СПОСОБ ФОРМИРОВАНИЯ ГЕПАРИНИЗИРОВАННОЙ ПОВЕРХНОСТИ Российский патент 1999 года по МПК A61L33/00 

Предлагаемое изобретение относится к области биологии, в частности биохимии.

С прогрессом ангиохирургии достигнуты значительные успехи в разработке и выполнении реконструктивных операций на сосудах. Однако тромбозы реконструированных сосудов, возникающие как в ближайшем, так преимущественно в отдаленном послеоперационном периодах, существенно снижают эффективность оперативных вмешательств. В связи с этим, несмотря на многочисленные работы, ведущиеся в этом направлении, проблема формирования атромбогенной, в частности, гепаринизированной поверхности сосудистых протезов, сосудов с эктомированной интимой, алло- и ксенотрансплантационного материала и т.д., не является до конца решенной в клинической практике.

Известны и описаны, а некоторые используются в практике (а), следующие способы формирования атромбогенной (гепаринизированной) поверхности:
а) местная обработка кровеносных сосудов и анастомозов раствором гепарина во время операции (Оперативная хирургия /Под ред. И.Литтманна.- Будапешт: Изд-во АН Венгрии, 1985.-1175с.). Мера эта является кратковременной: большая часть антикоагулянта не задерживается при восстановлении кровотока;
б) физико-химические и химические методы обработки поверхности кровеносных сосудов или алло- и ксенотрансплантатов. Например, в целях профилактики тромбоза стенки эндартерэктомированных артерий подвергают воздействию ультразвука в присутствии гепарина в течение 30 сек. Гепарин удерживается в стенке сосуда не более 12 часов (Антужев А.Ф. Профилактика инфицирования сосудистых протезов и тромбоза эндартерэктомированных артерий /Дисс. на соискание уч. степени канд. наук. -1985). Пупочные вены или сонные артерии собак, свиней, предлагаемые к использованию в качестве сосудистых трансплантатов, химически модифицируют гепарином с помощью карбодиимида в течение не менее 5 часов, достигая концентрации гепарина 31,5 мкг на см² поверхности (Venkataramani E. S. , Fred Senatore, Mario Feola, et al. Nonthrombogenic small-caliber human umbilical vein vascular prosthesis //Surgery.- 1986.-V. 6.-P.735-741);
в) гепаринизация поверхности различных синтетических (например, полиуретановых) сосудистых протезов посредством химической модификации функциональных групп (PCT WO 9000, 343; Heyman P.W., Cho C.S., McRea J.C. et al. Heparinized polyurethanes: in vitro and in vivo stadies //J.of Biomedical Materials Research. -1985. -V. 19. -P. 419-436), пропитка синтетических трансплантатов гепарин-коллагеновым сополимером (Shankar Н., Senatore F., Wu D. R. et al. Co-immobilisation and interaction of heparin and plasmin on collageno-elastic tubes //Biomaterials, Artificial Cells and Artificial Organs. -1990. -V. 18. -#1. -P. 59-73) и т.д. Эти способы гепаринизации либо находятся в стадии научных разработок, либо не получили практического применения из-за некоторых недостатков.

Также известен способ связывания гепарина, являющегося полианионным электролитом, с катионизированной поверхностью. Например, гепарин или гепарансульфат (из эндотелия бычьей аорты), иммобилизованные на частично катионизированной с помощью 3-хлор-2-гидроксипропилтриметиламмонийхлорида поверхности целлюлозы, обладают антикоагуляционной активностью и могут использоваться в качестве биоматериалов - мембран с атромбогенной поверхностью, подобной поверхности кровеносных сосудов (Baumann Н., Keller R., Ruzicka Е. Partially cationized cellulose for non-thrombogenic membrane in the presence ofheparin and endothelial-cell-surface-heparansulfate //J. Membr. Sci. -1991. -V. 61. -P. 253-268). Такой же принцип связывания гепарина с четвертичными аммониевыми солями применяется в анионобменной хроматографии. Также описано взаимодействие гепарина с поликатионной поверхностью, образованной иммобилизованным на полиэтилвининиловом спирте поли-L-лизином•НВг (Xinghang М., Fazal M.S., Wan K.S. Heparin binding on poly(L- lysine)-immobilized surface //J. Colloid Interface Sci. -1991. -V. 147. -#1. -P. 251-261). На гладкой поверхности полимера за 30 мин из крови или плазмы при скорости 100 мл/мин концентрация гепарина достигает 0,52 мкг/см², на пористой - 1,69 мкг/см². Для проявления поверхностью антикоагулянтных свойств концентрация гепарина должна быть не менее 5 мкг/см² (Venkataramani E.S., Fred Senatore, Mario Feola, et al. Nonthrombogenic small-caliber human umbilical vein vascular prosthesis //Surgery. -1986. -V. 6. -P. 735-741).

