СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ ЗАЩИТЫ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/53 G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к области клинической иммунологии, и предназначено для выявления недостаточности фагоцитарной защиты и ее реактивной или патологической активации.

Известен способ диагностики состояния фагоцитарной защиты путем определения в мазках поглотительной активности нейтрофилов. В этом способе определяют процент фагоцитов и среднее число поглощенных объектов на один нейтрофил (фагоцитарное число - ФЧ). Оценку показателей обследуемого лица производят путем сопоставления с показателями предварительно обследованной группы доноров.

Способ недостаточно точен из-за нестандартизованности методики исследования и отсутствия норматива фагоцитарных показателей у здоровых показателей у здоровых людей, что не позволяет унифицировать оценку фагоцитоза у больных.

Известен более точный способ, в котором исследование у больного производят одновременно с постоянным донором, служащим эталоном среднего уровня фагоцитарных показателей у здоровых людей. В качестве дополнительного показателя фагоцитоза рассчитывают индекс активности фагоцитов (ИАФ), для чего определяют отношение суммы объектов, поглощенных активными фагоцитами, к общему числу неактивных и малоактивных фагоцитов. Показатели фагоцитоза у больного выражают в процентах от их средней величины у здоровых людей. Способ дает возможность использовать норматив относительного значения фагоцитарных показателей у здоровых людей: 45-171% для ФЧ и 26-182% для ИАФ. Выход показателей за нижнюю границу норматива свидетельствует о недостаточности защиты, а превращение верхней границы - на реактивное или патологическое усиление фагоцитоза (В.Н. Каплин, Д.Р. Хачапуридзе, Н.М. Балуева, Н.В. Широкова. Способ диагностики иммунодефицитного состояния. (А. с. N 1837231, БИ N 32, 1993).

Этот способ имеет два недостатка. Одни из них заключается в невозможности выявить сдвиг фагоцитарной защиты в случае, когда показатели фагоцитоза у больного не выходят за пределы их норматива у здоровых людей. Второй недостаток связан с необходимостью одновременного исследования у постоянного донора. Это увеличивает трудоемкость исследования.

Изобретение направлено на решение задачи повышения точности способа и уменьшения его трудоемкости.

Решение задачи достигается тем, что в группе доноров определяют индивидуальные величины ФЧ и распределяют фагоциты по числу поглощенных ими объектов. Группируют показатели с одинаковой или близкой величиной ФЧ. Для каждой группы рассчитывают ИАФ путем деления средней суммы объектов, фагоцитированных нейтрофилами с уровнем поглощения 3 и более объектов, на среднюю сумму объектов, фагоцитированных нейтрофилами, поглотившими 1-2 объекта. Рассчитанные ИАФ служат стандартами для их оценки у обследуемых лиц. При проведении диагностического исследования определяют ФЧ и вышеописанным приемом рассчитывают ИАФ. Величину ИАФ делят на среднюю величину ИАФ в стандарте с такой же величиной ФЧ, что и у обследуемого. Контрольное значение ИАФ, рассчитанного по стандартам, составляет 0,7-1,4. Величина ИАФ ниже 0,7 указывает на недостаточность фагоцитарной защиты, а выше 1,4 - на реактивную или патологическую активацию фагоцитоза.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве объектов фагоцитоза используют эритроциты (Э) их сухого антигенного эритроцитарного диагностикума (ЭД). Для этой цели более всего подходит ЭД из шигелл Зонне СПбНИИВС. ЭД используют в нативном виде или предварительно прокрашивают, что делает их более контрастными при микроскопировании мазков. Для окраски Э применяют анилиновую краску черного, красного или синего цвета, можно использовать также красители для окраски бытовых тканей. Насыщенный раствор краски в физрастворе фильтруют через бумажный фильтр. В ампулу с ЭД вносят 2-3 мл краски и помещают в термостат при 37^oC на сутки. Взвесь Э отмывают от краски до полного просветления недостаточной жидкости. Густую взвесь окрашенных или неокрашенных Э отстаивают 15-20 мин для осаждения конгломератов Э, отсасывают верхнюю треть взвеси, в камере Горяева определяют содержание Э и оценивают качество взвеси. Признаком хорошего качества взвеси является отсутствие в ней конгломератов Э и их размер в пределах 2-3 мкм. Взвесь разводят физраствором до концентрации Э 50-60 млн/мл. Взвесь разливают по микропробиркам и хранят в холодильнике. Взвесь можно использовать для исследования не менее двух месяцев, но необходимо контролировать ее качество во избежание образования конгломератов Э и бактериального загрязнения.

