СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОНАТРИЕВОЙ СОЛИ ИЗОГЛУТАМИЛ-ТРИПТОФАНА Российский патент 2019 года по МПК C07K1/107 C07K1/14 C07K5/37 C07K5/72 

Заявляемое изобретение относится к органическому синтезу, а именно к синтезу дипептидов, и в частности к получению различных оптических изомеров изоглутамил-триптофана в форме мононатриевой соли.

К числу оптических изомеров изоглутамил-триптофана (H-iGlu-Trp-OH) - относятся синтетические дипептиды, перспективные при лечении аутоиммунных заболеваний. Некоторые изомеры дипептида производятся фармацевтической промышленностью. Динатриевая соль D-изоглутамил-D-триптофана выпускается в виде раствора для внутримышечных инъекций или в форме назального спрея под торговым наименованием Тимодепрессин. Динатриевая соль D-изоглутамил-L-триптофана выпускается в форме назальных капель или спрея, а также в виде раствора для внутримышечного введения или лиофилизата для получения этого раствора под торговым наименованием Бестим.

Известен способ получения пептидов, в том числе D-изоглутамил-D-триптофана [RU 2107692, МПК C07K 5/065, A61K 38/08, 1998, аналог US 5736519], согласно которому дипептид синтезируют путем последовательно проводимых реакций получения трет-бутилоксикарбонил глутаминовой кислоты (Boc-D-Glu-OH), раскрытия внутреннего ангидрида Boc-D-Glu-OH соответствующим производным триптофана (H-D-Trp-Y) с образованием смеси Boc-D-iGlu-D-Trp-OH и Boc-D-Glu-D-Trp-OH, удаления защитной группы Вос (трет-бутилоксикарбонил) под действием муравьиной кислоты и последующего хроматографического разделения α- и γ-изомеров полученного D-глутамил-D-триптофана.

Известный способ имеет ряд недостатков. Так, на второй стадии синтеза образуется смесь Boc-D-iGlu-D-Trp-OH и Boc-D-Glu-D-Trp-OH в соотношении 1:1, поэтому максимальный выход целевого продукта (Boc-D-iGlu-D-Trp-OH) не может превышать 50%. После удаления Вос-защиты смесь дипептидов необходимо разделять с помощью ионообменной хроматографии и/или препаративной высокоэффективной обращенно-фазовой хроматографии, что значительно увеличивает стоимость синтеза и снижает выход конечного продукта.

Также известен способ получения стабильной кристаллической моноаммонийной соли H-D-iGlu-D-Trp-OH [RU 2483077, МПК C07K 5/037, A61K 38/05, 2013], согласно которому целевой продукт синтезируют путем последовательно проводимых реакций получения эфира трет-бутилоксикарбонил глутаминовой кислоты Boc-D-Glu-OR¹, где R¹ выбран из группы, включающей C₁-С₄ алкил или бензил, его конденсации с производным триптофана H-D-Trp-OR², где R² представляет собой C₁-С₄ алкил, с образованием Boc-D-Glu-(γ-Trp-OR²)-α-OR¹, последовательного удаления защитных групп R¹ и R² и Вос-защиты и получения целевого продукта - H-D-iGlu-D-Trp-OH, который затем превращают в кристаллическую аммонийную соль.

Известный способ позволяет получать только один изомер D-глутамил-D-триптофана, и поэтому не нуждается в стадии хроматографического разделения смеси α и γ дипептидов, но требует более дорогих исходных веществ и проведения дополнительной стадии - удаления защитных групп R¹ и R².

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к заявляемому способу является способ получения пептидов, в частности, γ-глутаминовой кислоты при использовании для временной защиты α-карбоксильной группы реакции образования оксазолидинонового кольца [Masumi Itoh. Chem. Pharm. Bull. 17(8), 1679-1686(1969)]. Способ включает стадию получения оксазолидинона глутаминовой кислоты путем взаимодействия параформальдегида и карбобензокси-глутаминовой кислоты (Z-Glu-OH) в бензоле в присутствии п-толуолсульфокислоты в качестве катализатора. Полученный оксазолидинон вводят в реакцию конденсации с бензиловым эфиром другой аминокислоты, в частности, глутаминовой кислоты, изолейцина и тирозина, с последующим раскрытием оксазолидинонового кольца и удалением защитных групп с помощью щелочного омыления и/или каталитического гидрогенолиза с палладиевым катализатором.

