вирус вошел в клетку. Репликация вирусной ДНК продолжается приблизительно в течение 24 ч после заражения (пз). Примерно через 8-24 ч пз инфецированные клетки экспрессируют "поздние гены" на высоких уровнях. Они включают компоненты нуклеокапсида, который окружает вирусную ДНК во время образования потомства вирусных частиц. Производство потомства вирусных частиц начинается примерно через 12 ч пз. Вначале потомок вируса мигрирует к клеточной мембране, где он приобретает оболочку, как только он отпочковывается от поверхности клетки. Невкрапленные вирусные частицы могут затем заразить другие клетки внутри насекомого. Синтез полиэдрина начинается приблизительно через 18 ч после заражения и достигает очень высоких уровней за 24-48 ч пз. Примерно за 24 ч пз наблюдается снижение в скорости производства невкрапленного вируса, и большинство потомков вирусных частиц затем погружается в тела выключения. Образование тел выключения продолжается вплоть до смерти или лизиса клеток. Некоторые бакуловирусы заражают фактически каждую ткань в насекомом-хозяине так, что к концу процесса заражения насекомое полностью разжижается, высвобождая чрезвычайно большие количества тел выключения, которые затем могут распространить заражение на другие насекомые (The Biology of Baculoviruses, vol. I and II, Granados and Federici (eds.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1986).
Бакуловирусы, являющиеся производными AcMNPV, которые пригодны в качестве экспрессирующих векторов, описаны в заявке на патент США N 07/353847, зарегистрированной 17 мая 1989 года; международной патентной заявке PCT/US 90/02814, зарегистрированной 17 мая 1990 года; в работе Rankin et al. (1988) Gene 70: 39-49; в работе Ooi et al. (1989), J.Mol. Biol. 210:221-736, в работе Thiem and Miller (1990), Gene 91:87-95, причем все эти работы приведены в качестве отсылок. Чрезвычайно сильные поздние и очень поздние промоторы описаны в литературе, и они включают модифицированный промотор полиэдрина LSXIV, гибридный Cap/Polh промотор и синтетический промотор Syn.
Описаны бакуловирусы, которые проявляют улучшенные инсектицидные свойства. Например, AcMNPV, в котором ген egt (экдизон-глюкозилтрансферазы) инактивирован, вызывает раннее прекращение питания и более раннюю смерть личинок по сравнению с личинками, зараженными AcMNPV дикого типа (O'Reilly and Miller (1989) Science 245:1110-1112; O'Reilly and Miller (1990) J. Virol. 64: 1321- 1328; заявка на патент США N 07/373952, зарегистрированная 29 июня 1989 года).
Egt AcMBPV, который вдобавок изменен генетически с целью экспрессии белка, поражающего линьку, может привести к получению дополнительных улучшений инсектицидных свойств (международная заявка на патент PCT/US 90/03758, зарегистрированная 29 июня 1990 года, введена в данное описание в качестве отсылки). Производные Egt AcMNPV, которые экспрессируют эстеразу ювенильного гормона, гормон вылупления или проторацикотропный гормон, также сконструированы в данной области знания. Время кормления зараженных личинок уменьшено, и смерть происходит раньше, чем у личинок, зараженных AcMNPV дикого типа или egt AcMNPV.
Maeda (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun. 165:1177-1183 также описал полученный методами рекомбинантных ДНК бакуловирус с улучшенными пестицидными свойствами. BmNPV, который заражает тутовый шелкопряд Bombyx mori, модифицирован с целью экспрессии синтетического гена, кодирующего диуретический гормон бражника Manduca sexta. Жидкостный баланс зараженных насекомых был нарушен, и умерщвление происходило приблизительно на 20% быстрее, нежели при использовании вируса дикого типа.
Dee и соавторы (1990), Bio/Technology 8:339-342 клонировали и экспрессировали инсектицидный токсин от скорпиона Androctonus australis в фибробластные клетки мыши. Кодирующую последовательность сплавляли с сигнальной пептидной последовательностью человеческого интерлейкина-2, и синтез управлялся промоторными последовательностями в длинном концевом повторе вируса мышиной саркомы Молони. Рекомбинантный белок, который был секрецирован в экстрацеллюлярную среду, как отмечается, токсичен для личинок комара, но не для мышиных клеток в культуре или для мышей.
Ген, кодирующий токсин насекомых от Buthus eupeus (среднеазиатских подвидов скорпионов), синтезирован, клонирован в геном AcMNPV (вирус ядерного полиэдроза от Autographa californica) и экспрессирован под управлением промотора полиэдрина. Также осуществлены конструкции, в которых токсин скорпиона экспрессирован из синтетического гена, включающего токсин-кодирующую последовательность, сплавленную с последовательностью, кодирующей сигнальный пептид, или в виде пептидилированного белка с 58 аминокислотами полиэдрина у N-конца. Во всех случаях отмечается определенная экспрессия, на что указывают [35S] -метионин-радиоактивное мучение, гель-электрофорез в полиакриламиде с использованием додецилсульфата натрия и авторадиография, однако не отмечается никакой паралитической активности в отношении насекомых в результате наблюдения за продуктами экспрессии. Полагают, что это частично обусловлено нестабильностью белка, однако невозможность обнаружить биологическую активность может быть результатом недостаточной чувствительности в системе анализов или вследствие неспособности рекомбинантного белка образовывать функциональную трехмерную структуру (Carbonell et al. (1988), Gene 73:409-418).
Hammock et al. (1990), Nature 344:458-461 описывают бакуловирус-опосредованную экспрессию насекомого гена, кодирующего эстеразу ювенильного гормона (JHE), фермент, который инактивирует эволюционный гормон.
Merryweather et al. (1990), J. Gen. Virology 71:1535-1544 приводят построение бакуловируса, содержащего дельта-эндотоксин HD-73 подвида kurstaki вида Bacillus thuringiensis. Ген эндотоксина HD-73 BTk помещали под управление полиэдрин-промотора.
Целью настоящего изобретения является получение генов, кодирующих нейротоксины, вызывающие паралич у насекомых, например, от клещей, паразитических для насекомых, таких, которые относятся к роду Pyemotes, в частности тех, которые принадлежат к группе ventricoccus рода Pyemotes. В специфическом варианте ген нейротоксина, паралитического в отношении насекомых, представляет собой ген Тох34 Pyemotes tritici, который идентифицирован по нуклеотидной последовательности, приведенной в табл. 2; второй специфический вариант паралитического для насекомых нейротоксина и гена, кодирующего его, показан в нуклеотидной и аминокислотной последовательностях Тох21а также вида Pyemotes tritici, которые приведены в табл. 4. Следует понять, что можно выделить и идентифицировать по гомологии нуклеотидных последовательностей и другие гены специфических к насекомым паралитических нейротокоинов, как обнаружено в экспериментах по гибридизации (см., например, Hanes и Higgins (1985), Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Washington, D.C.), используя для этой цели приведенную здесь информацию о последовательностях.
Гены специфических к насекомым паралитических нейротоксинов, имеющие по крайней мере около 70 нуклеиновокислотной гомологии относительно кодирующих Тох34 или Тох21а последовательностей, можно легко выделить с использованием хорошо известных гибридизационных анализов или скрининга. Такие методики особенно пригодны для выделения таких генов нейротоксинов из клещей, паразитических для насекомых, и наиболее пригодны для выделения из клещей рода Pyemotes. Функциональные эквиваленты специфических для насекомых паралитических нейротоксинов в соответствии с настоящим изобретением, например Тох34 и Тох21а, составляют белки, имеющие биологическую активность Тох34 и/или Тох21а, и которые в основном сходны по структуре, то есть аминокислотной последовательности, с Тох34 и/или Тох21а, как указано в табл. 2 и 4 соответственно.
В соответствии с этим настоящее изобретение включает специфический к насекомым паралитический нейротоксин, имеющий по крайней мере 70% последовательности, идентичной аминокислотной последовательности в табл. 4.
Настоящее изобретение также предлагает специфический к насекомым паралитический нейротоксин, имеющий по крайней мере 70% последовательности, идентичной аминокислотной последовательности в табл. 4, причем указанный нейротоксин имеет в основном такую же аминокислотную последовательность, которая приведена в табл. 4.
Нейротоксины, в основном аналогичные Тох34 и Тох21а, включают те, которые по крайней мере примерно на 70% идентичны по аминокислотной последовательности Тох34 и/или Тох21а. В основном аналогичные нейротоксины также включают те, которые имеют по крайней мере окoло 70% аминокислотной последовательности, аналогичной последовательности Тох34 или Тох21а, что позволяет осуществлять замещения консервативными аминокислотами аминокислоты Тох34 и Тох21а. Специалист в данной области поймет, что функция белка может быть не задета в результате незначительных структурных модификаций, особенно если эти структурные модификации представляют собой замещения аминокислот, являющихся сходными по химическим и физическим свойствам. Структурные модификации, включая аминокислотные делеции и инсерции, могут быть дозволены, если они не оказывают влияния на функциональность.
Гены, кодирующие нейротоксины, являющиеся функционально эквивалентными Тох34 и/или Тох21а, могут быть выделены и идентифицированы либо иным образом получены с использованием любых способов, известных специалистам в данной области, особенно опираясь на представленную здесь информацию о последовательностях. Например, аминокислотную гомологию и/или нуклеотиднокислотную гомологию, измеренную методами гибридизации, можно соединить с методиками, описываемыми в данной работе в отношении оценки нейротоксичности для насекомых, с целью выделения функциональных нейротоксинов для насекомых. Методы PCR (полимеразно-цепьевой реакции), например, в сочетании с другими хорошо известными методиками, приведенными в данной работе, можно использовать для выделения генов, кодирующих нейротоксины, которые функционально эквивалентны тем, которые приводятся в настоящем изобретении. Информация, представленная в данном описании, в сочетании с известной методологией, касающейся синтеза белков и ДНК, консервации свойств между аминокислотами и использования кодонов, позволяет специалисту в данной области техники без труда сконструировать и синтезировать нейротоксины насекомых и гены нейротоксинов насекомых, которые функционально эквивалентны Тох34 и Тох21а.
Соответственно изобретение включает молекулу рекомбинантной ДНК, включающую ген, кодирующий специфический для насекомых паралитический нейротоксин.
Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный кодируемый специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 70% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 2.
Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный кодируемый специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 83% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 2.
Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный кодируемый специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 88% сходства аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 2.
Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный ген включает нуклеотидную последовательность, кодирующую специфический к насекомым паралитический нейротоксин, как показано в табл. 2, примерно от 118 нуклеотида до 873 нуклеотида.
Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный ген имеет по крайней мере около 70% гомологии нуклеотидной последовательности с нуклеотидной последовательностью, кодирующей специфический к насекомым паралитический нейротоксин, как показано в табл. 2.
Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный кодируемый специфический к насекомым паралитический нейротоксин содержит аминокислотную последовательность, приведенную в табл. 2, от аспартата, кодируемого приблизительно у 120 нуклеотида до цистеина, кодируемого приблизительно у 873 нуклеотида.
Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 70% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 4.
Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 83% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 4.
Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 88% сходства аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 4.
Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный ген имеет по крайней мере около 70% гомологии нуклеотидной последовательности с нуклеотидной последовательностью, кодирующей специфический к насекомым паралитический нейротоксин, как показано в табл. 4.
Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный ген кодирует специфический к насекомым паралитический нейротоксин клеща рода Pyemotes.
Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный ген кодирует специфический к насекомым паралитический нейротоксин клеща рода Pyemotes, при этом данный клещ принадлежит к виду Pyemotes tritici.
Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный ген имеет нуклеотидную последовательность, кодирующую специфический к насекомым паралитический нейротоксин, как показано в табл. 4.
Настоящее изобретение также включает молекулу рекомбинантной ДНК, содержащую ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, причем указанный ген кодирует специфический к насекомым паралитический нейротоксин, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в табл. 4.
Другой целью настоящего изобретения является получение агента по борьбе с насекомыми, экспрессирующего ген специфического к насекомым паралитического нейротоксина такого, как бакуловирус, например AcMNPV, построенного методами рекомбинантных ДНК с целью экспрессии гена нейротоксина, например ген нейротоксина от клеща, паразитического для насекомых. В таких агентах специфический к насекомым ген нейротоксина помещают под регуляторный контроль соответствующих регуляторных последовательностей гена, таких как промотор, с тем чтобы получить количество нейротоксина, эффективное для создания токсического эффекта такого, как паралич, в искомом насекомом. Специфические варианты генетически модифицированного AcMNPV включают VETL-Тох34, vCap/Polh-Tox34, vEV-Тох34 и vSp-Тох34, где ген Тох34 экспрессируют под управлением раннего промотора, сильного позднего и/или очень позднего промотора; причем особенно предпочтительные варианты генетически модифицированного вкрапленного AcMNPV включают vSp-Tox34, представляющего собой вкрапленный вирус, и vCap/Polh-Tox34, который является невкрапленным, но обеспечивает улучшенную борьбу с насекомыми раньше, чем другие примеры. Специалист поймет, как следует конструировать аналогичные вкрапленные формы вируса. Специалист также поймет, что вирус может быть вкраплен путем совместного заражения клеток вирусным хелпером, который несет в себе функцию гена полиэдрина.
Специалист в данной области также поймет, как следует конструировать рекомбинантные вирусы, в которых токсин-ген инсерцирован в другие положения генома AcMNPV. Такие вирусы имели бы токсин-ген, синтезированный с соответствующим промотором, инсерцированным в несущественную область генома AcMNPV. Несущественные области включают область гена р10 (Adang and Miller (1982), J. Virology 44: 782-793; Kuzio et al. (1984), Virology 139: 414-418), область гена DA26 (O'Reilly et al. (1990), J. Gen. Virology, 71:1029-1037), область ETL (Grawford and Miller (1988) J. Virology, 62:2773-2781), область egt (O'Reilly and Miller (1990), J. Virology 64:1321-1328), область открытой рамки считывания (orf) (Gearing and Possee (1990) J. Gen. Virology 71:251-262), область orf p94 (Friesen and Miller (1987), J. Virology 61:2264-2272) или другие области, которые специалист может легко определить. Поскольку существует значительная гомология среди этих генов различных бакуловирусов, специалист также поймет, как следует инсерцировать тонксин-ген, синтезированный с соответствующим промотором, в геномы других бакуловирусов в аналогичных несущественных местах.
Поэтому настоящее изобретение включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин.
Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный ген кодирует специфический к насекомым паралитический нейротоксин клеща рода Pyemotes.
Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный ген кодирует специфический к насекомым паралитический нейротоксин клеща рода Pyemotes, причем данный клещ принадлежит к виду Pyemotes tritici.
Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 70% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 2, от аспартата, кодируемого приблизительно у 120 нуклеотида до цистеина, кодируемого приблизительно у 873 нуклеотида.
Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 83% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 2, от аспартата, кодируемого приблизительно у 120 нуклеотида до цистеина, кодируемого приблизительно у 873 нуклеотида.
Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 88% сходства аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 2, от аспартата, кодируемого приблизительно у 120 нуклеотида до цистеина, кодируемого приблизительно у 873 нуклеотида.
Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный ген имеет по крайней мере около 70% гомологии нуклеотидной последовательности с нуклеотидной последовательностью, кодирующей специфический к насекомым паралитический нейротоксин, как показано в табл. 2, приблизительно от 118 нуклеотида до 873 нуклеотида.
Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный ген содержит нуклеотидную последовательность специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенную в табл. 2, приблизительно от 118 нуклеотида до 873 нуклеотида.
Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован о тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный кодируемый специфический к насекомым паралитический нейротоксин содержит аминокислотную последовательность, приведенную в табл. 2, от аспартата, кодируемого приблизительно у 120 нуклеотида до цистеина, кодируемого приблизительно у 873 нуклеотида.
Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный агент по борьбе с насекомыми представляет собой вирус насекомых.
Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный агент по борьбе с насекомыми представляет собой вирус насекомых, являющийся производным бакуловируса.
Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный агент по борьбе с насекомыми представляет собой вирус насекомых, являющийся производным бакуловируса, причем это производное бакуловируса является бакуловирусом NPV.
Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный агент по борьбе с насекомыми представляет собой вирус насекомых, являющийся производным бакуловируса, причем это производное бакуловируса является бакуловирусом NPV, который в свою очередь является производным AcMNPV.
Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный агент по борьбе с насекомыми представляет собой вирус насекомых, являющийся производным бакуловируса, причем это производное бакуловируса является бакуловирусом NPV, который в свою очередь является производным AcMNPV, при этом последний экспрессирует ген специфического к насекомым паралитического нейротоксина под регуляторным контролем промотора, действующего очень поздно во время заражения.
Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный агент по борьбе с насекомыми представляет собой вирус насекомых, являющийся производным бакуловируса, причем это производное бакуловируса является бакуловирусом NPV, который в свою очередь является производным AcMNPV, при этом последний экспрессирует ген специфического к насекомым паралитического нейротоксина под регуляторным контролем промотора, действующего очень поздно во время заражения, а AcMNPV представляет собой vEV-Тох34.
Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный агент по борьбе с насекомыми представляет собой вирус насекомых, являющийся производным бакуловируса, причем это производное бакуловируса является бакуловирусом NPV, который в свою очередь является производным AcMNPV, при этом последний экспрессирует ген специфического к насекомым паралитического нейротоксина под регуляторным контролем промотора, экспрессированного ранее при вирусной инфекции.
Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный агент по борьбе с насекомыми представляет собой вирус насекомых, являющийся производным бакуловируса, причем это производное бакуловируса является бакуловирусом NPV, который в свою очередь является производным AcMNPV, при этом последний экспрессирует ген специфического к насекомым паралитического нейротоксина под регуляторным контролем промотора, экспрессированного ранее при вирусной инфекции, при этом указанный AcMNPV представляет собой vETL-Тоx34.
Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный агент по борьбе с насекомыми представляет собой вирус насекомых, являющийся производным бакуловируса, причем это производное бакуловируса является бакуловирусом NPV, который в свою очередь является производным AcMNPV, при этом указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин экспрессируется под регуляторным контролем синтетического промотора.
Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный агент по борьбе с насекомыми представляет собой вирус насекомых, являющийся производным бакуловируса, причем это производное бакуловируса является бакуловирусом NPV, который в свою очередь является производным AcMNPV, при этом указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин экспрессируется под регуляторным контролем синтетического промотора, а AcMNPV представляет собой vSр-Тох34.
Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный агент по борьбе с насекомыми представляет собой вирус насекомым, являющийся производным бакуловируса, причем это производное бакуловируса является бакуловирусом NPV, который в свою очередь является производным AcMNPV, при этом указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин экспрессируется под регуляторным контролем гибридного промотора.
Настоящее изобретение также включает агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный агент по борьбе с насекомыми представляет собой вирус насекомых, являющийся производным бакуловируса, причем это производное бакуловируса является бакуловирусом NPV, который в свою очередь является производным AcMNPV, при этом указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин экспрессируется под регуляторным контролем гибридного промотора, а агент по борьбе с насекомыми представляет собой vCap/Polh-Tox34.
Агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный кодируемый, специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 70% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 4, от аспартата, кодируемого приблизительно у 120 нуклеотида до цистеина, кодируемого приблизительно у 873 нуклеотида.
Агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный кодируемый, специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 83% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 4, от аспартата, кодируемого приблизительно у 120 нуклеотида до цистеина, кодируемого приблизительно у 873 нуклеотида.
Агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный кодируемый, специфический к насекомым паралитический нейротоксин, как показано в табл. 4, имеет по крайней мере около 88% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина от аспартата, кодируемого приблизительно у 120 нуклеотида до цистеина, кодируемого приблизительно у 873 нуклеотида.
Агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный ген содержит нуклеотидную последовательность специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенную в табл. 4, приблизительно от 118 нуклеотида до 873 нуклеотида.
Агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический к насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный ген имеет по крайней мере около 70% гомологии нуклеотидной последовательности с нуклеотидной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, как показано в табл. 4.
Агент по биологической борьбе с насекомыми, который генетически модифицирован с тем, чтобы содержать и экспрессировать ген, кодирующий специфический с насекомым паралитический нейротоксин, при этом указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет аминокислотную последовательность, приведенную в табл. 4.
Другой целью настоящего изобретения является получение токсичной для насекомых композиции, содержащей токсическое к насекомым количество вируса насекомых такого, как бакуловирус, генетически построенной для экспрессии специфического к насекомым паралитического нейротоксина на уровне, который приводит к получению токсического эффекта в отношении искомого насекомого, а также носитель, приемлемый для применения в сельскохозяйственных или иных окружающих условий. Такие композиции могут быть использованы для защиты растений от насекомых-вредителей. Предпочтительными агентами по борьбе с насекомыми являются такие, которые экспрессируют ген специфического к насекомому паралитического нейротоксина на паразитического для насекомого клеща и особенно клещей рода Pyemotes. Если вирус насекомых представляет собой бакуловирус группы GV или NPV, предпочтительно, чтобы вирусные частицы присутствовали в окклюдированной форме.
Соответственно настоящее изобретение включает токсичную для насекомых композицию, содержащую количество агента по борьбе с насекомыми, эффективное для получения токсического эффекта в отношении искомого насекомого, при этом данный агент генетически модифицирован для экспрессии гена, кодирующего специфический к насекомым паралитический нейротоксин, и содержащую сельскохозяйственно приемлемый носитель.
Настоящее изобретение также включает токсичную для насекомых композицию, содержащую количество агента по борьбе с насекомыми, эффективное для получения токсического эффекта в отношении искомого насекомого, при этом данный агент генетически модифицирован для экспрессии гена, кодирующего специфический к насекомым паралитический нейротоксин, и содержащую сельскохозяйственно приемлемый носитель, при этом указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 70% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 2, от аспартата, кодируемого приблизительно у 120 нуклеотида до цистеина, кодируемого приблизительно у 873 нуклеотида.
Настоящее изобретение также включает токсичную для насекомых композицию, содержащую количество агента по борьбе с насекомыми, эффективное для получения токсического эффекта в отношении искомого насекомого, при этом данный агент генетически модифицирован для экспрессии гена, кодирующего специфический к насекомым паралитический нейротоксин, и содержащую сельскохозяйственно приемлемый носитель, при этом указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 83% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 2, от аспартата, кодируемого приблизительно у 120 нуклеотида до цистеина, кодируемого приблизительно у 873 нуклеотида.
Настоящее изобретение также включает токсичную для насекомых композицию, содержащую количество агента по борьбе с насекомыми, эффективное для получения токсического эффекта в отношении искомого насекомого, при этом данный агент генетически модифицирован для экспрессии гена, кодирующего специфический к насекомым паралитический нейротоксин, и содержащую сельскохозяйственно приемлемый носитель, при этом указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 88% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 2, от аспартата, кодируемого приблизительно у 120 нуклеотида до цистеина, кодируемого приблизительно у 873 нуклеотида.
Настоящее изобретение также включает токсичную для насекомых композицию, содержащую количество агента по борьбе с насекомыми, эффективное для получения токсического эффекта в отношении искомого насекомого, при этом данный агент генетически модифицирован для экспрессии гена, кодирующего специфический к насекомым паралитический нейротоксин, и содержащую сельскохозяйственно приемлемый носитель, при этом указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 70% гомологии нуклеотидной последовательности с нуклеотидной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина приблизительно от нуклеотида 118 до нуклеотида 873, как показано в табл. 2.
Настоящее изобретение также включает токсичную для насекомых композицию, содержащую количество агента по борьбе с насекомыми, эффективное для получения токсического эффекта в отношении искомого насекомого, при этом данный агент генетически модифицирован для экспрессии гена, кодирующего специфический к насекомым паралитический нейротоксин, и содержащую сельскохозяйственно приемлемый носитель, при этом указанный ген содержит нуклеотидную последовательность специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенную в табл. 2, приблизительно от 118 нуклеотида до 873 нуклеотида.
Настоящее изобретение также включает токсичную для насекомых композицию, содержащую количество агента по борьбе с насекомыми, эффективное для получения токсического эффекта в отношении искомого насекомого, при этом данный агент генетически модифицирован для экспрессии гена, кодирующего специфический к насекомым паралитический нейротоксин, и содержащую сельскохозяйственно приемлемый носитель, при этом указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин включает аминокислотную последовательность, приведенную в табл. 2, от аспартата, кодируемого приблизительно у 120 нуклеотида до цистеина, кодируемого приблизительно у 873 нуклеотида.
Настоящее изобретение также включает токсичную для насекомых композицию, содержащую количество агента по борьбе с насекомыми, эффективное для получения токсического эффекта в отношении искомого насекомого, при этом данный агент генетически модифицирован для экспрессии гена, кодирующего специфический к насекомым паралитический нейротоксин, и содержащую сельскохозяйственно приемлемый носитель, при этом указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 70% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 4.
Настоящее изобретение также включает токсичную для насекомых композицию, содержащую количество агента по борьбе с насекомыми, эффективное для получения токсического эффекта в отношении искомого насекомого, при этом данный агент генетически модифицирован для экспрессии гена, кодирующего специфический к насекомым паралитический нейротоксин, и содержащую сельскохозяйственно приемлемый носитель, при этом указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 83% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 4.
Настоящее изобретение также включает токсичную для насекомых композицию, содержащую количество агента по борьбе с насекомыми, эффективное для получения токсического эффекта в отношении искомого насекомого, при этом данный агент генетически модифицирован для экспрессии гена, кодирующего специфический к насекомым паралитический нейротоксин, и содержащую сельскохозяйственно приемлемый носитель, при этом указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 88% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью специфического к насекомым паралитического нейротоксина, приведенной в табл. 4.
Настоящее изобретение также включает токсичную для насекомых композицию, содержащую количество агента по борьбе с насекомыми, эффективное для получения токсического эффекта в отношении искомого насекомого, при этом данный агент генетически модифицирован для экспрессии гена, кодирующего специфический к насекомым паралитический нейротоксин, и содержащую сельскохозяйственно приемлемый носитель, при этом указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин включает нуклеотидную последовательность, приведенную в табл. 4.
Настоящее изобретение также включает токсичную для насекомых композицию, содержащую количество агента по борьбе с насекомыми, эффективное для получения токсического эффекта в отношении искомого насекомого, при этом данный агент генетически модифицирован для экспрессии гена, кодирующего специфический к насекомым паралитический нейротоксин, и содержащую сельскохозяйственно приемлемый носитель, при этом указанный специфический к насекомым паралитический нейротоксин включает аминокислотную последовательность, приведенную в табл. 4.
Настоящее изобретение также включает токсичную для насекомых композицию, содержащую количество агента по борьбе с насекомыми, эффективное для получения токсического эффекта в отношении искомого насекомого, при этом данный агент генетически модифицирован для экспрессии гена, кодирующего специфический к насекомым паралитический нейротоксин, и содержащую сельскохозяйственно приемлемый носитель, при этом указанный агент по борьбе с насекомыми представляет собой вирус насекомых.
Настоящее изобретение также включает токсичную для насекомых композицию, содержащую количество агента по борьбе с насекомыми, эффективное для получения токсического эффекта в отношении искомого насекомого, при этом данный агент генетически модифицирован для экспрессии гена, кодирующего специфический к насекомым паралитический нейротоксин, и содержащую сельскохозяйственно приемлемый носитель, при этом указанный агент по борьбе с насекомыми представляет собой вирус насекомых, представляющий собой производное бакуловируса.
Настоящее изобретение также включает токсичную для насекомых композицию, содержащую количество агента по борьбе с насекомыми, эффективное для получения токсического эффекта в отношении искомого насекомого, при этом данный агент генетически модифицирован для экспрессии гена, кодирующего специфический к насекомым паралитический нейротоксин, и содержащую сельскохозяйственно приемлемый носитель, при этом указанный агент по борьбе с насекомыми представляет собой вирус насекомых, представляющий собой производное бакуловируса, причем это производное бакуловируса является производным AcMNPV.
Настоящее изобретение также включает токсичную для насекомых композицию, содержащую количество агента по борьбе с насекомыми, эффективное для получения токсического эффекта в отношении искомого насекомого, при этом данный агент генетически модифицирован для экспрессии гена, кодирующего специфический к насекомым паралитический нейротоксин, и содержащую сельскохозяйственно приемлемый носитель, при этом указанный агент по борьбе с насекомыми представляет собой вирус насекомых, представляющих собой производное бакуловируса, причем это производное бакуловируса является производным AcMNPV, а указанный AcMNPV экспрессирует данный ген специфического к насекомым паралитического нейротоксина под регуляторным контролем промотора, активного очень поздно во время заражения.
Настоящее изобретение также включает токсичную для насекомых композицию, содержащую количество агента по борьбе с насекомыми, эффективное для получения токсического эффекта в отношении искомого насекомого, при этом данный агент генетически модифицирован для экспрессии гена, кодирующего специфический к насекомым паралитический нейротоксин, и содержащую сельскохозяйственно приемлемый носитель, при этом указанный агент по борьбе с насекомыми представляет собой вирус насекомых, представляющий собой производное бакуловируса, причем это производное бакуловируса является производным AcMNPV, а указанный AcMNPV экспрессирует данный ген специфического к насекомым паралитического нейротоксина под регуляторным контролем промотора, активного очень поздно во время заражения, причем указанный AcMNPV представляет собой vEV-Тох34.
