Питательная среда для выделения лактобацилл Советский патент 1989 года по МПК C12Q1/04 C12Q1/04 C12R1/225 

(21)4305351/2.8-13

(22)14.09.87

(46) 15.05.89. Бюл. № 18

(71)Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков

(72)М.В.Тюрин и Б.А.Шендеров

(53)576.8.093.1(088.8)

(56)Rogosa Mi, Mitchell J.A., Wiseman R.F. A Selective Medium for the Isolation and Enumeration of oral and fecal Lactobacilli,- J, Bacteriol, 1951, 62, 132-133.

(54)ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛАКТОБАЦИЛЛ

(57)Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при проведении качественных исследований на лактобациллы объектов окружающей среды. Цель изобретения - повышение селективных свойств среды. Для приготовления среды берут навески, г/л: глюкоза 15-25; триптический перевар казеина 8-15; дрожжевой экстракт 4-6; мясной экст 1

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при проведении количественного учета лактобацилл в объектах окружающей среды.

Цель изобретения - повышение селективных свойств среды.

Использование среды иллюстрируется следующими лримерами.

Пример 1,В 0,6л дистиллированной воды растворяют 20 г трис- основания и доводят рН раствора конракт 8-15; ацетат натрия 25-40; цитрат аммония 1-3; дигидрофосфат калия 3-6; сульфат магния 0,4-0,6; хлорид марганца 0,1-0,3; сульфат железа 0,004-0,3; твин-80 0,8-1,5; оксь- кобаламин 0,0025-0,001} тиамина бромид 0,025-0,075; рибофлавин 0,0005- 0,0015; пиридоксина гидрохлорид 0,025- 0,075; никотиновая кислота 0,005- 0,015; аскорбиновая кислота 0,025- 0,075; биотин 0,0005-0,0015; панто- тенат кальция 0,0005-0,0015; трис- солянокислый буфер рК 5,85-5,9 12,1- 48,4; карбонат кадмия 0,008-0,02 ; желчь 0,008-0,012; фузидин натрия 0,0001-0,0009; .амфотерицин В 0,1-0,3 или натриевая соль леворина 0,25-0,46; , агар-агара 12-20; вода остальное. При этом витамины, карбонат кадмия и антибиотики вносят в среду стерильно после ее автоклавирования. На среде вырастают преимущественно лактобациллы и в небольшом количестве энтерококки. 1 з.п.ф-лы. 1 табл.

i

(Л

4Ь

sl

со

СП

центрированной соляной кислотой плотности 1,18 г/см2 до 5,9-6,0. Навески ингредиентов, кроме мясного экстракта, витаминов, карбоната кадмия, амфотерицина В, фузидина натрия и агар-агара,тщательно перемешивают в сухой колбе. Затем к полученной смеси добавляют приготовленный трис-соляно- кислый буфер и вносят в полученный раствор навеску мясного экстракта. Полученную смесь тщательно перемешивают. Доводят до рН 5,85-5,9 соляной

кислотой той же плотности. В отдельной колбе объемом 2 л в 0,3 л дистиллированной воды кипячением растворяют 15 г агар-агара. После этого к ра плавленному агар-агару добавляют приготовленный ранее раствор ингредиентов и тщательно перемешивают. Доводя общий объем до 0,992 л дистиллированной водой и автоклавируют среду при 112 С в течение 30 мин. После авто- клавирования среда должна быть несколько темнее цвета пива.

К неостывшей (60 С) среде асептически добавляют г: оксикобаламин 0,0005, тиамина бромид 0,05, пиридо- ксина гидрохлорид 0,05, никотиновую кислоту 0,01, аскорбинового кислоту 0,05, рибофлавин 0,0001, биотин 0,0001, пантотенат кальция 0,001 (ви тамины используют в виде растворов в 0,01 н, КС1 при их концентрации .0,1 г/мл каждого - в количестве 10мл/л среды), растворы амфотерицина В в стерильной дистиллированной воде 1 мл концентрацией 200 мг/мл и фуэир- дина натрия в стерильной дистиллиро ванной воде 1 мл концентрацией 0,5 мг/мл, карбонат кадмия 10 мг. Навеску карбоната кадмия растворяют в 0,2 н. соляной кислоте и доводят рН до 6,0 едким натром 1 н, концентрации, затем общий объем раствора доводят дистиллированной водой до концентрации карбоната кадмия 10 мг/мл, стерилизуют фильтрованием. Полученную среду тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри таким образом, чтобы толщина слоя среды была не менее 0,5 см.

Полученная селективная среда имеет следующий состав, г/л:

Глюкоза20,0

Триптический перевар казеина 10,0 .