Указанный способ имеет тот недостаток, что на стадии получения оксазолидинона глутаминовой кислоты конечный продукт образуется в виде масла, содержащего значительное количество трудно отделяемого формальдегида. В случае использования каталитического гидрогенолиза для удаления защитных групп с одновременным раскрытием оксазолидинонового кольца, присутствие формальдегида приводит к отравлению палладиевого катализатора, что значительно осложняет процесс гидрирования. Кроме того, формальдегид способен взаимодействовать с образующейся свободной аминогруппой глутаминовой кислоты с образованием основания Шиффа. Последующее каталитическое восстановление основания Шиффа приводит к образованию производного N-метил-глутаминовой кислоты.

Использование щелочного омыления для раскрытия оксазолидинонового кольца и/или удаления защитных групп, в ряде случаев приводит к образованию сложной смеси побочных продуктов, наряду с риском рацемизации в процессе длительной обработки. Указанные недостатки делают данный способ неприемлемым для промышленного производства продукта с высокой степенью чистоты.

Объектом данного изобретения является разработка способа промышленного получения дипептидов изоглутамил-триптофана в форме мононатриевых солей.

Указанный результат достигается тем, что в способе получения изоглутамил-триптофана, включающем стадии синтеза оксазолидинона карбобензокси-глутаминовой кислоты, его конденсации с метиловым эфиром триптофана, удаления карбобензокси защиты с раскрытием оксалидинонового кольца с помощью каталитического гидрогенолиза и щелочного омыления метилового эфира с получением мононатриевой соли дипептида, в ходе синтеза оксазолидинона карбобензокси-глутаминовой кислоты используют промывку водным раствором солянокислого гидроксиламина, а стадию удаления карбобензокси защиты с одновременным раскрытием оксалидинонового кольца проводят путем каталитического гидрогенолиза над палладиевым катализатором при использовании муравьиной кислоты в качестве донора водорода и анилина, взятого в количестве от 2 до 4 эквивалентов по отношению к количеству защищенного дипептида.

Промывка оксазолидинона карбобензокси-глутаминовой кислоты водным раствором солянокислого гидроксиламина позволяет практически полностью удалить из продукта остатки формальдегида. Использование анилина на стадии каталитического гидрогенолиза препятствует образованию побочных продуктов.

Реакцию щелочного омыления полученного метилового эфира дипептида проводят действием 1 н NaOH в течение 30 минут.

Очистка конечного продукта путем перекристаллизации из водного изопропилового спирта позволяет получить кристаллическую мононатриевую соль изоглутамил-триптофана с чистотой >99% по данным аналитической высокоэффективной обращенно-фазовой хроматографии.

Далее способ поясняется примерами конкретной реализации, но не ограничивается ими.

Пример 1.

Получение оксазолидинона Z-D-Glu

В круглодонную колбу на 500 мл помещали 25 г (88.9 мМ) Z-D-Gl-OH, 5.33 г (177.8 мМ) параформа, 1.24 г (6.55 мМ) пара-толуолсульфокислоты и 150 мл бензола. Смесь кипятили 2 ч с насадкой Дина-Старка, удаляя образующуюся по ходу реакции воду, затем охлаждали до комнатной температуры и дважды промывали бензольный раствор 100 мл насыщенного раствора NaCl в делительной воронке.

Органический слой переносили в круглодонную колбу на 500 мл, добавляли 100 мл 10% раствора солянокислого гидроксиламина и интенсивно перемешивали на магнитной мешалке (до образования эмульсии) 30 минут. Водный слой отделяли в делительной воронке и отбрасывали, а органическую фазу повторно обрабатывали 100 мл 10% раствора солянокислого гидроксиламина в течение 30 мин.