Настоящее изобретение также включает токсичную для насекомых композицию, содержащую количество агента по борьбе с насекомыми, эффективное для получения токсического эффекта в отношении искомого насекомого, при этом данный агент генетически модифицирован для экспрессии гена, кодирующего специфический к насекомым паралитический нейротоксин, и содержащую сельскохозяйственно приемлемый носитель, при этом указанный агент по борьбе с насекомыми представляет собой вирус насекомых, представляющий собой производное бакуловируса, причем это производное бакуловируса является производным AcMNPV, а указанный AcMNPV экспрессирует данный ген специфического к насекомым паралитического нейротоксина под регуляторным контролем промотора, экспрессированного ранее при вирусном заражении.
Настоящее изобретение также включает токсичную для насекомых композицию, содержащую количество агента по борьбе с насекомыми, эффективное для получения токсического эффекта в отношении искомого насекомого, при этом данный агент генетически модифицирован для экспрессии гена, кодирующего специфический к насекомым паралитический нейротоксин, и содержащую сельскохозяйственно приемлемый носитель, при этом указанный агент по борьбе с насекомыми представляет собой вирус насекомых, представляющий собой производное бакуловируса, причем это производное бакуловируса является производным AcMNPV, а указанный AcMNPV, экспрессирует данный ген специфического к насекомым паралитического нейротоксина под регуляторным контролем промотора, экспрессированного ранее при вирусном заражении, причем указанный AcMNPV представляет собой vETL-Тох34.
Настоящее изобретение также включает токсичную для насекомых композицию, содержащую количество агента по борьбе с насекомыми, эффективное для получения токсического эффекта в отношении искомого насекомого, при этом данный агент генетически модифицирован для экспрессии гена, кодирующего специфический к насекомым паралитический нейротоксин, и содержащую сельскохозяйственно приемлемый носитель, при этом указанный агент по борьбе с насекомыми представляет собой вирус насекомых, представляющий собой производное бакуловируса, причем это производное бакуловируса является производным AcMNPV, а указанный AcMNPV экспрессирует данный ген специфического к насекомым паралитического нейротоксина под регуляторным контролем гибридного промотора.
Настоящее изобретение также включает токсичную для насекомых композицию, содержащую количество агента по борьбе с насекомыми, эффективное для получения токсического эффекта в отношении искомого насекомого, при этом данный агент генетически модифицирован для экспрессии гена, кодирующего специфический к насекомым паралитический нейротоксин, и содержащую сельскохозяйственно приемлемый носитель, при этом указанный агент по борьбе с насекомыми представляет собой вирус насекомых, представляющий собой производное бакуловируса, причем это производное бакуловируса является производным AcMNPV, а указанный AcMNPV экспрессирует данный ген специфического к насекомым паралитического нейротоксина под регуляторным контролем гибридного промотора, причем указанный AcMNPV представляет собой один из vSр-Tox4 и vCap/Polh-Тох34.
Другой целью настоящего изобретения является создание метода биологической борьбы с насекомым-вредителем, в котором используют токсичную к насекомым композицию, содержащую токсическое для насекомых количество агента по борьбе с насекомыми, генетически созданного для экспрессии гена, специфического к насекомым паралитического нейротоксина из паразитического для насекомых клеща. Такую токсичную к насекомым композицию наносят по соседству с исковым насекомым в месте проживания или на площадь, растение или окружающую среду, подлежащую защите от насекомого-вредителя. Количество указанного агента по борьбе с насекомыми в указанной композиции и уровень экспрессии указанного гена нейротоксина с использованием агента по борьбе с насекомыми таковы, что данная композиция продуцирует токсический эффект в отношении исковых насекомых. Предпочтительные агенты по борьбе с насекомыми представляют собой вирусы насекомых, включая бакуловирусы, особенно вкрапленные вирусы, такие как NPVs и GVs, более конкретно AcMNPV и его производные и близкие родственники. Окклюдированные (вкрапленные) формы генетически модифицированных вирусов ядерного полиэдроза будут наиболее пригодными в настоящем изобретении. Специалист в данной области понимает, что генетически модифицированный вирус, экспрессирующий токсин для насекомых, сам по себе способен к окклюзии, или что окклюзия может быть достигнута другими средствами, например путем совместного заражения с положительным к окклюзии вирусом.
В соответствии с этим настоящее изобретение включает метод борьбы с насекомыми-вредителями, в котором наносят токсическое к насекомым количество, равное 16 и 42, на место обитания данных насекомых-вредителей.
Настоящее изобретение включает метод борьбы с насекомыми-вредителями, в котором наносят токсическое к насекомым количество, равное 16 и 42, на среду обитания данных насекомых-вредителей, причем средой обитания данных насекомых является растение.
Настоящее изобретение включает метод борьбы с насекомыми-вредителями, в котором используют приманку, содержащую токсическое к насекомым количество, равное 16 и 42.
Аналогично целью настоящего изобретения является получение агентов по борьбе с насекомыми, генетически модифицированными дня экспрессии гена, специфического к насекомым паралитического нейротоксина, причем указанные агенты эффективны против насекомых-вредителей иных, нежели те, которые нападают на растения или являются пагубными для них. Такой агент может быть введен в токсические к насекомым, паралитические для насекомых или инсектицидные композиции вместе с приемлемыми в смысле окружающих условий носителями, и может быть использован в способе борьбы с исковым насекомым-вредителем, восприимчивым к конкретному типу используемого агента по борьбе с насекомыми.
Кроме применения в инсектицидных композициях, защищающих растения, агенты по борьбе с насекомыми в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы в борьбе с другими насекомыми-вредителями с выбором конкретного организма, генетически модифицированного с целью экспрессии специфического к насекомым паралитического нейротоксина, подходящего для искомого насекомого-вредителя. Например, существуют бакуловирусы, которые специфически заражают и комаров и блох (cм. Beard et al. (1989), J.Invertebrate Path. 54: 128-131 и Federici (1980), Virology 100:1-9). Как и в отношении насекомых-вредителей, атакующих растения, исковое насекомое дает специалисту возможность выбрать агент по борьбе с насекомыми, используемый для экспрессии паралитического токсина. Специалист знает, как следует выбирать соответствующую регуляторную и/или промоторную последовательность для использования с агентом по борьбе с насекомыми.
Еще одной целью настоящего изобретения является создание способа получения специфического к насекомым паралитического нейротоксина в клетке, в которой он не экспрессируется в природных условиях. Данный способ предусматривает конструирование молекулы рекомбинантной ДНК, в которой кодирующая последовательность специфического к насекомым нейротоксина находится под управлением регуляторной последовательности, которая осуществляет экспрессию кодирующей последовательности в отобранной клетке хозяина, интродукцию молекулы рекомбинантной ДНК в пригодную клетку-хозяин и культивирование полученной рекомбинантной клетки-хозяина в условиях, которые позволяют осуществить экспрессию последовательности, кодирующей токсин для насекомых. Нейротоксин-кодирующую последовательность инсерцируют, например, ниже промотора, экспрессируемого в клетке-хозяине или зараженной клетке-хозяине. Молекулу ДНК, содержащую экспрессируемую последовательность нейротоксина, можно интродуцировать в клетку-хозяин с использованием векторных последовательностей, которые облегчают ее интродукцию. Культивирование клетки-хозяина может включать культивирование одиночных клеток в жидких средах, культуре ткани клеток иди размножение клеток с помощью генной инженерии для экспрессии гена нейротоксина в многоклеточных организмах, включая высшие организмы, такие как насекомые. Вообще любой способ, известный в данной области техники для интродукции ДНК в клетку-хозяин, может быть применен в соответствии с настоящим изобретением. Известно, как следует отбирать клетки-хозяева, последовательности плазмидных или вирусных векторов, промоторы и гены нейротоксинов, пригодные для такого получения. Специфические к насекомым нейротоксины, полученные в таких генетически модифицированных культурах клеток-хозяев, когда они должным образом доставлены к искомому насекомому, являются токсическими для этого насекомого. Могут быть использованы нейротоксины, полученные в таких культурах.
В соответствии с этим настоящее изобретение включает способ получения специфического к насекомым паралитического нейротоксина в клетке-хозяине, в котором:
(а) конструируют молекулу рекомбинантной ДНК, которая включает векторную часть, способную к интродукции и репликации в этой клетке-хозяине, промотор, который функционирует в этой клетке-хозяине, и кодирующую последовательность для специфического к насекомым паралитического нейротоксина, который экспрессируется в этой клетке-хозяине, причем указанный промотор и указанная кодирующая последовательность расположены в этой молекуле в пределах указанной векторной части так, чтобы нейротоксин экспрессировался под управлением указанного промотора в этой клетке-хозяине;
(б) интродуцируют указанную молекулу рекомбинантной ДНК в эту клетку-хозяин с тем, чтобы продуцировать генетически модифицированную клетку-хозяин, и
(в) культивируют генетически модифицированный хозяин так, чтобы экспрессировать указанную кодирующую последовательность и получить специфический к насекомым паралитический нейротоксин.
Настоящее изобретение также включает способ получения специфического к насекомым паралитического нейротоксина в клетке-хозяине, в котором:
(а) конструируют молекулу рекомбинантной ДНК, которая включает векторную часть, способную к интродукции и репликации в этой клетке-хозяине, промотор, который функционирует в этой клетке-хозяине, и кодирующую последовательность для специфического к насекомым паралитического нейротоксина, который экспрессируется в этой клетке-хозяине, причем указанный промотор и указанная кодирующая последовательность расположены в этой молекуле в пределах указанной векторной части так, чтобы нейротоксин экспрессировался под управлением указанного промотора в этой клетке-хозяине;
(б) интродуцируют указанную молекулу рекомбинантной ДНК в эту клетку-хозяин с тем, чтобы продуцировать генетически модифицированную клетку-хозяин, и
(в) культивируют генетически модифицированный хозяин так, чтобы экспрессировать указанную кодирующую последовательность и получить специфический к насекомым паралитический нейротоксин с последующим восстановлением и очисткой указанного нейротоксина после осуществления стадии культивирования.
Настоящее изобретение также включает способ получения специфического к насекомым паралитического нейротоксина в клетке-хозяине, в котором:
(а) конструируют молекулу рекомбинантной ДНК, которая включает векторную часть, способную к интродукции и репликации в этой клетке-хозяине, причем векторная часть получена из вируса насекомых, промотор, который функционирует в этой клетке-хозяине, и кодирующую последовательность для специфического к насекомым паралитического нейротоксина, который экспрессируется в этой клетке-xозяине, причем указанный промотор и указанная кодирующая последовательность расположены в этой молекуле в пределах указанной векторной части так, чтобы нейротоксин экспрессировался под управлением указанного промотора в этой клетке-хозяине;
(б) интродуцируют указанную молекулу рекомбинантной ДНК в эту клетку-хозяин с тем, чтобы продуцировать генетически модифицированную клетку-хозяин, и
(в) культивируют генетически модифицированный хозяин так, чтобы экспрессировать указанную кодирующую последовательность и получить специфический к насекомым паралитический нейротоксин.
Настоящее изобретение также включает способ получения специфического к насекомым паралитического нейротоксина в клетке-хозяине, в котором:
(а) конструируют молекулу рекомбинантной ДНК, которая включает векторную часть, способную к интродукции и репликации в этой клетке-хозяине, причем векторная часть получена из вируса насекомых, который представляет собой бакуловирус, промотор, который функционирует в этой клетке-хозяине, и кодирующую последовательность для специфического к насекомым паралитического нейротоксина, который экспрессируется в этой клетке-хозяине, причем указанный промотор и указанная кодирующая последовательность расположены в этой молекуле в пределах указанной векторной части так, чтобы нейротоксин экспрессировался под управлением указанного промотора в этой клетке-хозяине;
(б) интродуцируют указанную молекулу рекомбинантной ДНК в эту клетку-хозяин с тем, чтобы продуцировать генетически модифицированную клетку-хозяин, и
(в) культивируют генетически модифицированный хозяин так, чтобы экспрессировать указанную кодирующую последовательность и получить специфический к насекомым паралитический нейротоксин.
Настоящее изобретение также включает способ получения специфического к насекомым паралитического нейротоксина в клетке-хозяине, в котором:
(а) конструируют молекулу рекомбинантной ДНК, которая включает векторную часть, способную к интродукции и репликации в этой клетке-хозяине, причем векторная часть получена из вируса насекомых, который представляет собой бакуловирус, причем указанный бакуловирус представляет собой вирус ядерного полиэдроза, промотор, который функционирует в этой клетке-хозяине, и кодирующую последовательность для специфического к насекомым паралитического нейротоксина, который экспрессируется в этой клетке-хозяине, причем указанный промотор и указанная кодирующая последовательность расположены в этой молекуле в пределах указанной векторной части так, чтобы нейротоксин экспрессировался под управлением указанного промотора в этой клетке-хозяине,
(б) интродуцируют указанную молекулу рекомбинантной ДНК в эту клетку-хозяин с тем, чтобы продуцировать генетически модифицированную клетку-хозяин, и
(в) культивируют генетически модифицированный хозяин так, чтобы экспрессировать указанную кодирующую последовательность и получить специфический к насекомым паралитический нейротоксин.
Настоящее изобретение также включает способ получения специфического к насекомым паралитического нейротоксина в клетке-хозяине, в котором:
(а) конструируют молекулу рекомбинантной ДНК, которая включает векторную часть, способную к интродукции и репликации в этой клетке-хозяине, причем векторная часть получена из вируса насекомых, который представляет собой бакуловирус, причем указанный бакуловирус представляет собой вирус ядерного полиэдроза, который в свою очередь является AcMNPV, промотор, который функционирует в этой клетке-хозяине, и кодирующую последовательность для специфического к насекомым паралитического нейротоксина, который экспрессируется в этой клетке-хозяине, причем указанный промотор и указанная кодирующая последовательность расположены в этой молекуле в пределах указанной векторной части так, чтобы нейротоксин экспрессировался под управлением указанного промотора в этой клетке-хозяине;
(б) интродуцируют указанную молекулу рекомбинантной ДНК в эту клетку-хозяин с тем, чтобы продуцировать генетически модифицированную клетку-хозяин, и
(в) культивируют генетически модифицированный хозяин так, чтобы экспрессировать указанную кодирующую последовательность и получить специфический к насекомым паралитический нейротоксин.