Дрожжевой экстракт 5,0

Мясной экстракт 10,0

Ацетат натрия 30,0

Цитрат аммония2,0

Дигидрофосфат калия 3,5

Сульфат магния0,5

Хлорид марганца 0,2

Сульфат железа0,015

Твин-801,0

Оксикобаламин0,0005

Тиамина бромид0,05

Рибофлавин0,001

Пиридоксина г.ид

0 - n

е

0

5

рохлорид0,05

Никотиновая кис-

лота0,01

Аскорбиновая кислота0,05

Биотин0,001

Пантотенат кальция 0,001

Трис-соляно-кислый буфер20,0

Карбонат кадмия 0,1

Желчь0,1

Фузидин натрия0,0005

Амфотерицин В0,2

Агар-агар15,0

Дис тиллиров анна я

водаОстальное.

На полученную среду производят высевы взвесей 24-48-часовых агаровых культур референс-штаммой лактобацилл в цистеин-рингеровском растворе при посевной дозе 1000 клеток в 0,025 мл раствора, музейных штаммов микроорганизмов других видов и некоторых изолятов из испражнений-человека при посевной дозе 10 клеток в 0,025 мл цистеин-рингеровского раствора. Посевы инкубируют аэробно при 37 С в течение 48 ч.

Селективная среда обеспечивает рост всех использованньцс штаммов лактобацилл, в то же время рост всех других микроорганизмов -за исключением энтерококков не наблюдается.

Из испражнений 23 здоровых лиц выделено 205 штаммов лактобацилл различных видов и 50 штаммов энтерококков .

Пример 2. Готовят среду в соответствии с примером 1, но компоненты берут в следующем количестве, г/л:

Глюкоза15,0

Триптический перевар казеина8,0

Дрожжевой экс так т 4,0

Мясной экстракт 8,0

Ацетат натрия25,0

Цитрат аммония1,0

Дигидрофосфат калия3,0 Сульфат магния0,4

Хлорид марганца 0,1 Сульфат железа0,004

Твин-80.0,8

Оксикобаламин0,00025

Тиамина бромид0,025

Рибофлавин0,0005

Пиридоксина гидрохлорид0,025

Никотиновая кислота 0,005 Аскорбиновая кислота0,025 Биотин0,0005 Пантотенат кальция 0,0005 Трис-соляно-кислый буфер12,1 Карбонат кадмия 0,008 Желчь 0,008 Фузидин натрия 0,0001 Натриевая соль ле- ворина 0,25 Агар-агар 12,0 Дистиллированная вода Остальное На полученную среду производят выы различных штаммов лактобацшш, вдомонад, эшерихий, клебсиелл, илл, энтерококков, дрожжевых грии др. После 48 ч аэробного инкуования наблюдают рост всех испольанных штаммов лактобацилл (кроме tobacillus fermentum 53163) и энококков. Рост других микроорганизотсутствует.

П р и м е р 3. Аналогично приме1 готовят селективную среду следуго состава, г/л:

Глюкоза25,0

Триптический перевар казеина15,0 Дрожжевой экстракт 6,0 Мясной экстракт 15,0 Ацетат натрия 40,0 Цитрат аммония 3,0 Дигидрофосфат калия 6,0 Сульфат магния 0,6 Хлорид марганца 0,3 Сульфат железа 0,03 Твин-80 1,5 Оксикобаламин 0,001 Тиамина бромид 0,075 Рибофлавин 0,0015 Пиридоксина хлорид 0,075 Никотиновая кислота 0,015 Аскорбиновая кислота 0,075 Биотин 0,0015 Пантотенат кальция 0,0015 . Трис-с оляно-к ислый буфер 48,4 Карбонат кадмия 0,02 Желчь 0,012

795176

Фуэидин натрия0,0009

Амфотерицин В0,3

Агар-агар20,0

Дистиллированная водаОстальное

На полученную селективную среду производят высевы штаммов, перечисленных в примере 2. После 48 ч аэроб- Ю ного инкубирования при 37 С наблюдают рост штаммов лактобацилл (кроме L.helveticus 15009) и энтерококков. Рост других микроорганизмов отсутствует (см.таблицу.

15 Как видно из представленных в таблице данных, на известных средах во 2-6 разведениях материала вырастают бациллы, кандида, некоторые другие микроорганизмы. Вплоть до 7-9 2о разведения наблюдается рост энтерококков. На предлагаемой среде растут лишь лактобациллы и энтерококки, причем рост первых на два порядка в пятом и седьмом разведениях материала 25 превосходит таковой на известной

среде. Рост энтерококков на предлагаемой среде хуже, чем на первых двух средах. Колонии лактобацилл, снятые с известных сред, при рассеве выяв- 30 ляют содержание кишечной палочки, пептострептококков, кандида и других микроорганизмов. Колонии лактобацилл, снятые с предлагаемой селективной среды, содержат монокультуру и не 25 требуют дальнейшей очистки путем рассевов.