Отделяли водный слой; органическую фазу промывали насыщенным раствором NaCl, сушили 3 ч безводным Na₂SO₄ и удаляли бензол на роторном испарителе. Получили 28.5 г светлого масла.

Получение оксазолидинона Z-D-iGlu-D-Trp-OMe

В круглодонной колбе на 500 мл в 200 мл сухого этилацетата растворяли оксазолидинон Z-D-Glu, охлаждали до -10°С на бане со льдом и солью и при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке добавляли 12.76 мл (97.6 мМ) изобутилхлорформиата и 10.73 мл (97.6 мМ) N-метилморфолина. Смесь перемешивали 3 мин, при этом выпадает осадок гидрохлорида N-метилморфолина, температура реакционной смеси поднимается до +12°С, затем вносили 24.86 г (97.6 мМ) H-D-Trp-OMe⋅HCl и 10.73 мл (97.6 мМ) N-метилморфолина. Реакционную массу перемешивали при охлаждении 30 мин до полного прохождения реакции по данным высокоэффективной обращенно-фазовой хроматографии (ВЭЖХ).

Реакционную смесь переносили в делительную воронку, добавляли 100 мл воды - осадок растворяется; водный слой отбрасывали, органическую фазу промывали еще 2 раза по 100 мл воды и 2 раза 100 мл насыщенного раствора NaCl, сушили 3 часа безводным Na₂SO₄ и удаляли этилацетат на роторном испарителе. Получили 52 г светло-коричневого масла.

Получение H-D-iGlu-D-Trp-OMe

К оксазолидинону Z-D-iGlu-D-Trp-OMe добавляли 35 мл (392 мМ, 4 экв.) анилина и растворяли в 400 мл перегнанного изопропилового спирта. Полученный раствор переносили в круглодонную колбу на 1000 мл и при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке добавляли 3.2 г 5% Pd/C (палладий на угле) в 80 мл воды и 37 мл 90% муравьиной кислоты. По данным ВЭЖХ реакция проходит полностью за 1 ч.

Катализатор отфильтровывали, изопропиловый спирт удаляли на роторном испарителе, разбавляли остаток водой до 250 мл и экстрагировали этилацетатом 1×200 мл и 2×100 мл для удаления анилина. Водный слой упаривали досуха на роторном испарителе при 40°С - выпадает кристаллический осадок. К осадку приливали 250 мл изопропилового спирта и перемешивали 1 ч на роторном испарителе, затем оставляли на ночь в холодильнике. Осадок отфильтровывали, промывали 3 раза по 50 мл изопропилового спирта и высушивали в вакууме.

Получено 18.5 г кристаллического порошка светло-кремового цвета. Выход 60% в расчете на исходную Z-D-Glu-OH.

Получение H-D-iGlu-D-Trp-ONa

К суспензии 17.3 г (50 mM) H-D-iGlu-D-Trp-OMe в 50 мл воды добавляли при перемешивании на магнитной мешалке 150 мл 1 н NaOH - осадок растворяется, раствор меняет цвет от светло-розового к желтому. Через 30 мин по данным ВЭЖХ реакция прошла полностью. рН раствора доводили до 6.8 добавлением примерно 2.5 мл концентрированной уксусной кислоты. Упаривали раствор на роторном испарителе до объема 80 мл и добавляли 280 мл изопропилового спирта - выпадает белый осадок. Оставляли колбу на ночь в холодильнике, затем осадок отфильтровывали, промывали 2 раза по 80 мл 80% водного изопропилового спирта и 1 раз чистым изопропиловым спиртом. Осадок растворяли в 70 мл воды (на роторном испарителе, чтобы убрать остаточный спирт) и добавляли 170 мл изопропилового спирта. Выпавший осадок, оставляли на ночь в холодильнике, затем отфильтровывали, дважды промывали 80 мл 80% водного изопропилового спирта, 1 раз чистым изопропиловым спиртом и сушили при 30°С в вакууме. Получили 11 г продукта (выход 37% в расчете на исходную Z-D-Glu-OH и 62% на H-D-iGlu-D-Trp-OMe. Упаривание маточного раствора с последующим растворением остатка в воде и добавлением изопропилового спирта позволяет дополнительно выделить 2 г продукта (суммарный выход 43% в расчете на исходную Z-D-Glu-OH).