Настоящее изобретение также включает способ получения специфического к насекомым паралитического нейротоксина в клетке-хозяине, в котором:
(а) конструируют молекулу рекомбинантной ДНК, которая включает векторную часть, способную к интродукции и репликации в этой клетке-хозяине, промотор, который функционирует в этой клетке-хозяине, и кодирующую последовательность для специфического к насекомым паралитического нейротоксина, причем указанная кодирующая последовательность для специфического к насекомым паралитического нейротоксина получена из хищного для насекомых клеща, который экспрессируется в этой клетке-хозяине, при этом указанный промотор и указанная кодирующая последовательность расположены в этой молекуле в пределах указанной векторной части так, чтобы нейротоксин экспрессировался под управлением указанного промотора в этой клетке-хозяине;
(б) интродуцируют указанную молекулу рекомбинантной ДНК в эту клетку-хозяин с тем, чтобы продуцировать генетически модифицированную клетку-хозяин, и
(в) культивируют генетически модифицированный хозяин так, чтобы экспрессировать указанную кодирующую последовательность и получить специфический к насекомым паралитический нейротоксин.
Настоящее изобретение также включает способ получения специфического к насекомым паралитического нейротоксина в клетке-хозяине, в котором:
(а) конструируют молекулу рекомбинанантной ДНК, которая включает векторную часть, способную к интродукции и репликации в этой клетке-хозяине, промотор, который функционирует в этой клетке-хозяине, и кодирующую последовательность для специфического к насекомым паралитического нейротоксина, причем специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 70% аминокислотной идентичности к аминокислотной последовательности, приведенной в табл. 2, от аспартата, кодируемого приблизительно у 118 нуклеотида до цистеина, кодируемого приблизительно у 873 нуклеотида, которая экспрессируется в указанной клетке-хозяине, при этом указанный промотор и указанная кодирующая последовательность расположены в этой молекуле в пределах указанной векторной части так, чтобы нейротоксин экспрессировался под управлением указанного промотора в этой клетке-хозяине;
(б) интродуцируют указанную молекулу рекомбинантной ДНК в эту клетку-хозяин с тем, чтобы продуцировать генетически модифицированную клетку-хозяин, и
(в) культивируют генетически модифицированный хозяин так, чтобы экспрессировать указанную кодирующую последовательность и получить специфический к насекомым паралитический нейротоксин.
Настоящее изобретение также включает способ получения специфического к насекомым паралитического нейротоксина в клетке-хозяине, в котором:
(а) конструируют молекулу рекомбинантной ДНК, которая включает векторную часть, способную к интродукции и репликации в этой клетке-хозяине, промотор, который функционирует в этой клетке-хозяине, и кодирующую последовательность для специфического к насекомым паралитического нейротоксина, причем специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 83% аминокислотной идентичности к аминокислотной последовательности, приведенной в табл. 2, от аспартата, кодируемого приблизительно у 118 нуклеотида до цистеина, кодируемого приблизительно у 873 нуклеотида, которая экспрессируется в указанной клетке-хозяине, при этом указанный промотор и указанная кодирующая последовательность расположены в этой молекуле в пределах указанной векторной части так, чтобы нейротоксин экспрессировался под управлением указанного промотора в этой клетке-хозяине;
(б) интродуцируют указанную молекулу рекомбинантной ДНК в эту клетку-хозяин с тем, чтобы продуцировать генетически модифицированную клетку-хозяин, и
(в) культивируют генетически модифицированный хозяин так, чтобы экспрессировать указанную кодирующую последовательность и получить специфический к насекомым паралитический нейротоксин.
Настоящее изобретение также включает способ получения специфического к насекомым паралитического нейротоксина в клетке-хозяине, в котором:
(а) конструируют молекулу рекомбинантной ДНК, которая включает векторную часть, способную к интродукции и репликации в этой клетке-хозяине, промотор, который функционирует в этой клетке-хозяине, и кодирующую последовательность для специфического к насекомым паралитического нейротоксина, причем специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 88% аминокислотной идентичности к аминокислотной последовательности, приведенной в табл. 2, от аспартата, кодируемого приблизительно у 118 нуклеотида до цистеина, кодируемого приблизительно у 873 нуклеотида, которая экспрессируется в указанной клетке-хозяине, при этом указанный промотор и указанная кодирующая последовательность расположены в этой молекуле в пределах указанной векторной части так, чтобы нейротоксин экспрессировался под управлением указанного промотора в этой клетке-хозяине;
(б) интродуцируют указанную молекулу рекомбинантной ДНК в эту клетку-хозяин с тем, чтобы продуцировать генетически модифицированную клетку-хозяин, и
(в) культивируют генетически модифицированный хозяин так, чтобы экспрессировать указанную кодирующую последовательность и получить специфический к насекомым паралитический нейротоксин.
Настоящее изобретение также включает способ получения специфического к насекомым паралитического нейротоксина в клетке-хозяине, в котором:
(а) конструируют молекулу рекомбинантной ДНК, которая включает векторную часть, способную к интродукции и репликации в этой клетке-хозяине, промотор, который функционирует в этой клетке-хозяине, и кодирующую последовательность для специфического к насекомым паралитического нейротоксина, причем специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 70% аминокислотной идентичности к аминокислотной последовательности, приведенной в табл. 4, которая экспрессируется в указанной клетке-хозяине, при этом указанный промотор и указанная кодирующая последовательность расположены в этой молекуле в пределах указанной векторной части так, чтобы нейротоксин экспрессировался под управлением указанного промотора в этой клетке-хозяине;
(б) интродуцируют указанную молекулу рекомбинантной ДНК в эту клетку-хозяин с тем, чтобы продуцировать генетически модифицированную клетку-хозяин, и
(в) культивируют генетически модифицированный хозяин так, чтобы экспрессировать указанную кодирующую последовательность и получить специфический к насекомым паралитический нейротоксин.
Настоящее изобретение также включает способ получения специфического к насекомым паралитического нейротоксина в клетке-хозяине, в котором:
(а) конструируют молекулу рекомбинантной ДНК, которая включает векторную часть, способную к интродукции и репликации в этой клетке-хозяине, промотор, который функционирует в этой клетке-хозяине, и кодирующую последовательность для специфического к насекомым паралитического нейротоксина, причем специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 83% аминокислотной идентичности к аминокислотной последовательности, приведенной в табл. 4, которая экспрессируется в указанной клетке-хозяине, при этом указанный промотор и указанная кодирующая последовательность расположены в этой молекуле в пределах указанной векторной части так, чтобы нейротоксин экспрессировался под управлением указанного промотора в этой клетке-хозяине;
(б) интродуцируют указанную молекулу рекомбинантной ДНК в эту клетку-хозяин с тем, чтобы продуцировать генетически модифицированную клетку-хозяин, и
(в) культивируют генетически модифицированный хозяин так, чтобы экспрессировать указанную кодирующую последовательность и получить специфический к насекомым паралитический нейротоксин.
Настоящее изобретение также включает способ получения специфического к насекомым паралитического нейротоксина в клетке-хозяине, в котором:
(а) конструируют молекулу рекомбинантной ДНК, которая включает векторную часть, способную к интродукции и репликации в этой клетке-хозяине, промотор, который функционирует в этой клетке-хозяине, и кодирующую последовательность для специфического к насекомым паралитического нейротоксина, причем специфический к насекомым паралитический нейротоксин имеет по крайней мере около 88% аминокислотной идентичности к аминокислотной последовательности, приведенной в табл. 4, от аспартата, кодируемого приблизительно у 118 нуклеотида до цистеина, кодируемого приблизительно у 873 нуклеотида, которая экспрессируется в указанной клетке-хозяине, при этом указанный промотор и указанная кодирующая последовательность расположены в этой молекуле в пределах указанной векторной части так, чтобы нейротоксин экспрессировался под управлением указанного промотора в этой клетке-хозяине;
(б) интродуцируют указанную молекулу рекомбинантной ДНК в эту клетку-хозяин с тем, чтобы продуцировать генетически модифицированную клетку-хозяин, и
(в) культивируют генетически модифицированный хозяин так, чтобы экспрессировать указанную кодирующую последовательность и получить специфический к насекомым паралитический нейротоксин.
Краткое описание чертежей.
Фиг. 1 иллюстрирует перемещаемую плазмиду pEV-Тох34. Эту плазмиду используют при конструировании рекомбинантного AcMNPV vEV-Тох34 путем гомологичной рекомбинации между последовательностями вируса дикого типа и плазмидного полиэдрина. Фрагмент EcoRI размером 933 пары оснований, содержащий Тох34, инсерцируют в pEVmodXIV (описана в заявке на патент США N 353847, зарегистрирована 17 мая 1989 года). Плазмида содержит 2,6 килопар оснований векторных последовательностей (открытая область), область 0,8 килопар оснований генома AcMNPV, расположенного сразу же за геном полиэдрина, область 1,5 килопар оснований генома AcMNPV от сайта KpnI в пределах гена полиэдрина и простирающегося вниз от гена (последовательности AcMNPV показаны в виде скошенных линий), и модифицированный промотор полиэдрина LSXIV показан в виде наконечника стрелы между рестрикционных сайтов EcoRV и Bgl II. Направление Тох34-кодирующих последовательностей (пунктирная линия) от промотора LSXIV показано стрелкой внутри круга.
Фиг. 2 сравнивает эффекты на приращение массы у личинок насекомых, зараженных инъецированием либо AcMNPV дикого типа (L-I), либо рекомбинантным вирусом vEV-Тох34 в зависимости от времени, прошедшего после заражения. Также включены контрольные образцы мнимого заражения (ТС-100). Личинок вначале исследуют через 24 ч после заражения (показано как 0 ч после заражения (pi). Тех, которые умирают в результате физического воздействия инъекции, удаляют в этот период исследования. Показано число личинок в каждой группе (N). Личинoк взвешивают, и их средняя масса, включая стандартное отклонение, приведена на фиг. 2 в виде столбцов и удаления от каждого столбца (шкала слева дает среднюю массу на каждую личинку в миллиграммах). Процентное содержание каждой группы личинок, парализованных в зависимости от времени, представлено черным центральным столбцом в пределах более крупного открытого столбца, представляющего среднюю массу (шкала справа дает % парализованных или мертвых).
Фиг. 3 иллюстрирует перемещаемую плазмиду phc-dETL-рТох34, которую используют для конструирования рекомбинантного вируса vETL-Тох34, причем данный вирус экспрессирует TxP-I под регуляторным контролем раннего промотора ETL вируса AcMNPV. Фрагмент Bgl II/Kpn I из pEV-Тох34, содержащий Тох34-кодирующую последовательность (скошенная линия), инсерцируют в сайты Bgl II и Kpn I плазмиды phc-dET, которую получают из phcwt (Rankin et al. (1988) supra), заменяя промотор полиэдрина между сайтами EcoRV и Bgl II последовательностями промотора ETL (Crawford and Miller (1988), J.Virology 62:2773-2781), простирающимися от -300 до -6 (относительно кодона ATG инициации трансляции, обозначенного +1, +2, +3). Промотор ETL отмечен наконечником стрелы. Геномные последовательности AcMNPV, которые осуществляют гомологичную рекомбинацию и аллельное замещение, показаны в виде скошенных линий; эти последовательности фланкируют синтез промотора ETL и Тох34. Последовательность hr 5 вируса AcMNPV первоначально инсерцируют в phcwt для побочных целей; она расположена на фрагменте Hind III-SalI в месте соединения AcMNPV/вектора, показанного с левой стороны диаграммы. Векторные последовательности показаны в виде открытой линии. Приводятся релевантные сайты эндонуклеазы рестрикции.
Фиг. 4 иллюстрирует перемещаемую плазмиду pSp-Тох34, которую используют для конструирования рекомбинантного вируса vSp-Тох34, экспрессирующего Тох34-кодирующую последовательность под регуляторным контролем синтетического гибридного очень позднего промотора (обозначен как SPLSXIV и описан в заявке на патент США N 353847, зарегистрированной 17 мая 1989 года). pSp-Тох34 содержит полный ген полиэдрина под управлением своего собственного промотора и дополнительных последовательностей AcMNPV, фланкирующих ген полиэдрина. Последовательности AcMNPV показаны в виде скошенных линий; векторные последовательности показаны в виде открытой области. Фрагмент EcoRI, содержащий Тох34-кодирующую последовательность, инсерцируют в сайт EcoRI ниже от промотора SPLSXIV и в ориентации, противоположной ориентации гена полиэдрина. Генная экспрессия, направляемая гибридным промотором, выше экспрессии под управлением промотора полиэдрина. vSp-Тох34 имеет окклюдированный фенотип благодаря интактному гену полиэдрина.
Фиг. 5 иллюстрирует перемещаемую плазмиду pCap/Polh-Тох34, которая экспрессирует Тох34-кодирующую последовательность под регуляторным контролем синтезированного промотора Cap/Polh, описанного в работе Thiem et al. (1990), Gene 91:87-95. Фрагмент Bgl II/Kpn I из pEV-Тох34, содержащий последовательности Тох34, замещает ген CAT в pCap/Polh-CAT (Thiem et al. (1990) supra). Направление Тох34-кодирующих последовательностей (с точечным пунктиром) от промотора Сар/Polh (область, заштрихованная наискось) показано наконечником стрелы. Последовательности вируса дикого типа и вектора pUC8 обозначены участками со скошенными линиями и без каких-либо линий соответственно.
Фиг. 6 сравнивает приращения массы личинок Т.ni поздней четвертой и ранней пятой возрастных стадий после подкормки per os культуральной среды (ТС-100) и телами выключения либо AcMNPV дикого типа, либо vSp-Tox34. Высота гистограммы вдоль оси Y обозначает среднюю массу в миллиграммах 30 личинок на испытываемый вирус, если не указано что-либо иное. На более поздних этапах исследования среднюю массу определяют только в отношении живущих насекомых. Столбцы отклонений дают плюс или минус в два раза от стандартного отклонения. Как правило, средние стандартные отклонения плюс или минус в два раза содержатся приблизительно у 95% случаев экспериментальных измерений при стандартном распределении. Личинок выдерживают голодными в течение 24 ч перед их кормлением маленьким брикетиком диетического питания, который был погружен в суспензию 2•108 тел выключения на 1 мл воды. Предыдущие исследования показывают, что это составляет летальную дозу ЛД100. После кормления в течение 24 ч на основе зараженной диеты личинкам дают незараженную диету и взвешивают каждые 24 ч. Дни после кормления отложены на оси Х. 0 день обозначает день, когда личинкам давали незараженный корм. Гистограммы с пустыми, скошенными и заштрихованными наискось областями показывают незараженных личинок, личинок, зараженных вирусом AcMNPV дикого типа, и личинок, зараженных вирусом vSp-Tox34 соответственно. Столбики в пределах каждого гистограммного столбца показывают процентное содержание личинок, которые были парализованы (сплошные столбики) или окуклились (незаполненные столбики).
