РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PSP64-S, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ ТРАНСКРИПЦИЮ IN VITRO ФРАГМЕНТА S-СЕГМЕНТА РНК ВИРУСА-ВОЗБУДИТЕЛЯ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ СЕРОТИПА ХАНТААН И ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ РНК-КОНТРОЛЬ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ МЕТОДОМ ОТ-ПЦР НА ЕЕ ОСНОВЕ Российский патент 2004 года по МПК C12N15/63 C12N15/34 C12Q1/68 

Изобретение относится к медицинской вирусологии, в частности к диагностике геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС).

В повседневной лабораторной диагностике ГЛПС используют методы определения антител в крови, такие как различные варианты методики иммуноферментного анализа, а также непрямой метод флюоресцирующих антител. Диагностика ГЛПС с использованием обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) - сравнительно новый метод, имеющий ряд преимуществ, например, высокую чувствительность. Метод не получил пока широкого распространения в регионах России, эндемичных по данному заболеванию, в связи с отсутствием амплификационных диагностических систем. В разработке диагностических систем одной из основных проблем является выбор положительного контроля. В качестве такового может быть использована РНК, выделенная из культур клеток, зараженных лабораторными штаммами вируса-возбудителя ГЛПС, либо из органов инфицированных грызунов.

Основными недостатками получения такого контроля являются следующие:
1) необходимость обеспечения РЗ-уровня биобезопасности при проведении работ;
2) разнородность генетического материала, выделяемого из органов грызунов.

Известны рекомбинантные плазмидные ДНК pF1R2 и pF1R2+118, позволяющие получать in vitro положительный РНК-контроль для выявления методом амплификации хантавируса серотипа Син Номбре [1, прототип].

Но вирус серотипа Син Номбре вызывает другое заболевание - хантавирусный легочный синдром, отличающееся от ГЛПС.

Известны способы и наборы реагентов для генамплификационной диагностики методами ПЦР и ОТ-ПЦР гепатитов В и С, ВИЧ-инфекции и сифилиса [2]. Наборы обеспечивают высокую чувствительность и специфичность генотестирования и генодиагностики, а также позволяют автоматизировать их выполнение.

Однако подобные системы не описаны для диагностики ГЛПС.

Известен способ определения хантавируса серотипа Син Номбре методом ОТ-ПЦР [1, прототип].

Однако данный метод служит для определения вируса серотипа Син Номбре, вызывающего легочный синдром, который отличается от вируса серотипа Хантаан, вызывающего ГЛПС.

Технической задачей изобретения является упрощение и повышение безопасности проведения работ по получению положительного РНК-контроля для диагностики вируса-возбудителя ГЛПС, а также повышение качества контроля за счет его однородности.

Поставленная задача решается путем конструирования плазмиды pSP64-S, имеющей промотор для SP6 ДНК-зависимой РНК-полимеразы и фрагмент кДНК S-сегмента вируса-возбудителя ГЛПС серотипа Хантаан, кодирующей последовательность нуклеокапсидного белка. С этого фрагмента эффективно осуществляется транскрипция негативной цепи РНК, идентичной фрагменту РНК вирусного генома.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pSP64-S, обеспечивающая транскрипцию in vitro фрагмента S-сегмента РНК вируса-возбудителя ГЛПС серотипа Хантаан, характеризуется следующими признаками:
- имеет молекулярную массу 2843,9 kd;
- имеет размер 4309 пар оснований;
- состоит из:
- плазмиды pSP64 (Promega) размером 2999 п.о. с областью ori, геном устойчивости к ампициллину, промотором для SP6 ДНК-зависимой РНК полимеразы [3] ;
- фрагмента кДНК S-сегмента вируса-возбудителя ГЛПС серотипа Хантаан размером 1310 п.о.;
- содержит:
- уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами: PvuI, SeaI, SalI, XbaI, AvaI, SmaI, EcoRI.