Пример 2.

Синтез проводили как в примере 1, но к 40 г (81.3 мМ) оксазолидинона Z-D-iGlu-D-Trp-OMe, полученного как описано ранее, добавляли 15 мл (162.6 мМ, 2 экв.) анилина и растворяли в 160 мл изопропилового спирта. Полученный раствор переносили в круглодонную колбу на 1000 мл и при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке добавляли 1.7 г паллладиевой черни в 40 мл воды и 31 мл 90% муравьиной кислоты. По данным ВЭЖХ реакция проходит полностью за 1 ч.

Катализатор отфильтровывали, изопропиловый спирт удаляли на роторном испарителе, разбавляли остаток водой до 250 мл и экстрагировали этилацетатом 1×200 мл и 2×100 мл для удаления анилина. Водный слой упаривали досуха на роторном испарителе при 40°С - выпадает кристаллический осадок. К осадку приливали 250 мл изопропилового спирта и перемешивали 1 ч на роторном испарителе, затем оставляли на ночь в холодильнике. Осадок отфильтровывали, промывали 3 раза по 50 мл изопропилового спирта и высушивали в вакууме.

Получено 19.35 г кристаллического порошка светло-кремового цвета. Выход 62% в расчете на исходную Z-D-Glu-OH.

Пример 3.

Получение оксазолидинона Z-D-iGlu-L-Trp-OMe

В круглодонной колбе на 100 мл в 20 мл сухого этилацетата растворяли оксазолидинон Z-D-Glu, полученный из 2.06 г Z-D-Glu-OH; охлаждали до -10°С на бане со льдом и солью и при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке добавляли 0.96 мл (7.38 мМ) изобутилхлорформиата и 0.81 мл (7.38 мМ) N-метилморфолина. Смесь перемешивали 3 мин, при этом выпадет осадок гидрохлорида N-метилморфолина, температура реакционной смеси поднимается до +12°С, затем вносили 1.88 г (7.38 мМ) H-L-Trp-OMe HCl и 0.81 мл (7.38 мМ) N-метилморфолина. Реакционную массу перемешивали при охлаждении 30 мин до полного прохождения реакции по данным ВЭЖХ.

Реакционную смесь переносили в делительную воронку, добавляли 10 мл воды - осадок растворяется; водный слой отбрасывали, органическую фазу промывали еще 2 раза по 10 мл воды и 2 раза 10 мл насыщенного раствора NaCl, сушили 3 ч безводным Na₂SO₄ и удаляли этилацетат на роторном испарителе.

Получено 4.25 г светло-желтого масла.

Получение H-D-iGlu-L-Trp-OMe

К оксазолидинону Z-D-iGlu-L-Trp-OMe добавляли 1.57 мл (17.28 мМ, 2 экв.) анилина и растворяли в 34 мл изопропилового спирта. Полученный раствор переносили в круглодонную колбу на 100 мл и при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке добавляли 0.28 г 5% Pd/C в 8 мл воды и 3.31 мл (86.4 мМ) 90% муравьиной кислоты. По данным ВЭЖХ реакция проходит полностью за 1 ч.

Катализатор отфильтровывали, изопропиловый спирт удаляли на роторном испарителе, разбавляли остаток водой до 20 мл и экстрагировали этилацетатом 2×10 мл для удаления анилина. Водный слой упаривали досуха на роторном испарителе при 40°С - выпадает кристаллический осадок. К осадку приливали 10 мл изопропилового спирта и оставляли на ночь в холодильнике. Осадок отфильтровывали, промывали 3 раза по 3 мл изопропилового спирта и высушивали в вакууме.