Фиг. 7 сравнивает приращения массы личинок первой возрастной стадии Т.ni после инъецирования 4•105 бляшкообразующих единиц невкрапленного AcMNPV (L-I- восходящий скос), vEV-Тох34 (незаполненный), vCap/Polh -Тох34 (заштрихованный), vETL-Тох34 (с косой штриховкой) или vSp-Tox34 (точечный пунктир). Незараженные личинки (нисходящий скос) инъецируют 2 мкл жидкости тканевой культуры. Личинок вначале взвешивают, затем заражают и помещают на безвирусную диету. Столбики отклонений обозначают ±2x стандартное отклонение, которое содержится у 95% экспериментальных измерений при стандартном отклонении. Вместо другого статистического анализа средние значения, при которых столбики отклонений не перекрываются, могут быть рассмотрены в качестве существенно отличающихся при доверительном уровне 0,05. В тех случаях, когда столбики отклонений перекрываются, применяют критерий Стьюдента для попарного сравнения двух средних значений (DECalc-PLUS Routine Library, Digital Equipment Corp., Nerrimack, New Hampshire) или множественный критерий размаха Дункана (SAS Base/Stat Release 6,04, SAS Institute, Cary, North Carolina). Средние значения, которые статистически являются разными, располагают в порядке возрастания и затем им дают буквенное обозначение (A, B, C. . . ), для того чтобы обозначить наиболее высокую и наиболее низкую среднюю массу в отношении обработок в течение дня за пределами столбика со стандартным отклонением.
Фиг. 8 представляет авторадиограммы полиакриламидных гелей с додецилсульфатом натрия, которые показывают белки, полученные из wt-AcMNPV- или vEV-Тох34-зараженных клеток S. frugiperda в зависимости от времени после заражения. Через 1 ч адсорбции зараженные клетки метят по типу пульса с помощью (35S)-цистеина на 6, 12, 24, 36 и 48 ч после заражения. Белки из жидкости тканевой культуры (интрацеллюлярные, фиг. 8A) и из клеточных лизатов (экстрацеллюлярные, фиг. 8B) денатурируют, восстанавливают и электрофорезируют с использованием 12% полиакриламидных гелей. Гели пропитывают флуорами, сушат и используют для экспонирования рентгеновской пленки. Стандарты размеров белков проводят в дальней левой дорожке каждого геля, и отмечают молекулярные массы. Белки из незараженных клеток отделяют в дорожке, меченной мнимо (мнимое заражение). Источники остальных белков указан на каждой части фиг. 8. Тяжи TxP-I, TxP-II и белка полиэдрина указаны стрелками.
Подробное описание изобретения.
Агент по биологической борьбе с насекомыми является агентом, эффективным при осуществлении борьбы с насекомыми-вредителями. Агенты по борьбе с насекомыми могут быть модифицированы с целью экспрессии специфического к насекомым паралитического нейротоксина для использования в настоящем изобретении, и эти агенты включают вирусы насекомых, энтомопатогенные бактерии и грибки, растениеколониeзирующие бактерии, растения и растительные вирусы, которые переносятся насекомыми или могут случайно проглатываться ими. Борьба упоминается в смысле ограничения пищевого поведения или уничтожения насекомого-вредителя. Агент по биологической борьбе с насекомыми в соответствии с настоящим изобретением должен оказывать токсический эффект, который является атрибутом по меньшей мере частично экспрессии последовательности, кодирующей специфический к насекомым нейротоксин. Токсичный к насекомым эффект относится к любому отрицательному эффекту в отношении искомого насекомого и выражается в виде паралича и/или уничтожения этого насекомого либо в виде изменения нормального поведения искомого насекомого, например, пищевого поведения, правильной реакции или других стереотипных черт поведения.
Паразитические для насекомых клещи - это клещи, которые пожирают насекомых. Многие из таких клещей инъецируют яд в хозяев насекомых, которыми они питаются. Такой яд содержит специфические к насекомым нейротоксины, призванные иммобилизировать насекомых-хозяев. Клещи, которые, наиболее вероятно экспрессируют гены специфического к насекомым паралитического токсина, включают клещей в пределах группы ventricosus, включая P. anobii, P.beckeri, P. emerqinatus, P. schwerdtfegeri, P. tuberculatus, P. tritici, P. ventricosus and P. zwoelferi.
Специфический к насекомым паралитический нейротоксин представляет собой полипептид, который вызывает паралич чувствительного насекомого. Личинки и/или взрослые насекомые могут быть поражены паралитическим для насекомого нейротоксином. Паралитический эффект нейротоксина первоначально может наблюдаться в виде поражения двигательной способности или другого поведения насекомого, включая пищевое поведение. Специфические к насекомым нейротоксины - это те, которые пагубно действуют на насекомых и оказывают ничтожное воздействие на высших животных, особенно млекопитающих. Специфические к насекомым паралитические нейротоксины в соответствии с настоящим изобретением приведены на примерах генных продуктов Тох-34 и Тох21а, а также белков TxP-I и TxP-II, продуцируемых P. tritici. Выведенные аминокислотные последовательности двух характерных специфических к насекомым паралитических белков представлены в табл. 2 и 4. Следует понять, что любой белок с аминокислотной последовательностью, в основном идентичной (по крайней мере 70% идентичности или по крайней мере 70% сходности) с аминокислотной последовательностью от аспартата, кодируемого приблизительно у 118 нуклеотида до цистеина, кодируемого приблизительно у 873 нуклеотида или в основном идентичной последовательности, приведенной в табл. 4, который оказывает поддающийся измерению токсический эффект в отношении насекомых, является функциональным эквивалентом белков Тох34 или Тох21а. Предпочтительно, если аминокислотная последовательность специфического к насекомым паралитического нейротоксина составляет по крайней мере около 83% идентичности (с расхождениями в одной последовательности, рассматриваемой в качестве неидентичной, по сравнению с последовательностями аминокислот, приведенными в табл. 2 или 4), или по крайней мере около 83% сходства. Токсин, функционально эквивалентный нейротоксинам настоящего изобретения, вызывает аналогичный сокращательный паралич мышц у насекомых, который вызывается генными продуктами Тох34 и Тох21а. В биологической науке хорошо известно, что некоторые аминокислотные замещения можно осуществить в белковых последовательностях без воздействия на функцию белка. Как правило, консервативные аминокислотные замещения или замещения сходных аминокислот выдерживаются без oказания воздействия на функцию белков. Аналогичными аминокислотами могут быть те, которые являются аналогичными по размеру и/или зарядовым свойствам, например аспартат и глутамат, с одной стороны, и изолейцин и валин, с другой стороны, являются парами аналогичных аминокислот. Сходство между аминокислотными парами установлено в науке целым рядом способов. Например, Dayhoff et al. (1978) в Атласе последовательности и структуры белков, том 5, дополнение 3, глава 22, стр. 345-352, введенном в данное описание в качестве отсылки, предлагают вниманию таблицы частот отношении аминокислотных замещений, которые можно использовать в качестве меры измерения аминокислотной аналогичности. Таблицы частот Dayhoff et al. основаны на сравнениях аминокислотных последовательностей для белков, имеющих одинаковую функцию от разнообразных эволюционно различных источников.
Дополнительные функциональные эквиваленты специфического к насекомым паралитического нейротоксина включают полипептиды с частями аминокислотных последовательностей, отличающимися значительной идентичностью с Тох34 или Тох21а, или полипептиды, которые сами являются частью белка ТхР-1 с полной длиной или которые имеют аминокислотную последовательность белка Тох34 или Тох21а, в которую можно сделать инсерцию и которые сохраняют биологическую активность специфического к насекомым паралитического нейротоксина, оказывающего воздействие на сокращательный паралич мышц.
Гены специфического к насекомым паралитического нейротоксина можно обнаружить в хищных для насекомых клещах, включающих, но не ограничивающихся теми, которые представлены в табл. 1, особенно в тех, которые принадлежат к группе ventricosus, или в других паразитах или хищниках в отношении насекомых. Гены, гомологичные генам Тох34 и Тох21а настоящего изобретения, могут быть идентифицированы в клещах или других источниках с помощью нуклеиновокислотной гибридизации к последовательностям, описываемым в настоящем изобретении, или с помощью перекрестной реакции токсин-молекул с антителом, специфическим для токсинов настоящего изобретения, или с помощью других способов, известных специалистам, включая использование методики PCR (полимеразно-цепьевой реакции), осуществляемой с использованием олигонуклеотидов, соответствующих консервативным или недвусмысленным областям гена(ов) токсина, приведенным в данном описании. В принципе можно идентифицировать любой ген специфического к насекомым нейротоксина, и этот ген можно экспрессировать в бакуловирусном векторе. Биологическую активность экспрессированного белка можно легко определить, а эффективность такого генетически модифицированного вектора можно оценить с использованием доктрины настоящего изобретения в сочетании с хорошо известными методиками.
Молекула рекомбинантной ДНК является одной, которую можно получить либо естественными процессами с использованием известных методов, управляемых человеком для получения желаемого результата, либо искусственными способами на основе частей, имеющих происхождение от гетерологичных источников, причем эти части могут быть встречающимися в природе или химически синтезированными молекулами, и эти части соединены путем лигирования или других хорошо известных средств.
Генетическая модификация с целью содержания и экспрессии гена специфического к насекомым нейротоксина, вызывающего паралич насекомых, означает, что нуклеотидные последовательности, кодирующие такой белок и направляющие его синтез, вводятся в агент по биологической борьбе с насекомыми или клетку хозяина, которая в естественном состоянии не содержит этот ген, с целью того, чтобы модифицированный агент или клетка могли продуцировать этот белок нейротоксина. Для инсерции экспрессируемого гена нейротоксина в агент по борьбе с насекомыми или клетку хозяина можно использовать любые средства, известные в данной области техники.
Для управления транскрипцией или трансляцией нуклеотидной последовательности, кодирующей специфический к насекомым паралитический нейротоксин, можно использовать любые известные регуляторные последовательности, промоторные и/или промоторно-ассоциированные последовательности, которые направляют генную экспрессию в искомом зараженном и незараженном хозяине или зараженной или незараженной клетке-хозяине.
Понятно, что специалист без труда определит выбор необходимых регуляторных последовательностей или промоторов. Например, в отношении вируса насекомых, например бакуловируса, пригодны промоторы, особенно поздние или очень поздние промоторы, синтетические промоторы или гибридные промоторы, если требуются высокие уровни экспрессии. Однако, если целью является получение паралитического нейротоксина для ограничения в пище личинок насекомых до наиболее коротких по возможности периодов или для расширения эффективного диапазона хозяев вируса насекомых, тогда желательно поместить ген паралитического нейротоксина под регуляторное управление бакуловирусного или небакуловирусного (например, насекомого) промотора, экспрессированного раньше в процессе заражения.
Бакуловирус NPV, выделенный из Autographa californica (Lepidoptera: Noctuidae), особенно AcMNPV, представляет собой вирус насекомых, приведенный в качестве примера в настоящем описании. Термины AcMNPV и AcNPV используются в отношении одного и того же вируса. Полагают, что термин AcMNPV в настоящее время более распространен в области вирусологии. Отмечается, что инфекционная способность большинства NPVs ограничена членами рода или семейства первоначального хозяина (см. Groner (1986) supra). Также отмечается, что бакуловирусы AcMNPV реплицируются в нескольких семействах Lepidoptera, однако их инфекционная способность ограничена на этот порядок. Другие энтомопатогенне вирусы, пригодные в настоящем изобретении, включают, не ограничиваясь, естественно, другими бакуловирусами, иридовирусами, парвовирусами, нодамуровирусами, CPVs, энтомопоксивирусами, асковирусами и ретровирусами. Специалисты знают, как инсерцировать экспрессируемый ген в вирусный геном в сайте, который не препятствует осуществлению вирусных репликативных функций. Аналогичным образом специалист может отобрать промотор с желаемой эффективностью действия и экспрессией для того, чтобы управлять экспрессией специфического к насекомым гена паралитического нейротоксина в желательном вирусном векторе. Искомое насекомое будет диктовать отбор вируса, а конкретный тип вируса, подлежащий инженерингу, будет определять отбор соответствующего промотора.
Используемый в данном описании агент по борьбе с насекомыми представляет собой композицию или активный компонент композиции, которая оказывает пагубное воздействие на насекомых-вредителей. В ответ на действие агента по борьбе с насекомыми в результате экспрессии паралитического нейротоксина снижается питание насекомых или другие стороны поведения и наступает смерть. Агент по борьбе с насекомыми настоящего изобретения предпочтительно является вирусом насекомых, генетически модифицированным для экспрессии гетерологичного гена, кодирующего специфический к насекомым паралитический нейротоксин, однако он может быть энтомопатогенным грибком или бактерией, которую генетически произвели с целью экспрессии гетерологичного гена, кодирующего специфический к насекомым паралитический нейротоксин. Предпочтительно токсин секрецирует в гемолимфу насекомого, зараженного энтомопатогеном, построенным методами рекомбинантных ДНК.
Инсектицидные композиции, пригодные для применений к растениям для борьбы с насекомыми-вредителями, содержат сельскохозяйственно пригодный носитель и агент по борьбе с насекомыми. Применение инсектицидной композиции настоящего изобретения может защитить растения от насекомых-вредителей благодаря снижению питания и уничтожению восприимчивых насекомых.
Специалист знает, как выбрать агент по борьбе с насекомыми, например вирус насекомых, который пригоден для борьбы с определенным видом насекомого-вредителя. Специалист также знает, как направить экспрессию специфического к насекомым паралитического нейротоксина в определенном агенте по борьбе с насекомыми или в клетке-хозяине.
Следует понять, что насекомые-вредители могут поражаться агентом по борьбе с насекомыми в соответствии с настоящим изобретением с применением традиционных методов, включая переваривание, ингаляцию или непосредственный контакт агента по борьбе с насекомыми.
Паразиты на насекомых, включая бактерии, вирусы, грибки, клещей, нематод, простейших и насекомых, также могут быть генетически модифицированы для экспрессии гена, специфического к насекомым паралитического нейротоксина. Паразитизм или заражение соответствующих насекомых такими паразитами на насекомых приводит к параличу этих насекомых, помимо сиптоматологии, обычно ассоциируемой с немодифицированным паразитом. Паралич зараженных насекомых усугубляет болезненное состояние насекомых. Кормление и заражение насекомого-вредителя снижает уровень питания и ускоряет смерть. Специфическими примерами таких токсин-белков являются (не ограничиваясь) Тох34 и Тох21а.