Для составления стандартов ИАФ исследуют фагоцитарную активность нейтрофилов у доноров, не имеющих хронических заболеваний и не перенесших острых заболеваний в течение последних трех месяцев. Взятую из пальца кровь стабилизируют раствором глюгицира из расчета 4 части крови на одну часть раствора или раствором гепарина из расчета 25 МЕ на 1 мл крови. В лунку микропланшета для РГА или микропробирку вносят 10 мкл крови и такой же объем взвеси ЭД. Смесь помещают в термостат при 37^oC, встряхивают ее каждые 5 мин и делают на предметном стекле мазки через 10 и 20 мин. Желательно изготовлять маленькие мазки шириной 3,5 - 4 мм и длиной 18-20 мм. Это дает возможность изготовления на одном предметном стекле серии мазков. Подсчет фагоцитоза в таких мазках более точен, чем в мазках стандартного размера. Мазки фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимзе. Определяют поглотительную активность 100 нейтрофилов. При подсчете фагоцитоза площадь мазка условно делят на 3 части и в каждой учитывают по трети от числа учитываемых нейтрофилов. Фагоциты распределяют по числу поглощенных объектов, рассчитывают ФЧ делением общей суммы поглощенных объектов на 100 и суммы объектов, фагоцитированных нейтрофилами с уровнем поглощения 3 и более и 1-2 объектов. Все результаты группируют в зависимости от величины ФЧ. В каждую группу включают индивидуальные показатели фагоцитоза с одинаковым число десятков поглощенных объектов на 100 нейтрофилов. Разница индивидуальных величин ФЧ в группе находится в пределах 0,01 - 0,09. Для каждой группы рассчитывают стандартную величину ИАФ путем деления средней суммы объектов, фагоцитированных нейтрофилами с уровнем поглощения 3 и более объектов, на среднюю сумму объектов, фагоцитированных нейтрофилами, поглотившими 1-2 объекта.

При проведении диагностического исследования у пациента определяют ФЧ и рассчитывают ИАФ вышеприведенным приемом. Величину ИАФ у пациента делят на стандартную величину ИАФ в контрольной группе с такой же величиной ФЧ, что и пациента, и получают таким путем оценку ИАФ в стандартном выражении (ИАФ_ст). Контрольное значение ИАФ_ст у здоровых людей составляет 0,7 - 1,4. При значении ИАФ_ст ниже 0,7 констатируют недостаточность фагоцитарной защиты, а выше 1,4 - реактивную или патологическую активацию фагоцитоза.

У здоровых людей существует отчетливая линейная зависимость между величинами ФЧ и ИАФ в абсолютном выражении. Эта дает возможность составления расчетных стандартов ИАФ на основе ограниченного числа исследований у здоровых людей. Самый простой вариант расчета стандартов ИАФ основывается на результатах исследования фагацитоза у двух доноров или у одного донора при разном времени экспозиции смеси крови и взвеси ЭД, что позволяет получить пробы с разной величиной ФЧ. Для каждого значения ФЧ вычисляют ИАФ и разницу между их величинами. Определяют, какое количество разрядов ФЧ с разницей его величины в 0,1 можно разместить в интервале между значениями ФЧ в двух пробах. Разность между величинами ИАФ делят на число промежуточных разрядов ФЧ и таким путем определяют, на какую величину ИАФ отличаются два соседних разряда ФЧ. На основе этих данных составляют таблицу расчетных стандартов ИАФ для разных величины ФЧ.

При величине ФЧ 0,60 и ниже сумма объектов, фагоцитированных нейтрофилами с поглощением 3-х и более объектов, обычно мала и вследствие этого возможна ошибка в расчете ИАФ. Для низких величин ФЧ следует рассчитывать ИАФ по соотношению сумм объектов, фагоцитированных нейтрофилами с поглощением двух и более объектов, на сумму объектов для нейтрофилов, фагоцитировавших по одному объекту. Стандарты ИАФ для этого варианта исследования составляют по такому же принципу, который описан для фагоцитов с более высоким уровнем поглотительной активности. В этом варианте определения ИАФ_ст его контрольная величина также составляет 0,7 - 1,4.

Пример 1. Составление стандартов ИАФ и диагностическое исследование у больного псориазом.