Авторами предлагается способ формирования гепарированной поверхности посредством нанесения водного раствора 3-диметиламино-7-диазо(5'-салицил)-8-метилфентиазоний хлорида (I) или 3-диметиламино-7-диазо(5'- ацетилсалицил)-8-метилфентиазоний хлорида (II) на любую поверхность, способную либо адсорбировать, либо химически связывать молекулы красителя. Таким образом с помощью молекул I и II, являющимися четвертичными аммониевыми солями, вначале формируется катионизированная поверхность. Гепарин, как полиэлектролит с отрицательно заряженными группами, связывается с молекулами I и II, придавая поверхности антикоагулянтные свойства. Описанный механизм взаимодействия красителей из класса фенотиазиновых соединений и гепарина (гепарансульфата, ГС) лежит в основе явления метахромазии (Кононский А.И. Гистохимия. -Киев: Вища школа, 1976.-280с.).

Преимуществами данного способа является быстрота и легкость формирования поверхности с антикоагулянтными свойствами, а также возможность в широких пределах изменять поверхностную концентрацию гепарина в зависимости от концентрации раствора красителей (см. таблицу).

Краситель I является продуктом азосочетания толуидинового синего с салициловой кислотой, II - продуктом реакции ацилирования I по гидроксильной группе. Эти вещества сохраняют метахроматические свойства, позволяющие применять их для взаимодействия с гликозаминогликанами соединительной ткани.

Для придания поверхности антикоагулянтных свойств можно обрабатывать последовательно водными растворами красителей и гепарина любые ткани живого организма, имеющие в составе гликозаминогликаны, например, эндар-терэктомированные кровеносные сосуды, алло- и ксенотрансплантаты.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующим примером. Водные растворы I и II различной концентрации наносили на поверхность одинаковых по площади фрагментов артерии или аорты с эктомированной интимой (кадаверный материал) в течение 2-5 минут, избыток красителя удаляли фильтровальной бумагой и обрабатывали раствором гепарина (5000 ед./мл) в течение 2-5 минут. Не вступившие в реакцию с поверхностью медии (media) краситель и гепарин отмывали проточной водой в течение 10-15 мин. Для количественного определения гепарина краситель на поверхности фрагментов сосуда восстанавливали Zn в солянокислой среде до лейкосоединения. После обесцвечивания красителей гепарин в растворе определяли карбазоловым методом по реакции Дише на уроновые кислоты (Carbohydrate analysis /Ed. by Chaplin M.F. and Kennedy J.F.-Oxford, Washington, 1986.-228p) и рассчитывали на 1 см² поверхности media (таблица).

Изобретение относится к области биологии, в частности биохимии. Способ формирования гепанизированной поверхности заключается в последовательном нанесении водных растворов красителя 3-диметиламино-7-диазо(5'-салицил)-8-метилфентиазоний хлорида или 3/диметиламино-7-диазо(5'-ацетилсалицил)-8-метилфентиазоний хлорида и гепарина на поверхность, способную адсорбировать или химически связывать молекулы красителя. Способ отличается быстротой и легкостью формирования поверхности с антикоагулянтными свойствами и возможностью в широких пределах изменять поверхностyную концентрацию гепарина в зависимости от концентрации раствора красителей. 1 табл.

Способ формирования гепаринизированной поверхности посредством нанесения раствора гепарина, отличающийся тем, что поверхность предварительно обрабатывается водным раствором красителя 3-диметиламино-7-диазо(5' -салицил)-8-метилфентиазоний хлорида или 3-диметиламино-7-диазо(5' -ацетилсалицил)-8-метил-фентиазоний хлорида в концентрации 0,05-1,0%.