ДНК-последовательности, кодирующие специфический к насекомым паралитический нейротоксин, экспрессированные под регуляторным контролем промотора, подходящего для организма, могут быть использованы с целью генетической модификации организма для продуцирования агента по борьбе с насекомыми. Исковые организмы для такой генетической модификации включают паразиты на насекомых, растенияx и нефитопатогенные растениеколониeзирующие бактерии.
Главное использование генетически полученных агентов по борьбе с насекомыми, предпочтительно бакуловирусов, в соответствии с настоящим изобретением состоит в их применении в качестве компонентов сельскохозяйственных композиций для нанесения на растения, растительную среду или распределения в приманках с целью осуществления биологической борьбы с насекомыми-вредителями. Можно также использовать агенты по борьбе с насекомыми в соответствии с настоящим изобретением при проведении борьбы с другими насекомыми-вредителями при соответствующем выборе определенного организма, генетически модифицированного для экспрессии специфического к насекомым паралитического нейротоксина. Например, существуют бакуловирусы, которые специфическим образом заражают и комаров, и блох. Искомое насекомое направляет специалиста при отборе агента по борьбе с насекомыми, экспрессирующего паралитический токсин, а определенный агент обуславливает отбор соответствующей промоторной последовательности. В данной области знаний известно множество вариантов получения таких сельскохозяйственно пригодных и/или приемлемых в отношении окружающих условий композиций для проведения борьбы с насекомыми.
Концентрация агента по борьбе с насекомыми, необходимая для получения инсектицидно эффективных композиций с целью осуществления борьбы с насекомым-вредителем, зависит от типа организма и нейротоксина, а также от рецептуры композиции. Инсектицидно эффективную концентрацию агента по борьбе с насекомыми в пределах композиции можно легко определить. Например, эффективную в инсектицидном плане концентрацию вируса можно легко определить с использованием известных методик в области вирусологии.
Сельскохозяйственные композиции для борьбы с насекомыми-вредителями растений, должны быть пригодны для сельскохозяйственного применения и диспергации в жидких средах. Аналогичным образом композиции для борьбы с другими насекомыми-вредителями должны быть приемлемыми с точки зрения условий окружающей среды. Как правило, компоненты композиции должны быть нефитотоксичными и не приносящими вред целостности вкрапленного вируса. Некорневое внесение не должно повредить или разрушить листья растений. Кроме подходящих твердых или, более предпочтительно, жидких носителей сельскохозяйственные композиции могут включать адгезивы, эмульгаторы и смачиватели, но не те компоненты, которые задерживают питание насекомого или препятствуют проявлению любой вирусной функции. Также может быть желательным добавлять компоненты, которые защищают агент по борьбе с насекомыми от инактивации под воздействием ультрафиолетового света, или компоненты, которые служат в качестве стимуляторов для повышения потенции и/или вирулентности энтомопатогена. Сельскохозяйственные композиции для борьбы с насекомыми-вредителями также могут включать агенты, стимулирующие питание насекомых.
Имеются обзоры, относящиеся к способам применения агентов по биологической борьбе с насекомыми, а также к способам и композициям для сельскохозяйственного применения (cм. , например, Couch and Ignoffo (1981) в работе Microbial. Control of Pests and Plant Disease 1970-1980, Burges (ed.) chapter 34, p. 621-634; Corke and Rishbeth, ibid, chapter 39, p. 717-732; Brockwell (1980) в Methods for Evaluating Nitrogen Fixation, Bergersen (ed.) p. 417-488; Burt on (1982) в Biological Nitrogen Fixation Technology for Tropical Agriculture, Graham and Harris (eds.) p. 105-114; and Roughley (1982) ibid, p. 115-127; The Biology of Baciloviruses, v. 11, supra, а также ссылки, приведенные выше).
Изобретение иллюстрируется следующими примерами, которые ни в коем случае не должны истолковываться как ограничивающие его объем. Следует понять, что можно обратиться к другим вариантам, модификациям, альтернативам и эквивалентам материалов и методик, описываемых в данном изобретении, которые после прочтения описания могут показаться приемлемыми для специалиста в данной области техники в пределах объема настоящего изобретения и/или объема прилагаемой формулы изобретения.
Пример 1. Клонирование гена TxP-l P. tritici.
Всю полиаденилированную ДНК выделяют из комбинации ищущих хозяина и беременных клещей женского пола, используя методики, описанные в работе Davis et al. (1986), Basis Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co. , New York; Jacobson (1987), Meth. Enzymol. 152:254. кДНК продуцируют с использованием указанной полиаденилированной ДНК в качестве матрицы. Линкеры EcoRI прибавляют в рецептуру, и кДНК клонируют в лямбда ZAP-II (из Stratagene, La Jolla, California) для изготовления библиотеки кДНК.
Шесть миллионов бляшек подвергают скринингу с использованием поликлонального антитела, поднятого против описанного выше TxP-I в соответствии с рекомендациями изготовителя (Stratagene, La Jolla, California). Идентифицируют, что многочисленные клоны проявляют значительную перекрестную реакцию с этим антителом.
Начиная с наиболее ярко выраженных в смысле иммуноположительности клонов кДНК восемь различных антителоположительных кДНК-вставок субклонируют из лямбда-фага в плазмиды и секвенируют. Предсказанные открытые рамки считывания используют для поиска GENBANK (выделение 60,0) на гомологии к белковым последовательностям. Четыре из этих кДНК-вставок, включая наиболее иммуноположительные кДНК, кодируют белки, которые в значительной мере гомологичны миозину, топоизомеразе II, фосфоинозитид-специфической фосфолипазе C и хитшоковому белку 70. Один клон содержит множество фрагментов EcoRI и, как полагают, поэтому содержит и множество кДНК-вставок. Внимание обращается на один из фрагментов этой рекомбинантной плазмиды, поскольку он проявляет слабую гибридизацию к частично дегенеративному зонду из 62 оснований. Гибридизирующий фрагмент EcoRI этой плазмиды расположен ниже трех других фрагментов EcoRI и поэтому находится в относительно удаленном месте в оригинальном лямбда-клоне от фагового промотора, который при построении этой векторной системы должен был направлять генную экспрессию на обнаружение с помощью антител. Поэтому удивительно, что оригинальный лямбда-клон продуцирует достаточное количество белка для слабой перекрестной реакции с анти-TxP-I антителом, которая наблюдается в этой системе, поскольку можно было бы ожидать, что из отдаленной вставки экспрессия, направляемая фагом, была бы незначительной или вовсе отсутствовала. Затем секвенируют гибридизирующий фрагмент EcoRI; он содержит открытую рамку считывания, которая, как прогнозировалось, кодирует белок с аминокислотной последовательностью, идентичной последовательности 21 N-концевых аминокислот, эмпирически определенной для зрелого токсина TxP-I.
Токсин-кодирующий фрагмент, обозначенный Тох34, клонируют и секвенируют с использованием набора для секвенирования и методики, приведенной изготовителем (SequenaseTM, US Biochemical, Cleveland, Ohio). Нуклеотидная последовательность первого идентифицированного фрагмента EcoRI, содержащего TxP-I-гомологичную последовательность (обозначена Тох34), представлена в табл. 2 вместе с выведенной аминокислотной последовательностью. Аминокислотная последовательность, согласующая N-концевую аминокислотную последовательность, подчеркнута. Открытая рамка считывания простирается вверх от подчеркнутой последовательности, предполагая, что токсин синтезирован в виде претоксина или препротоксина. Синтез TxP-I в форме претоксина или препротоксина может облегчить секрецию, складчатость токсина и/или активацию токсина за пределами клетки. Сравнение эмпирической аминокислотной композиции и выведенной аминокислотной композиции представлено в табл. 3. Выведенная аминокислотная последовательность TxP-I не проявляет существенной гомологии с другим любым белком в GENBANK (выделение 60,0).
Считают, что фрагмент EcoRI, вероятно, кодирует TxP-I по следующим критериям: являясь частью лямбда-клона, проявляющего перекрестную реакционную способность с TxP-I-специфической антисывороткой, содержащий ДНК-последовательность, которая включает открытую рамку считывания, для белка, имеющего, как прогнозируют, молекулярную массу около 30 кДа, и открытую рамку считывания, кодирующую последовательность, идентичную 21 N-концевым аминокислотам TxP-I, и аминокислотный состав, сравнимый с составом TxP-I. Этот фрагмент обозначают как Тох-34. Выведенная аминокислотная последовательность позволяет приписать шестнадцатой аминокислоте зрелого токсина свойства цистеина.
Пример 2. Олигонуклеотидные зонды и гибридизационные эксперименты.
Два олигонуклеотидных зонда, последовательности которых основаны на N-концевой последовательности TxP-I, как опубликовано Tomalski et al., (1989), supra, синтезируют, как приведено в табл. 7. Зонд Pt-N1 является смесью 16 семнадцатимеров, использующих частично дегенеративную нуклеотидную последовательность, выведенную из N-концевых шести аминокислот, и содержащих три остатка инозина в положениях дегенеративных кодонов. Вычислено, что зонд имеет Td (температуру, при которой диссоциируется половина дуплексов), равную от 38 до 43oC, где Тd= 2oC (число остатков A+T) + 4oC (число остатков G+C) для дуплексов длиной 11-23 пары оснований в 1 М Na+. Плазмидную ДНК изымают от иммуноположительных бляшек с использованием методик, описываемых в рекомендациях Stratagen, La Jolla, California, разрезают с помощью EcoRI (который отсекает вставку кДНК от плазмиды), фракционируют агарозным гель-электрофорезом и затем подвергают блоттингу на катионизированной мембране Zeta-ProbeTM (Bio-Rad Laboratories Richmond, Califonia) щелочным капиллярным переносом с помощью 0,5 М NaOH/1,5 М NaCl. Фильтр промывают в 2 х SSC/0,1% додецилсульфата натрия при комнатной температуре (КТ), предварительно гибридизируют в гибридизационном буфере (6х SSC/5 х раствор Денгардта/0,5% додецилсульфата натрия/20 мкг/мл ДНК телячьего тимуса/ 5% декстрансульфата) без зонда в течение 1 ч, гибридизируют в свежем гибридизационном буфере, содержащем приблизительно 1•106 циклов в 1 мин радиоактивномеченого олигонуклеотида на 1 мл в течение 14 ч при температуре 28-30oC (около 10oC ниже, чем вычислено для Td в отношении Pt-N1). Затем блот промывают дважды в 2 х SSC/0,1% додецилсульфата натрия в течение 15 мин каждый раз при температуре гибридизации, после чего подвергают авторадиографии при температуре -80oC в присутствии усиливающих экранов. После экспонирования блот вновь промывают в том же самом буфере при повышенной температуре при 5oC ниже ожидаемой для Td и вновь подвергают радиоавтографии. Промывки также повторяют с использованием температур Td на минимально ожидаемом уровне (38oC) и максимально ожидаемом уровне (43oC).
Фрагменты вставок, проявляющие гибридизацию в наиболее строгих условиях, секвенируют в качестве последовательностей, кодирующих кандидат TxP-I. Некоторые негибридизирующие вставки также секвенируют, поскольку неполная кДНК TxP-I может потерять последовательности, гомологичные зонду Pt-N1. Получают кДНК, которые проявляют поперечную реактивность к антисыворотке TxP-I и способны гибридизировать к зонду Pt-N1, но не кодировать TxP-I.
Конструируют более длинный зонд, так как более длинные и минимально дегенерированные зонды имеют более высокую специфичность, нежели короткие зонды, и поэтому более подходят для зондирования более сложных последовательностей. Зонд Pt-N2 синтезируют в виде смеси 32 шестидесятидвухмеров; он представляет полную N-концевую последовательность 21 аминокислоты (см. табл. 7). При построении Pt-N2 дегенерации интродуцируют в колеблющееся положение в некоторых случаях, когда существует выбор из двух кодонов. Полагают, что эта ограниченная дегенерация обеспечила бы создание протяженных областей гомологии, что повысило бы специфичность зонда. Предположение сделано в соответствии с предпочтительным использованием кодонов в Drosophila в тех случаях, когда существует возможность трех или четырех выборов в колеблющихся положениях. Условия гибридизации для зондирования либо лямбда кДНК-библиотеки, либо фрагментов субклонированной кДНК в виде плазмидной ДНК с помощью Pt-N2, соответствуют описанным выше, за исключением того, что используют более высокие температуры, подходящие для более длинных зондов: 40-42oC для гибридизации с низкой степенью суровости и начальной промывки с последующими промывками при более высокой температуре (52 и 68oC) с целью повышения степени суровости гибридизации.
Использование любого зонда для скрининга лифтов лямбда-фага не было успешным; гибридизации в менее суровых условиях приводили к получению бляшек с высокими фонами, тогда как суровые условия приводили к получению ложных положительных бляшек. Ни один зонд не смог успешно идентифицировать Тох34-содержащий лямбда-фаг либо в его очищенной форме, либо из кДНК-библиотеки. Зонд Pt-N1 гибридизирует к последовательностям вектора BluescriptTM к нескольким клонам при менее строгих условиях и к hsp70-гомологичной последовательности, а также к последовательности Тох34. Pt-N2 гибридизирует к последовательности Тох34 при относительно низких условиях строгости, а также к последовательности вектора BluescriptTM Тох34 секвенируют несмотря на отсутствие убедительного гибридизационного результата. Как указано выше, Тох34 кодирует белок Тхр-I.
Пример 3. Клонирование других генов, связанных с TxP-I кДНК-библиотеки, анализируют с целью определения того, содержит ли она другие последовательности, связанные с последовательностью Тох34. Фрагмент EcoRI, несущий полный ген Тох34, очищают гель-электрофорезом, радиоактивно метят до высокой удельной активности (Feinberg et al. (1983). Anal. Biochem. 132:6-13; Addendum (1984) Anal. Biochem. 137; 266-267) и используют в качестве гибридизационного зонда для выделения дополнительных TxP-I-гомологичных последовательностей из кДНК-библиотеки лямбда ZAP-II. Условия гибридизации идентичны тем, которые используют выше, за исключением того, что гибридизацию осуществляют при температуре 65-68oC.
Выделяют около 40 дополнительных кДHК-клонов, которые проявляют значительную гомологию к зонду TxP-I. Эти кДНК-вставки анализируют перевариванием эндонуклеазами рестрикции с помощью фрагмента EcoRI, а также гибридизацией по Саузерну. Большинство кДНК-вставок аналогично по размеру фрагменту EcoRI Тох- 34, используемому в качестве зонда. Ни один из них не имеет те же "верхние" фрагменты размером 1,5 килопар оснований, которые обнаружены в начальном лямбда-изоляте, содержащем последовательность Тох34, что подтверждает вывод о том, что эти "верхние" фрагменты EcoRI существуют благодаря артефактному клонированию. Отмечается, однако, что несколько из числа вновь выделенных фрагментов EcoRI, содержащих кДНК-вставки, которые гибридизируют к фрагменту EcoRI, содержащему кДНК Тох34, отличаются по размеру от фрагмента EcoRI Тох34. Более мелкие кДНК теоретически могут быть объяснены неполным кДНК-синтезом, однако более крупные кДНК объяснить более трудно.
