Способ определения количества жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий в биопрепаратах Советский патент 1990 года по МПК C12N1/20 C12N1/00 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использЬвано для определения жизнеспособности клеток молочнокислых бактерий в культурах или биопрепаратах.

Целью изобретения является упрощение способа определения количества жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий в биопрепаратах.

Изобретение заключается в том, что в качестве основы для питательной среды, на которой выращивают молочнокислые бактерии, используют неохмеленное пивное сусло, забуференное до рН 6,6-7,0.

Пример 1. Неохмеленное пивное сусло получают с пивзавода в стерильной стеклянной посуде (емкостью 0,5 или 1л), доставляют в лабораторию, где в нем определяют содержание Сахаров (всех - по плотности ареометром Баллинга. глюкозы - ор- тотолуидиновым методом) и рН. В доброкачественном пивном сусле содержа- ние Сахаров должно соответствовать всех 17-19°Б, глюкояы 2-3%.ирН5.4.

Прозрачную надосадочную жидкость сусла декантируют, осадок отбрасывают. Прозрачное сусло стерилизуют при

о:

го,5 атм 30 мин, охлаждают н сохраняют при .

Перед примененном стерильное сусло разводят стерильной водопроводной водой точно до 9 Б. Отбирают пробу разведенного сусла объемом 25 мл в, стаканчик вместимостью.50 мл, снимают кривую титрования в диапазоне рН 7,0- 4,5, используя стеклянный электрод, 0,1 н растворы серной кислоты и гидроокиси натрия. Рассчитывают буфер ность этой основы питательной среды. Она должна быть в диапазону 11 - 13 мэкВ/л.

В основу среды вносят забуфериваю- щую соль - ацетат (или сукцинат или ) натрия (или аммония или калия) до массовой доли безводного вещества 0,5%, соль растворяют. Добав- лением 1 н, раствора гидроокиси натрия устанавливают рН 6,8, снова определяют и расчитывают буферность питательной среды, которая должна соответствовать 38 мэкВ/л,

При более низкой буферности (13 мэкВ/л) среда сильно закисляется угнетается рост колоний: колонии получаются очень мелкие - 0,5 мм, а их количество в 1 ,5 раза уменьшается по сравнению со средой с оптимальной буферностью, Забуферивание среды г ацетатом до 38 мзкВ/л приводит к уве I личению размера колоний в 1,5-2 раза I При более сильном забуферивании сре- 1 ды ( мэкВ/л) размер колоний и количество клеток не увеличиваются, однако селективный фактор - подкисле ние - исключается, тогда при определении молочнокислых микробов в таких I субстратах как корма, фекалии и другие вырастают не только молочнокислы но и другие микробы,, чувствительные к подкисленшо. Вследствие этого признано целесообразным умеренно забуфе- ривать среду до 38 мэкВ/л, сохраняя ее селективность

Приготовленную питательную среду разливают в требуемые для работы емкости (пробирки, колбы и т.д.). Высо

та столба жидкости в них должна быть

4 см и более. Для создания анаэробных условий на питательную среду наливают стерильное вазелиновое масло, высота столба которого должна быть I,5 см. Среду стерилизуют при 0,5 атм 30 мин,55 охлаждают до комнатной (18-20 С) температуры, инокулируют и инкубируют. Жидкая питательная среда предназна

0

5

0

5

чена для глубинного, выращивания молочнокислых микробов.

Для приготовления твердой пита- тельной среды в подготовленную основу питательной среДы вносят агар.до массовой доли 1,5%. Смесь нагревают на водяной -бане до 90°С и полного расплавления агара. Горячую расп.павлен- ную. среду фильтруют через марлю, осадок отбрасывают, в фильтрате индикаторной бумажкой контролируют рН, если необходимо корр.ектируют. до рН 6,8. Среду стерилизуют автоклави- рованием при 0,5 атм 30 мин.

Для выращивания и хранения микробов стерильную среду разливают в стерильные пробирки. При 40 С их инокулируют .молочнокислыми микробами, ком- .поненты тщательно, перемешивают и кубируют при требуемой температуре.