Формула изобретения

40 1 Питательная среда для выделения лактобацилл, содержащая глюкозу триптический перевар казеина, дрожжевой экстракт, ацетат натрия, цитрат аммония, дигидрофосфат калия, суль45 Фат магния, соль марганца (II), сульфат железа (II), твин-80, агар-агар и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения селективных свойств сре50 ды, она дополнительно содержит мясной экстракт, оксикобаламин, тиамина бромид, рибофлавин, пиридоксина гидрохлорид, никотиновую кислоту, аскорбиновую кислоту, биотин, пантоте55 нат кальция, 0,1-0,4 М трис-соляно- кислый буфер с рН 5,85-5,9, карбонат кадмия, антибиотик, сухую медицинскую желчь, фузидин натрия, в качестве -соли марганца она содержит хлорид

марганца при следующем соотношении

ингредиентов, г/л:

Глюкоза15,0-25,0

Триптический . перевар казеина8,0-15,0 Дрожжевой экстракт 4,0-6,0 Мясной экстракт8,0-15,0 Ацетат натрия 25,0-40,0 Цитрат аммония 1,0-3,0 Дигидрофосфат калия3,0-6,0 Сульфат магния0,4-0,6 Хлорид марганца (II)0,1-0,3 Сульфат железа (II)0,004-0,3 Твин-800,8-1,5 Оксикобаламин 0,0025-0,001 Тиамина бромид 0,025-0,075 Рибофлавин0,0005-0 0015 Пиридоксина гидрохлорид 0,,075

14795178

Никотиновая кислота 0,005-0,015 Аскорбиновая

0,025-0,075 0,0005-0,0015

, кислота Бистин Пантотенат кальция 0,1-0,4 М

10 трис-соляно- кислый буфер с рН 5,85-5,9 Карбонат кадмия

15 Сухая медицинская желчь0,008-0,012 Фузидин натрия 0,0001-0,0009 Антибиотик Агар-агар

20 Дистиллированная водаОстальное. 2, Питательная среда по п,1, личающаяся тем, что в стве антибиотика она содержит а

25 терицин В в количестве 0,1-0,3 среды или натриевую соль левори количестве 0,25-0,46 г/л среды.

0,0005-0,0015

12,1-48,4 0,008-0,02

0,1-0,46 12,0-20,0

0,025-0,075 0,0005-0,0015

кислота Бистин Пантотенат кальция 0,1-0,4 М

0 трис-соляно- кислый буфер с рН 5,85-5,9 Карбонат кадмия

Сухая медицинская желчь0,008-0,012 Фузидин натрия 0,0001-0,0009 Антибиотик Агар-агар

0 Дистиллированная водаОстальное. 2, Питательная среда по п,1, о т - личающаяся тем, что в качестве антибиотика она содержит амфо5 терицин В в количестве 0,1-0,3 г/л среды или натриевую соль леворина в количестве 0,25-0,46 г/л среды.

0,0005-0,0015

12,1-48,4 0,008-0,02

0,1-0,46 12,0-20,0

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при проведении количественных исследований на лактобациллы объектов окружающей среды. Цель изобретения - повышение селективных свойств среды. Для приготовления среды берут навески (г/л) глюкозы 15-25

триптического перевара казеина 8-15

дрожжевого экстракта 4-6, мясного экстракта 8-15

ацетата натрия 25-40

цитрата аммония 1-3

дигидрофосфата калия 3-6

сульфата магния 0,4-0,6

хлорида марганца 0,1-0,3

сульфата железа 0,004-0,3

твина = 80 0,8-1,5

оксикобаламина 0,0025-0,001

тиамина бромида 0,025-0,075

рибофлавина 0,0005-0,0015

пиридоксина гидрохлорида 0,025-0,075

никотиновой кислоты 0,005-0,015, аскорбиновой кислоты 0,025-0,075, биотина 0,0005-0,0015

пантотената кальция 0,0005-0,0015

трис-солянокислого буфера PH 5,85-5,9 12,1- 48,4, КАРбОНАТА КАдМия 0,008-0,002

жЕлчи 0,008-0,012

фузидиНА НАТРия 0,0001-0,0009

АМфОТЕРициНА В 0,1-0,3 или натриевой соли леворина 0,25-0,46

агар-агара 12-20

вода остальное. При этом витамины, карбонат кадмия и антибиотики вносят в среду стерильно после ее автоклавирования. На среде вырастают преимущественно лактобациллы и в небольшом количестве энтерококки. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.