Для того чтобы охарактеризовать кДНК-вставки, которые крупнее, нежели начальный TxP-I-изолят, 5'- и 3'-конца кДНК секвенируют, как описано выше, используя последовательность согласования с олигонуклеотидом возле окончаний кДНК-вставок Тох34 в качестве праймеров. 5'-концы четырех более крупных кДНК-вставок секвенируют с использованием праймера, расположенного в пределах 5'-окончания открытой рамки считывания Тох34. 5'-окончание одного кДНК-клона по существу идентично по размеру и нуклеотидной последовательности кДНК-клону Тох34 (отсутствует один нуклеотид в сайте клонирования, что является тривиальным отличием), 5'-концы трех других кДНК-клонов отличаются по длине и последовательности от кДНК-клона Тох34. Из этих трех клонов два содержат идентичные N-концевые 13 аминокислот, что и Тох34, однако отличаются по длине и последовательности, находящейся выше нетранслированной лидерной области. Третий из этих клонов (клон Тох21а) отличается как в N-концевой последовательности (обсуждается ниже), так и в находящейся выше 5'-нетранслированной лидерной области.
3'-окончания семи токсин-родственных кДНК секвенируют с использованием праймера, расположенного в пределах 3'-конца открытой рамки считывания Тох34, 3'-концы всех клонов отличаются не только по размеру, но также и по последовательности. Приблизительно 60 пар оснований ниже от кодона терминации открытой рамки считывания TxP-I последовательности вставок отклоняются в значительной степени. Это происходит не за счет полиаденилирования или различий в векторных последовательностях. Напротив, кажется, что TxP-I-родственные гены отличаются благодаря генетической гетерогенности у клещей, из которых РНК экстрагируют для построения кДНК-библиотеки, или благодаря существованию многогенного семейства токсинов в пределах генома клещей. Табл. 5 дает сравнение 3'- окончаний нескольких токсин-родственных кДНК-клонов, которые идентифицированы путем зондирования кДНК-библиотеки клещей с помощью фрагмента Тох34. Последовательности выравнены относительно последовательности Тох34. Приблизительно на расстоянии 50 оснований ниже от конца области, кодирующей токсин (+873 в Тох34), последовательности расходятся.
Вторую кДНК-вставку (Tox21a) секвенируют во всей ее полноте с целью исследования природы отклонения в характере токсин-гена. Олигонуклеотидные праймеры, гомологичные Тох34, синтезируют с целью содействия процессу секвенирования. Из-за нуклеотидного расхождения между двумя генами праймеры, специфичные для некоторых внутренних областей вставки Тох21a, синтезируют с тем, чтобы завершить построение последовательности. Табл. 4 представляет данные по этой последовательности. Есть множество различий в нуклеотидной последовательности Тох21a по сравнению с последовательностью, кодирующей Тох34, что указывает на существование многообразия токсин-генов в кДНК-библиотеке, каждый из которых кодирует TxP-I-родственный токсин, но отличается в аминокислотной последовательности. Табл. 6 представляет сравнение выведенных аминокислотных последовательностей для Тох34 и Тох21a. Последовательности на 88,9% аналогичны и на 82,8% идентичны. Две последовательности из пяти аминокислот "инсерцированы" в последовательность Тох21a по сравнению с последовательностью Тох34. В результате предсказанная N-концевая последовательность зрелого продукта гена Тох21а не была бы такой же, как и N-концевая последовательность, определенная эмпирически для TxP-I. Кроме того, первый в рамке ATG последовательности Тох21a располагается на одной линии со вторым в рамке ATG последовательности Тох34. Таким образом, эффективной могла бы стать делеция 13 аминокислот у N-окончания путативной препротоксин-формы Tox21a. Делецию можно было бы прогнозировать без какого-либо воздействия на аминокислотную последовательность зрелого токсина, тогда как первая инсерция могла бы быть у самого N-окончания токсина. Все остатки цистеина сохраняются между "зрелыми" белками, согласующимися с теми аминокислотами, которые выполняют роль посредника при складывании трехмерной структуры зрелого токсина.
Пример 4. Экспрессия бакуловируса Тох34-кодирующей последовательности.
С целью демонстрации того, что клонированный ген Тох34 на самом деле кодирует токсин насекомых, последовательность Тох34 инсерцируют в бакуловирусный геном (AcMNPV) под управлением сильного очень позднего промотора LSXIV, как описано в международной заявке на патент PCT/90/02814, зарегистрированной 17 мая 1990 года; в работе Ooi et al. (1989), J. Molec. Biol. 210: 721-736; в работе Rankin et al. (1988), Gene 70:39-49, причем все они введены в данное описание в качестве отсылочных материалов.
Все вирусы изначально происходят от AcMNPV L-I, (Lee and Miller (1978), J. Virol. 27: 754), очищаются от бляшек и размножаются в клетках IPLB-SF-21 Spodoptera frugiperda (клетках Sf) (Vaughn et al. (1977) in vitro 13:213-217) в среде ТС-100 (GIBCO, Grand Island, New York), как описано ранее (Lee and Miller (1978) supra; Miller et al. (1986) в работе Genetic Engineering, Principles and Methods, vol. 8 (eds. J. Setlow and A. Hollaender), Plenum Press, New York, p. 277-298).
Первая стадия состоит в построении перемещаемой плазмиды pEV-рТох34 (приведена на фиг. 1). Эта перемещаемая плазмида позволяет осуществить аллельное замещение гена полиэдрина AcMNPV геном Тох34 под регуляторным контролем сильного промотора LSXVI.
pEV-Тох34 конструируют путем инсерции фрагмента EcoRI, содержащего Тох34-кодирующую последовательность, в EcoRI-разрезанную pEVmodXIV, которая поставляет мощный промотор LSXIV и последовательности, фланкирующие ген полиэдрина AcMNPV. ДНК AcMPNV и pEV-Тох34 дикого типа совместно трансфецируют в клетки насекомых, как описано в работе Miller et al. (1986) supra, и рекомбинантный вирус выделяют и обозначают vEV-Тох34 после отбора на основе его вкрапленно-отрицательного фенотипа и скрининга на должные события аллельного замещения с помощью анализа эндонуклеазами рестрикции и гибридизации по Саузерну.
Экспрессию гена Тох34 в vEV-Тох34-зараженных клетках насекомых исследуют следующим образом. Клетки Sf отдельно заражают токсинами AcMNPV и vEV-Тох34, как описано в работе Lee et al. (1978) supra в работе Miller et al. (1986) supra, и жидкости клеточных культур из контрольных (незараженных), AcMNPV и vEV-Тох34- зараженных клеток собирают через 48 ч после заражения. Личинок моли большой восковой Galleria mellonella инъецируют 5 мкл аликвотами культуральных жидкостей. Личинки, которым вводят культуральную жидкость от vEV-Тох34-зараженных клеток, парализуются в течение 2 мин, тогда как личинки насекомых, которым вводят клетки, зараженные AcMNPV дикого типа, не проявляют никакой паралитической реакции в течение длительного периода времени (несколько суток). Парализованные личинки при визуальном рассмотрении неподвижны, у них отсутствует реакция выпрямления (способность вставать в стойку, после того как они повернуты на спину) и они не могут плести шелк для обкладывания своих норок (стереотипное поведение личинок моли большой восковой). Контрольные личинки проявляют движение, реакцию выпрямления и прядение шелка. Эти результаты показывают, что нейропаралитический токсин продуцируется в vEV-Тох34-зараженных клетках, но не в клетках, зараженных AcMNPV дикого типа, посредством экспрессии последовательности, кодирующей кДНК Тох34, и что этот токсин секрецируется во внеклеточную среду. Тип паралича, проявляемый под действием продукта гена Тох34, напоминает паралич, наблюдаемый при введении личинкам TxP-I, TxP-II и/или TxP-III.
Для изучения способности бакуловируса, несущего ген Тох34, контролировать пищевое поведение личинок насекомых во время заражения, насекомых заражают с помощью vEV-Тох34 путем инъекции очищенного вируса в гемолимфу испытуемых личинок. Личинoк Trichoplusiani ранней четвертой возрастной стадии инъецируют средой ТС-100 (мнимозараженные) или средой, содержащей частицы баддинг-вируса из культур клеток, зараженных либо AcMNPV дикого типа, либо vEV-Тох34 (4•105 бляшкoобразующих единиц вируса на личинку). Контрольные личинки включают тех личинок, которые заражены культуральной средой, или тех, которые заражены AcMNPV дикого типа. Зараженные насекомые (vEV-Тох34) парализуются (иммобилизация и отсутствие реакции выпрямления) на 36 ч после заражения.
Пример 5. Сходство Тох34-кодируемых белков и TxP-I и TxP-II.
Размеры продуктов гена Тох34, получаемых клетками, зараженными vEV-Тох34 (клетки Sf), исследуют авторадиографией вслед за пульсационным мечением и электрофорезом в полиакриламидных гелях с додецилсульфатом натрия. Через 1 ч после заражения или периода мнимого заражения клетки метят с помощью (35S)-цистеина на 6, 12, 24, 36 и 48 ч после заражения. Затем растворы для мечения удаляют и клетки покрывают непополненными средами ТС-100 и инкубируют в течение 2 ч. Клетки (содержащие внутриклеточные белки) и бесклеточную среду (содержащую секрецированные белки) собирают отдельно. Клетки лизируют. Внутриклеточные и секрецированные белки денатурируют и восстанавливают в буфере, содержащем додецилсульфат натрия и дитиотрейтол, после чего разделяют электрофорезом в полиакриламидных гелях с додецилсульфатом натрия, используя 12%-ные полиакриламидные гели. Гели пропитывают флуорами, сушат и подвергают радиоавтографии. Результаты представлены на фиг. 8. Белковые стандарты приведены в дальних левых дорожках, а их молекулярные массы даны в килодальтонах. Белки из незараженных клеток собирают в дорожках, помеченных "мнимый". Кроме того, то же самое изменение в подвижности, обнаруженное с помощью электрофореза в полиакриламидных гелях с додецилсульфатом натрия, наблюдается в отношении продуктов гена Тох34 при его снижении у белков, очищенных из натурального источника. Присутствие трех полос показывает, что TxP-I (приблизительно 27 килодальтон) и TxP-II (приблизительно 28 килодальтон и приблизительно 29 килодальтон) соотносятся как молекулы зрелого токсина протоксина и препротоксина. TxP-I, TxP-II и полосы белка полиэдрина приведены на фиг. 8 с помощью стрелок. TxP-III содержит три полосы в пределах TxP-I и TxP-II. Фиг. 8 показывает, что три белка, продуцируемые vEV-Tox34-зараженными клетками, соответствуют по размеру трем токсин-родственным белкам, описанным Tomalski et al. (1988) supra; Tomalski et al. (1989) supra. Таким образом, экспрессия последовательности, кодирующей Тох34, приводит к получению TxP-I и TxP-II, которые вместе составляют TxP-III. Также возможно, поскольку Тох34 имеет два кодона метионина возле 5'-окончания кодирующей последовательности, один из которых не обнаружен в последовательности, кодирующей Тох21а, что две полосы белка TxP-II отражают чередующиеся сайты трансляционного начала. Эти возможности можно отличить N-концевым секвенированием каждого из белков компонента TxP-II или сайт-направленным мутагенезом любого одного или обоих соответствующих кодонов ATG.
Пример 6. Дополнительные производные AcMNPV, генетически полученные для экспрессии гена нейротоксина клещей.
Для оценки того, улучшает ли экспрессия TxP-II-кодирующей последовательности вирус AcMNPV в качестве пестицида, сравнивают паралич и приращение массы мнимозараженных насекомых (ТС-100) и насекомых, зараженных AcMNPV дикого типа (L-I) или vEV-Тох34. Результаты сравнения представлены на фиг. 2. На 24 ч после заражения (время, взятое за 0 ч после заражения (pi) в данном исследовании) личинки насекомых из каждой группы контрольных или испытуемых личинок весят в среднем 60-80 мг. На 24 ч после заражения личинки насекомых, зараженные AcMNPV дикого типа, показывают значительно большее приращение массы, нежели мнимозараженные или vEV-Tox34-зараженные личинки. Ранее наблюдалось, что заражение вирусом дикого типа действительно повышает личиночное питание в течение первых дней заражения (заявка на патент США N 373952, зарегистрирована 29 июня 1989 года). На 36 ч после заражения все насекомые в группе, зараженной вирусом vEV-Тох34, парализуются (неподвижность, отсутствие реакции выпрямления), но ни одна из числа мнимозараженных или зараженных вирусом AcMNPV дикого типа личинок не парализована. Масса vEV-Тох34-зараженных личинок значительно ниже других групп; массы vEV-Тох34-зараженных личинок снижаются фактически в период от 24 до 36 ч после заражения. Это может быть результатом обезвоживания организма за счет потери пищевого поведения. Данная тенденция продолжается на протяжении 60 ч после заражения. На 96 ч после заражения все мнимозараженные личинки окукливаются, тогда как личинки, зараженные AcMNPV дикого типа и vEV-Тох34, умирают или парализуются. Все вирус-инфицированные насекомые проявляют типичные признаки вирусной инфекции к этому времени. Таким образам, экспрессия гена клещевого токсина повышает свойства бакуловируса AcMNPV в качестве пестицида за счет ингибирования питания во время заражения. Экспрессия токсина не блокирует вирусную репликацию, поскольку все члены группы личинок, зараженных vEV-Тох34, умирают от типичной вирусной инфекции.
В вышеописанном вирусном построении Тох34-кодирующая последовательность экспрессируется под регуляторным контролем очень позднего бакуловирусного промотора, который экспрессируются не раньше чем примерно на 18 ч после заражения в клетках, инфицированных при высокой множественности заражения (moi, то есть 10 вирусов на клетку) или не раньше чем примерно на 24-30 ч после заражения в клетках, инфицированных при moi, равной 1. Поэтому не ожидают, что паралитические эффекты бакуловирус-опосредованной экспрессии Тох34 будут наблюдаться до 36 ч после заражения.
С целью ускорения временного периода, на который можно было бы наблюдать паралитические эффекты генного продукта Тох34, вирус AcMNPV генетически конструируют для экспрессии Тох34-кодирующий последовательности под управлением других промоторов AcMNPV.