Кровь больного смешана с взвесью ЭД из шигелл Зонне, предварительно прокрашенного в черный цвет, с содержанием Э 60 млн/мл. Определены ФЧ и ИАФ. Контрольный стандарт ИАФ составлен по результатам предварительных исследований у доноров с той же взвесью. Время экспозиции кровь больного с ЭД составило 20 мин, у доноров - от 10 до 20 мин.

Результаты исследования представлены в табл. 1.

Несмотря на то, что у доноров исследование проведено в разные дни и при разной экспозиции смеси крови и объектов, распределение фагоцитов по степени активности оказалось очень постоянным. Соответственно у них оказались очень близкими выличины ИАФ как в абсолютном выражении, так и представленные в форме отношения к средней величине ИАФ.

У больного псориазом при такой же, как у доноров, величине ФЧ значительно изменился профиль активности фагоцитов. Существенно увеличилось количество нейтрофилов с нулевой активностью и уменьшилось число фагоцитов, поглотивших по одному-два объекта. Наоборот, у фагоцитов с более высоким уровнем поглощения отчетливо возросла сумма поглощенных объектов. Расчет ИАФ показал более чем двукратное возрастание его величины в абсолютном и в стандартном выражении. Таким образом у больного возникла стимуляция фагоцитарной защиты за счет наиболее активной популяции нейтрофилов.

При обследовании предлагаемым способом 38 больных с прогрессирующей и стационарной формой псориаза у 26 (74%) обнаружена стимуляция фагоцитоза с величиной ИАФ_ст выше 1,4. При определении ИАФ известным способом установлено превышение контрольной величины индекса у 18 больных (45%).

Пример 2. Составление расчетных стандартов индекса активности фагоцитов и диагностическое исследование у больных с патологией внутренних органов.

У донора проведено предварительное исследование с взвесью неокрашенных Э и ЭД из шигелл Зонне. Концентрация Э во взвеси составила 55 млн, время экспозиции - 10 и 20 мин. Результаты исследования представлены в табл. 2.

По результатам исследования смежные разряды ФЧ должны отличаться по величине ИАФ на 0,06 - 0,07, составленная на основе этого исследования расчетная таблица стандартов ИАФ выглядит следующим образом (табл. 3).

Сопоставление расчетных стандартов ИАФ с составленными на основании группирования результатов исследования у доноров показало удовлетворительное совпадение величин ИАФ.

Результаты исследования у больных представлены в табл. 4.

На основании исследования было сделано заключение о выраженной активации фагоцитоза у первого больного и депрессии фагоцитарной защиты у второго больного. Существенно, что кардинально разный результат определения ИАФ получен при почти одинаковых величинах ФЧ.

Исследование у 8 больных острой пневмонией выявлено активацию фагоцитоза по критерию ИАФ у 6 больных. У двух больных ИАФ оказался в пределах контрольных значений. Из 6 больных гипертонической болезнью обнаружена депрессия фагоцитоза у 3-х и активация у одного больного. Из 8 больных инфарктом миокарда в острой стадии при оценке по критерию ИАФ_ст у четырех больных выявлена депрессия фагоцитарной защиты, у трех - ее активация, у одного больного величина индекса была в пределах контрольного значения.

Пример 3. Диагностическое исследование у новорожденных детей, перенесших гипоксию.

Исследование фагоцитоза с неокрашенной взвесью Э проведено по той же методике, что в примере 1. Результаты исследования представлены в табл. 5.

У больных низка величина ФЧ, поэтому расчет ИАФ у них и в с стандарте произведен путем деления сумм объектов, поглощенных фагоцитами с уровнем поглощения 2 объекта, на сумму объектов для фагоцитов, поглотивших по одному объекту. Как видно из таблицы, при острой асфиксии возникла депрессия фагоцитарной защиты, а при хронической гипоксии ее выраженная активация.

При обследовании 30 новорожденных, перенесших хроническую внутриутробную гипоксию, определение ИАФ выявило активацию фагоцитарной защиты у 23-х детей и ее угнетение у 3-х. Из 17 детей, перенесших в родах острую гипоксию, у 8 определена стимуляция и у 6 угнетение фагоцитарной защиты.

Пример 4. Диагностическое исследование при инфекции.

Исследование проведено у пациента, перенесшего грипп две недели назад. Определение фагоцитоза произведено по той же методике, что в примере 3 (см. табл. 6).

Исследование выявило у больного депрессию фагоцитарной защиты в связи со значительным снижением поглотительной способности высокоактивных фагоцитов.