Получено 1.53 г кристаллического порошка светло-кремового цвета. Выход 60% в расчете на исходную Z-D-Glu-OH.

Получение H-D-iGlu-L-Trp-ONa

К суспензии 1.53 г (4.43 мМ) H-D-iGlu-L-Trp-OMe в 4 мл воды добавляли при перемешивании на магнитной мешалке 13.28 мл 1 н NaOH. Через 30 мин по данным ВЭЖХ реакция прошла полностью. рН раствора доводили до 6.8 добавлением концентрированной уксусной кислоты. Упаривали раствор на роторном испарителе до объема 5 мл и добавляли 30 мл изопропилового спирта - выпадает белый осадок. Оставляли колбу на ночь в холодильнике, затем осадок отфильтровывали, промывали 2 раза по 8 мл 80% водного изопропилового спирта и 1 раз чистым изопропиловым спиртом. Осадок растворяли в 5 мл воды и добавляли 30 мл изопропилового спирта. Выпавший осадок, оставляли на ночь в холодильнике, затем отфильтровывали, дважды промывали 8 мл 80% водного изопропилового спирта, 1 раз чистым изопропиловым спиртом и сушили при 30°С в вакууме.

Получено 1.13 г продукта (выход 44% в расчете на исходную Z-D-Glu-OH).

Заявляемый способ позволяет получать продукт с высокой степенью чистоты (более 99% по данным аналитической ВЭЖХ), не требуя хроматографических методов очистки. При этом нет надобности в применении дорогостоящих исходных соединений таких, как бензиловый эфир Вое D-глутаминовой кислоты или бензиловый эфир D-триптофана. С учетом выхода конечного продукта стоимость промышленного синтеза D-изоглутамил-D-триптофана может быть снижена в 2-3 раза по сравнению с известными аналогами.

Сравнительно высокий выход, высокая чистота конечного продукта и его относительная дешевизна, позволяют организовать на основе заявляемого способа промышленное производство мононатриевой соли изоглутамил-триптофана.

Изобретение относится к органическому синтезу, а именно к получению D-изоглутамил-D или L-триптофана в форме мононатриевой соли. Способ включает стадии синтеза оксазолидинона карбобензокси-D-глутаминовой кислоты, его конденсации с метиловым эфиром триптофана, удаления карбобензокси защиты с раскрытием оксалидинонового кольца с помощью каталитического гидрогенолиза и щелочного омыления метилового эфира с получением мононатриевой соли дипептида, отличается тем, что на стадии синтеза оксазолидинона карбобензокси-D-глутаминовой кислоты используют промывку водным раствором солянокислого гидроксиламина, а стадию удаления карбобензокси защиты с одновременным раскрытием оксалидинонового кольца проводят путем каталитического гидрогенолиза над палладиевым катализатором при использовании муравьиной кислоты в качестве донора водорода и анилина, взятого в количестве от 2 до 4 эквивалентов по отношению к количеству защищенного дипептида. 3 пр.

Способ получения мононатриевой соли D-изоглутамил-D или L-триптофана, включающий стадии синтеза оксазолидинона карбобензокси-D-глутаминовой кислоты, его конденсации с метиловым эфиром триптофана, удаления карбобензокси защиты с раскрытием оксалидинонового кольца с помощью каталитического гидрогенолиза и щелочного омыления метилового эфира с получением мононатриевой соли дипептида, отличающийся тем, что на стадии синтеза оксазолидинона карбобензокси-D-глутаминовой кислоты используют промывку водным раствором солянокислого гидроксиламина, а стадию удаления карбобензокси защиты с одновременным раскрытием оксалидинонового кольца проводят путем каталитического гидрогенолиза над палладиевым катализатором при использовании муравьиной кислоты в качестве донора водорода и анилина, взятого в количестве от 2 до 4 эквивалентов по отношению к количеству защищенного дипептида.