Переносимую плазмиду phc-ETL-Тох34 (см. фиг.3) конструируют с Тох34-кодирующей последовательностью, экспрессированной под регуляторным контролем ETL-промотора AcMNPV (описан в работе Crawford et al. (1988), J. Virol 62-2773-2778, которая введена в данное описание в качестве отсылки). Тох34-содержащий фрагмент EcoRI инсерцируют в сайт EcoRI плазмиды phc-dET, которая получена из phcwt (Rankin et al. (1988) supra), замещая промотор полиэдрина между сайтом EcoRI и сайтом Bgl II последовательностями промотора ETL, простирающимися от -6 (относительно АТС инициации трансляции ETL возле +1, +2, +3) до приблизительно 300 пар оснований выше от ETL-кодирующих последовательностей. Переносимую плазмиду и AcMNPV дикого типа совместно трансфецируют с последующим выделением и определением характеристик. Фиг. 7 приводит данные относительно заражения насекомых вирусом vETL-Тох34.
Промотор Cap/Polh описан Thiem и Miller (1990) Gene 91:87-95; это тот же промотор, что и обозначенный vp39/LSXIV на фиг. 19 заявки на патент США N 07/353847, зарегистрированной 17 мая 1989 года. ДНК-последовательность промотора Cap/Polh приведена в табл. 8. Фрагмент Bgl II/Kpn I плазмиды pEV-Тох34, содержащей Тох34-кодирующую последовательность, инсерцируют в месте гена CAT в pCap/Polh-CAT (Thiem и Miller (1990) supra), соответствующей pEV vp39/LSXIV CAT. pCap/Polh-Тох34 совместно трансфецируют с помощью vDA26Z (O'Reilly et al. (1990) supra ) в клетки Sf, и вирус, получаемый в результате гомологичной рекомбинации между переносимой плазмидой и vDA26Z обозначен как vCap/Polh-Тох34. Этот вирус выделяют, подтверждая правильность его генетической структуры анализом эндонуклеазами рестрикции.
Эффекты vCap/Polh-Тох34 на приращение массы определяют путем инъекции 4•105 бляшкoобразующих единиц личинкам Т.ni пятой возрастной стадии первого дня или 2 мкл жидкости тканевой культуры без вируса. Личинок взвешивают, инъецируют и ставят на безвирусную диету. Личинки, зараженные vCap/Polh-Тох34, приращивают значительно меньшую массу и проявляют паралич раньше, нежели личинки, зараженные другими рекомбинантными вирусами, при сравнительном анализе. Максимальная масса, которую приращивают личинки, зараженные AcMNPV дикого типа, почти в три раза выше максимальной массы, приращенной vCap/Polh-Тох34-зараженными личинками на первый день после заражения. Свыше 50% испытуемой популяции, зараженной vCap/Polh-Тох34, парализованы в первый день, тогда как 10 или менее других испытуемых популяций парализованы или мертвы к этому времени после заражения. vCap/Polh-Тох34-зараженные личинки теряют небольшое количество массы между первым и вторым днем после заражения, когда паралич испытуемой популяции, совершен, возможно, вследствие обезвоживания парализованных личинок (cм. фиг. 7).
Фиг. 7 представляет собой сравнение воздействия вирусов AcMNPV дикого типа и рекомбинантных вирусов, экспрессирующих Тох34-кодирующую последовательность, на приращение массы личинок зараженных насекомых и на смертность или паралич зараженных личинок. На первый день после заражения приращение массы AcMNPV- и vETL-Тох34-зараженных личинок приблизительно эквивалентно, тогда как vEV-Тох34, vSp-Тох34 и vCap/Polh-Тох34-зараженные личинки имеют более низкие приращения массы. Через два дня после заражения приращения массы зараженных насекомых в порядке понижения составляют AcMNPV, незараженные vETL-Тох34, а также pEV-Тох34 и vSp-Тох34 (обе эквивалентны) и vCap/Polh-Тох34. К этому времени все личинки, зараженные vCap/Polh-Тох34, vEV-Тох34 и vSp-Tox34, парализованы или мертвы, тогда как только около 10-15% личинок, зараженных AcMNPV или vETL-Тох34, парализованы или мертвы.
На третий день после заражения незараженные личинки окукливаются, a vETL-Тох34-зараженные личинки приобретают значительно меньшую массу по сравнению с AcMNPV-зараженными личинками. На четвертый день после заражения остальные зараженные личинки либо умирают, либо парализуются.
Фиг. 7 показывает, что vCap/Polh-Тох34 является наиболее эффективным средством по борьбе с насекомыми из тех, которые испытаны в отношении ограничения прироста массы личинок и в отношении более раннего наступления смерти или паралича, что ограничило бы питание насекомых. Хотя можно было бы ожидать, что экспрессия Тох34-кодирующей последовательности в vETL-Тох34 наступает раньше, чем у других токсин-продуцирующих рекомбинантных вирусов, оказывается, что мощность промотора может быть менее чем достаточной, для доставки паралитической дозы токсина к зараженному насекомому на ранней стадии периода заражения. Поздний/очень поздний гибридный промотор Cap/Polh, как оказывается, является значительно более мощным, и поэтому он представляет собой предпочтительный промотор из этой группы для определения экспрессии специфического к насекомым паралитического нейротоксина в бакуловирусном векторе.
Пример 7. Экспрессия Тох34, направляемая промотором SPLSXIV в положительном по тельцам включения бакуловирусе.
Рекомбинантные бакуловирусы, экспрессирующие Тох34 в примере 4, являются не содержащими тельца включения вирусами и потому малоинфекционными для насекомых при пероральном способе занесения инфекции. Вкрапленный бакуловирус, экспрессирующий Тох34-кодирующую последовательность под регуляторным контролем очень позднего промотора и белок полиэдрина под управлением своего собственного промотора, конструируют с использованием переносимой плазмиды рSр-Тох34, показанной на фиг. 4. Промоторные последовательности, обозначенные здесь символом Sp, называются SPLSXIV в заявке на патент США N 07/353847, зарегистрированной 17 мая 1989 года и описанной в данной работе. Последовательность промотора Sp представлена в табл. 9. рSр-Тох34 совместно трансфецируют в клетки Sf с ДНК от производного AcMNPV, используя ген бета-галактозидазы, инсерцированный в ген полиэдрина (vSynVI-gal). Этот вирус имеет окклюзия-негативный фенотип и образует голубые бляшки, когда посеян на хромогенном субстрате бета-галактозидазы, 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-бета-D-галактопиранозид (X-gal). Другие производные AcMNPV, имеющие делецию гена полиэдрина, также могут быть пригодными для конструирования рекомбинантного вируса, поскольку область полиэдрина замещена последовательностями рSр-Тох34 во время аллельного замещения при конструировании. Рекомбинантный вирус vSp-Tox34 выделяют из потомства совместной трансфекции в виде вируса с положительным по тельцам включения бета-галактозидаза-негативным фенотипом, и он экспрессирует TxP-I. 19 из 20 личинок T.ni, которые питались vSp-Тох34 на четвертой и пятой возрастных стадиях, проявляют паралич и прекращают питаться на 52 ч после их начального контакта с зараженной пищей, тогда как личинки, принимавшие пищу, зараженную AcMNPV дикого типа, продолжают питаться в течение 5 дней (120 ч) после проглатывания зараженной пищи. Аналогичные результаты, показывающие приращение массы в отношении испытуемой популяции 30 личинок, приведены на фиг. 6. Личинки, вскормленные зараженной пищей с vSp-Тох34, проявляют симптомы паралича на 2-й день после заражения и значительно теряют в массе по сравнению с личинками, вскормленными вирусом дикого типа. Таким образом, вирусы, переносящие и экспрессирующие ген специфического к насекомым паралитического нейротоксина, например Тох34-кодирующую последовательность, имеют значительно улучшенные пестицидные свойства.
Пример 8. Экспрессия Тох34-кодирующей последовательности, направляемая промотором Cap/Polh в положительном по тельцам включения бакуловирусе.
Для получения окклюзия-положительного бакуловируса, который экспрессирует Тох34-кодирующую последовательность под управлением промотора Cap/Polh, вначале конструируют плазмиду, содержащую между сайтами EcoRI и Kpn I многоклонирующего сайта Bluescript plusTM (BSKS+, Stragene, La Jolla, California) левый конец размером 4,6 килопар оснований фрагмента EcoRI AcMNPV дикого типа от сайта EcoRI у 0,0 единиц генетической карты AcMNPV до сайта Kpn I в пределах гена полиэдрина. Эту плазмиду (pERI-K) затем переваривают с помощью EcoRV с целью линеаризации плазмиды, отрезая ее у сайта EcoRV выше гена полиэдрина. Слияние промотора Cap/Polh-Тох34 и гена удаляют из pCap/Polh-Tox34 (см. фиг. 5), отрезая низ Тох34 с помощью сайта Kpn I (с последующим получением тупого конца), после чего отрезают верхний участок промотора Cap/Polh с помощью сайта EcoRV. Фрагмент, несущий слияние Cap/Polh-Тох34, затем лигируют тупым концом в сайт EcoRV плазмиды pERI-K, разрезанной с помощью EcoRV. Предпочтительная ориентация гена токсина направлена против часовой стрелки относительно последовательностей AcMNPV. Полученную плазмиду обозначают pCap/Polh-Tox34VI+.
Cap/Polh-Tox34VI+ используют в качестве переносимой плазмиды для аллельного замещения окклюзия-отрицательным производным AcMNPV с делеционной или замещающей мутацией в гене полиэдрина. Пригодным делеционным мутантом является vSynVI-gal, описанный в примере 7, или делеционный мутант, полученный в результате аллельного замещения с использованием плазмиды pEVmedXIV.
Рекомбинантные вирусы отбирают на основании их окклюзия-положительного фетотипа и скринируют рестрикционным анализом на должное аллельное замещение.
Поскольку модифицированные бакуловирусы примеров 5 и 8 содержат тельца включения, они могут быть инкорпорированы в инсектицидно эффективные, сельскохозяйственно приемлемые композиции, которые могут быть использованы в отношении зараженных культур. Проглатывание таких окклюдированных вирусных частиц приводит к размножению этих вирусов в полевых условиях и распространению агента по борьбе с насекомыми. Следует понять, что рекомбинантный вирус, сам по себе неспособный направлять синтез полиэдринов, может быть окклюдирован другими методами, например, совместным заражением хелпер-вирусом, который экспрессирует полиэдрин на высоких уровнях. Могут быть использованы любые средства, известные в данной области техники, которые могли бы стабилизировать невкрапленные вирусы и тем самым повысить эффективность или продуктивность их использования.
Пример 9. Экспрессия Тох21a-кодирующей последовательности в производном AcMNPV.
Рекомбинантный AcMNPV, способный экспрессировать Тох21a-кодирущую последовательность под управлением сильного промотора LSXIV, конструируют с использованием следующих стадий.
Сначала EcoRI кДНК-фрагмент, содержащий Тох21а, отсекают от соответствующего лямбда ZAPII фага и клонируют в плазмиду Bluescript, описанную выше, с получением pBSK-Tox21a.
Затем желательно мутагенезировать находящийся за рамкой кодон ATG (который управляет началом трансляции с помощью метионина) в положении -49, -48, -47, как показано в табл. 4. Этот сайт-направленный мутагенез осуществляют с использованием методики полимеразно-цепьевой реакции (Innis et al. (eds. ) (1990) PCR Protocols, Academic Press, San Diego, California; H. Erlich (ed. ) (1989) PCR Tecnology, Stockton Press, New York) и следующих праймеров:
PCR также используют для амплификации фрагмента, содержащего желаемую мутацию AT в CC. Мутагенез приводит к созданию сайта BamHI в верхней области последовательности Тох21а. Полученный продукт переваривают с помощью BamHI и AccI для высвобождения рестрикционного фрагмента размером около 351 пары оснований, который затем подвергают гель-фильтрации.
pBSK-Тох21a разрезают с помощью BamHI, который вклинивается в вектор, и частично разрезают с помощью AccI, который отсекает участок около нуклеотида 300, как в табл. 4, и в последовательности Тох21а. Это приводит к удалению N-концевой части последовательности Тох21а из pBSK-Тох21а. Искомый векторный фрагмент, который простирается на удалении около 300-400 пар оснований ниже линейной pBSk-Тох21а, очищают с помощью гель-фильтрации.
Мутированный продукт PCR затем клонируют в очищенный векторный фрагмент pBSK-Тох21а с использованием стандартной методики молекулярной биологии, получая pBSK-PCR21a. Модифицированную последовательность Тох21а затем отсекают от pBSK-PCR-21a перевариванием с помощью BamHI и EcoRI, делают тупоконечной, очищают гель-фильтрацией и клонируют в переносимую плазмиду pSPXIVVI+X3 которую отрезают с помощью EcoRI и делают тупоконечной. Модифицированную последовательность Тох21а инсерцируют в pSRXIVVI+X3 в надлежащей ориентации относительно промотора LSXIV. Полученная плазмида pSPXlVPCR-Тох21а по существу идентична pSPTCx32 на фиг. 4, за исключением того, что токсин-ген представляет собой Тох21а вместо Тох34. Плазмиду pSPXIVPCRTox21a затем используют для аллельного замещения в AcMNPV, как описано в примере 7 для построения vSP-Tox34. Полученный рекомбинантный вирус (vSPXIVPCRTox21a) экспрессирует Тох21а-кодирующую последовательность для получения специфического к насекомым паралитического белка Тох21а.
Токсичность продукта экспрессии Тох21а испытывают в основном в соответствии описания в примере 6, за исключением того, что vSPXIVPCRTox21a используют для заражения насекомых вместо vSPTox34. Получают результаты, аналогичные приведенным на. фиг. 7. Следовательно, Тох21а кодирует специфический к насекомым паралитический нейротоксин.
Специалист поймет модификации методик, которые необходимы для построения аналогичного вкрапленного вируса или вирусов, которые экспрессируют Тох21а под управлением других бакуловирусных промоторов для использования в агентах по биологической борьбе с насекомыми.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложены фрагменты рекомбинантной ДНК, в которых нейротоксинкодирующие последовательности помещены под управление гетерологических промоторов. Предложены также генетически модифицированные бакуловирусы. Изобретение позволяет разработать агенты по биологической борьбе с насекомыми, которые продуцируют токсичные для насекомых уровни нейротоксина и оказывают повышенное токсическое воздействие на насекомых. 6 c.п. ф-лы, 9 табл., 8 ил.
| US 4745051 A, 1988 | |||
| US 5041379 A, 1991 | |||
| US 5004687 A, 1991. |