ДНК pSP-64 обрабатывают рестриктазой в соответствующем буфере. Для подготовки ДНК к реакции лигирования гидролизат наносят на 1% агарозный гель с последующей очисткой ДНК с помощью набора Ultra Clean ("Mo Bio Lаbоrаtоries"). Фрагмент кДНК S-сегмента вырезают по сайтам SacI из плазмиды pMOS-S, сконструированной ранее, и таким же образом выделяют его из 1% агарозного геля. Полученный препарат используют для трансформации клеток Е. coli штамма XL-2Blue. Ампициллин-устойчивые колонии перекалывают на нитроцеллюлозные фильтры с последующим лизисом и иммобилизацией на них плазмидной ДНК. Далее проводят реакцию гибридизации с использованием в качестве зонда препарата этого же фрагмента S-сегмента, меченного радиоактивным изотопом фосфора. Плазмидную ДНК, выделенную из гибридизующихся колоний, анализируют с помощью рестриктаз HindIII, PstI, NcoI и последующей разгонкой в 1% агарозном геле. Отбирают клоны, содержащие встройку кДНК в нужной ориентации, обеспечивающей транскрипцию негативной цепи РНК. Плазмидную ДНК pSP64-S нарабатывают в клетках Е. coli с последующим выделением по стандартной методике. Выделенную ДНК обрабатывают рестриктазой EcoRI, затем смесью фенол-хлороформ, высаживают спиртом и растворяют в воде. Полученная линейная форма пригодна для использования в реакции транскрипции.

В реакцию транскрипции берут предварительно линеаризованную плазмидную ДНК, добавляют смесь rNTP, ингибитор РНК-аз и SP6 РНК-полимеразу. После реакции транскрипции РНК проводят обработку ДНК-азой, не содержащей РНК-аз. Полученную РНК осаждают, промывают спиртом и растворяют водой, свободной от ДНК-аз и РНК-аз. Концентрацию РНК и ее чистоту определяют спектрофотометрически. Специфичность РНК проверяют методом ОТ-ПЦР и визуализацией полос соответствующего размера в 1% агарозном геле.

Перечень графических материалов.

На чертеже изображена физическая карта рекомбинантной плазмиды pSP64-S.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Конструирование плазмиды pSP64-S. К 10 мкг ДНК pSP64 добавляют 15 е. а. рестриктазы SacI, инкубируют в соответствующем буфере в объеме 50 мкл в течение 1 ч при 37^oС. Для подготовки векторной ДНК к реакции лигирования гидролизат наносят на 1% агарозный гель с последующей очисткой ДНК с помощью набора Ultra Clean ("Mo Bio Laboratories"). Фрагмент кДНК S-сегмента вырезают по сайтам SacI из плазмиды pMOS-S, сконструированной ранее, и таким же образом выделяют его из 1% агарозного геля. Лигазную реакцию проводят в объеме 10 мкл в течение 16 ч при температуре 4^oС с молярным соотношением вектор: фрагмент 1:1. Полученный препарат используют для трансформации клеток Е. coli штамма XL-2Blue. Ампициллин-устойчивые колонии перекалывают на нитроцеллюлозные фильтры с последующим лизисом и иммобилизацией на них плазмидной ДНК. Далее проводят реакцию гибридизации с использованием в качестве зонда препарата этого же фрагмента S-сегмента, меченного радиоактивным изотопом фосфора. Плазмидную ДНК, выделенную из гибридизующихся колоний, анализируют в 1% агарозном геле с помощью рестриктаз HindIII, PstI и NcoI. Отбирают клоны, содержащие встройку кДНК в нужной ориентации, обеспечивающей транскрипцию негативной цепи РНК. Плазмидную ДНК pSP64-S нарабатывают в клетках Е. coli в 50 мл LB-среды с последующим выделением по стандартной методике. Выделенную ДНК обрабатывают рестриктазой EcoRI, затем смесью фенол-хлороформ, высаживают спиртом и растворяют в воде. Полученная линейная форма пригодна для использования в реакции транскрипции.