Для определения количества .жизнеспособных клеток молочнокислых микробов в препаратах и культурах их асептически разводят на физрастворе в ряду пробирок с шагом десять. Взвесь клеток с концентрацией 100 кл./мл асептически вносят в объеме 1 мл в стерильную чашку Петри; находящуюся на строго горизонтальной поверхности. В Нее же асептически наливают стерильную расплавленную среду с температурой в таком количестве, чтобы высота слоя ее в чашке равнялась 4 - 5 мм. Компоненты тщательно перемешивают круговыми движениями, после чего смесь охлаждают до застывания агара, а затем инкубируют при требуемой температуре в течение 1-3 сут, (в зависимости от вида микроба).

Интенсивность роста (размер и ко- , личество д олоний) молочнокислых микробов с щественно зависит от степени ,анаэробных .условий$ определяемой толщиной слоя питательной среды, В тонком слое (1-2 мм) колонии очень мелкие, их количество в 2-4 раза {меньше, чем в оптимальном слое (4- 5 мм)I в более толстом слое (6-8 мм) .размер и количество колоний не увеличивается, но подсчет их затрудняется вследствие снижения прозрачности среды и увеличения помех за счет наложе,ния колоний друг на друга по толщин,

Результаты сравнительного опреде- Ленин числа жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий в разных биопрепаратах представлены з табл,1.

10

516011

Представленные результаты свиде- тельствуют. о том, что более доступная, простая в изготовлении и дешевая среда на основе готового неохмеленного сусла пригодна для определе- ния количества живых клеток в биопре- паратах, а в случае с ацидофилином число определяемых жизнеспособных клеток повышаетбя по ср авнению с из- в естной средой.

В табл.2 представлены сравнительные данные по определению молочнокислых микроорганизмов в биопрепарате Галлиферы при его разведении в 10 раз. .

Преимущество предлагаемого способа заключается в том, что в твердой прозрачной питательной среде на основе забуференного сусла вырастают колонии, размер которых в 1,5-2 раза больше колоний на известной питательной среде, содержащей гидролизат кукурузной муки и БВК в качестве органических факторов роста. Увеличение размера колоний приводит к повьппению

15

20

25

10

11

5

0

5

16

достоверности результатов.подсчета клеток жизнеспособных молочнокислых микробов в биопрепаратах. Формула и.зо.бретения

1. Способ определения количества жизнеспособных клеток молочнокислых. бактерий в биопрепаратах предусматривающий их выращивание на агаризо- ванной питательной среде содержащей .органический фактор роста, в оптимальных для размножения микрооргани - мов условиях с последующим учетом результатов, отличающийся тем,что, с целью упрощения способа, в качестве фактора роста используют неохмеленное пивное сусло, забуфе- ренное до значения рН 6,, а вы- соту слоя питательной среды устанавливают 4-5 мм.

2. Способ ПОП.1, отличающийся тем, что забуферивание неохмеленного пивного сусла производят ацетатом или сукцинатом, или цитратом натрия, или аммония, или калия.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для определения жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий в культурах или биопрепаратах. С целью упрощения способа определения жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий в биопрепаратах, в качестве органического фактора роста в питательной среде для выращивания молочнокислых микробов используют неохмеленное пивное сусло, забуференное ацетатом, или сукцинатом, или цитратом натрия, или калия или аммония до рН 6,0-7,0. На этой питательной основе готовят жидкие среды для выращивания накопительных культур а агаризованные для подсчета числа жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий в биопрепаратах, при этом высоту слоя как агаризованной, так и жидкой среды устанавливают 4-5 мм. Использование простой в изготовлении и дешевой питательной среды на основе неохмеленного пивного сусла приводит к улучшению условий выращивания бактерий и повышению достоверности в определении числа жизнеспособных клеток. 1 з.п.ф-лы, 2 табл.

Таблица1

Число клеток в 1 г биопрепаратов

Еиосил Ацидофилин

) 52-ю 201 МО

51-10 200-10

Таблица2

Количество Размер колонии,

колоний мм

на чашке

кокков I палочек

.

1,37 1 34