Предлагаемым способом обследованы 75 взрослых больных гриппом, ОРВИ, туберкулезом легких и инфицированных туберкулезом детей. Из них к 58 (77,3%) выявлена депрессия фагоцитарной защиты.

Основное преимущество предлагаемого способа перед известным способом оценки фагоцитоза путем расчета индекса активности фагоцитов заключается в повышении чувствительности. Применение известного способа эффективно при депрессии фагоцитоза, но мало эффективно при активации фагоцитарной защиты, что подтверждается материалами исследования в примере 1. При расчете индекса активности фагоцитов путем деления суммы объектов, фагоцитированных нейтрофилами с поглощением двух и более объектов, на сумму фагоцитов с нулевой активностью и поглотивших по одному объекту, величина индекса у больного, равная 1,28, не превосходит аналогичный показатель у доноров, а по сравнению с показателем донора N 1 величина индекса у больного значительно ниже. Таким образом определить у больного активацию фагоцитоза известным способом расчета индекса не удается. При активации фагоцитарной защиты известный способ дал в три раза меньше диагностически значимых результатов в сравнении с предлагаемым способом. Даже при выраженной активации фагоцитоза у больных псориазом известный способ для на 29% положительных результатов меньше.

Предлагаемый способ в ряде случаев оказывается более чувствительным и в варианте депрессии фагоцитоза. Это подтверждается материалами исследования в примере 4. Здесь расчет индекса известным способом дает почти одинаковую величину ИАФ у больного и донора, и диагностическое исследование оказывается неэффективным.

Другое преимущество предлагаемого способа заключается в уменьшении трудоемкости исследования. Здесь исследование производится только у больного, то есть объем исследования в сравнении с известным способом определения ИАФ сокращается вдвое. Что касается предварительного исследования в группе доноров, то оно одинаково по объему при применении обоих способов, и при применении расчетного варианта определения стандартов ИАФ объем исследования у доноров оказывается в 10 раз меньше.

Предлагаемый способ может быть немедленно реализован на основе применения эритроцитарных коммерческих диагностикумов, выпускаемых отечественной промышленностью.

Изобретение может быть использовано в медицине, в частности в клинической иммунологии и обеспечивает повышение точности способа и уменьшение его трудоемкости. Исследуют фагоцитарную активность нейтрофилов в мазках с определением среднего числа поглощенных объектов на нейтрофил (фагоцитарное число) и индекса активности фагоцитов, рассчитываемого делением суммы объектов, поглощенных активными фагоцитами, на сумму малоактивных и неактивных фагоцитов, с оценкой фагоцитарных показателей в процентах от их средней величины у здоровых людей, рассчитываемой по показателям одновременно обследуемого постоянного донора. При этом результаты предварительного исследования у доноров группируют в зависимости от величины фагоцитарного числа. Стандарт индекса активности фагоцитов рассчитывают делением средних сумм фагоцитированных объектов для нейтрофилов, поглотивших 3 и более объектов на 1 - 2 объекта, при проведении диагностического исследования рассчитывают индекс активности фагоцитов и делят его на величину индекса в стандарте с такой же величиной фагоцитарного числа, как у обследуемого, контрольная величина индекса, рассчитанного по стандартам, составляет 0,7 - 1,4. При величине индекса ниже 0,7 диагностируют недостаточность фагоцитарной защиты, а выше 1,4 - ее активацию. 6 табл.

Способ диагностики состояния фагоцитарной защиты путем исследования фагоцитарной активности нейтрофилов в мазках с определением среднего числа поглощенных объектов на нейтрофил (фагоцитарное число) и индекса активности фагоцитов, рассчитываемого делением суммы объектов, поглощенных активными фагоцитами, на сумму малоактивных и неактивных фагоцитов, с оценкой фагоцитарных показателей в процентах от их средней величины у здоровых людей, рассчитываемой по показателям одновременно обследуемого постоянного донора, отличающийся тем, что результаты предварительного исследования у доноров группируют в зависимости от величины фагоцитарного числа, для каждой группы рассчитывают стандарт индекса активности фагоцитов делением средних сумм фагоцитированных объектов для нейтрофилов, поглотивших 3 и более объектов и 1 - 2 объекта, при проведении диагностического исследования рассчитывают индекс активности фагоцитов и делят его на величину индекса в стандарте с такой же величиной фагоцитарного числа, как у обследуемого, контрольная величина индекса, рассчитанного по стандартам, составляет 0,7 - 1,4, при величине индекса 0,7 диагностируют недостаточность фагоцитарной защиты, а выше 1,4 - ее активацию.