Пример 2. Транскрипция РНК. В реакцию транскрипции берут 1 мкг предварительно линеаризованной плазмидной ДНК, добавляют смесь rNTP (10 mM каждого), 50 е.а. ингибитора РНК-аз и 30 е.а. SP6 РНК-полимеразы. Конечный объем смеси составляет 50 мкл. Время реакции 2 ч при 37^oС. Затем проводят обработку ДНК-азой, не содержащей РНК-аз: добавляют 5 е.а. фермента в предыдущую реакционную смесь и инкубируют 15 мин при 37^oС. В дальнейшем добавляют 1 объем (50 мкл) ТЕ-насыщенного фенол-хлороформа, встряхивают, центрифугируют, отбирают верхнюю фазу. РНК осаждают смесью 1 объема изопропанола и 1/10 объема 3М NaAc. После двукратного промывания осадка сначала 75%, а затем 96% этанолом, растворяют его в 100 мкл воды, свободной от ДНК-аз и РНК-аз.

Для определения концентрации РНК берут аликвоту и определяют спектрофотометрически поглощение при длине волны 260 нм. Рассчитывают концентрацию РНК исходя из того, что 1 о.е. соответствует 40 мкг/мл. Чистоту РНК также определяют спектрофотометрически. Для этого определяют отношение величин поглощения при длинах волн 260 и 280 нм. Отношение А260/А280 должно быть не меньше 1,7. Специфичность РНК проверяют методом ОТ-ПЦР и визуализацией полос соответствующего размера в 1% агарозном геле.

Таким образом, полученный положительный РНК-контроль является необходимым компонентом амплификационных тест-систем, позволяющих диагностировать вирус-возбудитель ГЛПС в широкой лабораторной практике.

Список литературы
1. M. Terajima, J.D. Hendershot III, H. Kariwa and et. all. High levels of viremia in patients with the Hantavirus pulmonary syndrome. The Journal of Infection Diseases, 1990; 180:2030-2034.

2. Патент РФ 2164532 "Способы и наборы реагентов для генамплификационной диагностики методами ПЦР и РНК-ПЦР", С 12 N 15/10, опубл. БИ 9, 2001.

3. Promega catalog, Biological Research Products: vectors, markers and nucleic acids, 1996, p.105.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии и медицинской вирусологии. Предложена рекомбинантная плазмидная ДНК pSP64-S, имеющая промотор SP6 ДНК-зависимой РНК-полимеразы и фрагмент кДНК S-сегмента вируса возбудителя геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) серотипа Хантаан. Плазмида эффективно осуществляет транскрипцию с S-сегмента негативную цепь РНК, идентичную фрагменту РНК вирусного генома. Также предложен положительный РНК-контроль для диагностики вируса-возбудителя ГЛПС. Для получения предложенного положительного РНК-контроля в качестве матрицы используют плазмиду pSP64-S. Предложенное изобретение позволяет упростить и повысить безопасность проведения работ по получению положительного РНК-контроля для диагностики вируса-возбудителя ГЛПС, а также повысить качество контроля. 2 с.п.ф-лы., 1 ил.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pSP64-S, обеспечивающая транскрипцию in vitro фрагмента S-сегмента РНК вируса-возбудителя геморрагической лихорадки с почечным синдромом серотипа Хантаан, характеризуется следующими признаками: имеет молекулярную массу 2843,9 kd; имеет размер 4309 пар оснований; состоит из плазмиды pSP-64 (Promega), размером 2999 п.о., с областью ori, геном устойчивости к ампициллину, промотором для SP6 ДНК-зависимой РНК полимеразы; - фрагмента кДНК S-сегмента вируса-возбудителя ГЛПС серотипа Хантаан, размером 1310 п.о. содержит уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами PvuI, ScaI SalI, XbaI, AvaI, SmaI, EcoRI.2. Положительный РНК контроль для диагностики вируса-возбудителя геморрагической лихорадки с почечным синдромом методом ОТ-ПЦР, отличающийся тем, что в качестве матрицы для получения in vitro положительного РНК контроля используют рекомбинантную плазмидную ДНК pSP64-S, обеспечивающую транскрипцию in vitro фрагмента S-сегмента РНК вируса-возбудителя геморрагической лихорадки с почечным синдромом серотипа Хантаан.