Способ определения оксидоредуктазной активности ферментов и иммуноферментных конъюгатов Советский патент 1988 года по МПК G01N33/50 

1

Изобретение относится к аналитической хнмки и может быть использовно в медицине, сельском хозяйстве, химической, пищевой и фармацевтиче- ской промыпшенности, а также в биотнологии и постановке биохимическгта; экспериментов.

Цель изобретения - упрощение и ускорение .метода определения ок-си доредуктаз, а также увеличение его чувствительности.

Способ заключается в том, что для определения оксидоредуктазной активности ферментов, а также иммунофер- . ментных конъюгат.ов проводят инкуе)а- ирю анализируемого фермента в присутствии субстратов, один из которых является электронодонорным соединением, реагирую.цим с галоидными .солями серебра фотоматериала. Измерение концентрации субстрата донора- Электрнов проводят с помощью предварительно засвеченного фотоматериала, определяя интенсивность затемнения фотоматериала после нанесения образца и сопоставляя ее с градуировочным графиком.

В качестве субстратов можно испол зовать разнообразные электронодонорные соединения, реагирующие с галоид :г1ыми солями серебра фотоматериалы, т.е. с веществами, являющимися проявителями. Применение способа ускоря- ат определение активности в 20-40 ра упрощает процесс и увеличивает его чувствительность в 10-20 раз (от 2Q40 до 2 нг/мл)

Пример 1. Определение активности пероксидазы.

В качестве субстратной смеси в пе роксидазной реакции используют проявтель ПФ (фенидон-гидрохнион), предварительно разбавленный в i О раз фосфатным буфером рН 7,4. Пероксидазо- содержащие растворы готовят на фоне проявителя. По 0,1 мл фермент-субстратной смеси смешивают в лунках полистироловых планшетов с 0,1 мл

10 М перекиси водорода о Через 30 м по 0,02 мл смеси наносят на поверхность фотопластинки. Капли на фотопластинке оставляют на 3-5 мин, стряхивают и пластинку промывают водой„ Закрепление изображения проводят в растворе тиосульфата натрия. Полученные на фотопластинке темные пяти:а фо тометрируют на микрофотометре МФ-4, используя шкалу почернений, и срав

15

, to

о

Q

0

5

5

нивают с полученным градуировочным графиком, который строят в координатах S (почернения) - IgC (концентрация пероксидазы, нг/мл). Интенсивность почернений обратно пропорциональная концентрации пероксидазы.

Диапазон определяемьгх концентраций пероксидазы 3000-3 нг/мл. Предел обнаружения 2 нг/мл.

Пример 2. Определение активности имМунопероксидазных конъюгатов.

Метод основан на изменении концентрации гидрохинона, входящего в состав проявителя при каталитическом воздействии на него перекиси водорода в присутствии имм нопероксидазного конъ- югата.

Несколько кристалликов лиофилизи- рованного иммунопероксидазного конъ- югата для иммуноферментного анализа: аспарагиназапероксидаза и иммуно- ноглобулин С осла против иммунно- : глобулина G кролика меченый перокси- дазой (конъюгат для прямого конкурентного ИФА и ИФА с использованием вторых антител соответственно) раст- воояют в физиологическом растворе. Концентрацию белка определяют на спектрофотометре с использованием номограмм при длинах волн 260 нм. и / 280 нм. Концентрацию пероксидазы рассчитывают по формуле С О,44 А мг/мл, где А - оптическая плотность раствора при / 403 нм. Полученные растворы конъюгата разбавляют В проявителе ПФ.

Разведения проводят в лунках полистироловых микроплат для и1-1муно- логических реакций, получая 11 разведения (одна лунка оставляется для фоновой реакции, не содержащей перо- ксидазу) В соседний ряд лунок заливают стандартные концентрации пероксидазы, приготовленные из лиофи- лизированноГ о препарата фирмы Re- anal, RZ 0,6. Инициируют реакцию добавлением 0,1 мл 0,001 М раствора перекиси водорода. Через 20 мин по 0,02 мл раствора из лунок планшета наносят на поверхность засвеченного фотоматериала. Интенсивность полученных почернений сравнивают с почернениями соответствующшта различным концентрациям нативной пероксидазы. Отношение концентрации пероксид;азы (с учетом разведения) к общей концентрации белка позволяет судить о пригодности иммунных конъ3

югатов для иммуиоферментного анализа.

Пример 3, Определение (глю козы или активности глюкозооксида зьОь

из свежевоз огнанного бензхиноня

готовят 0,1 М раствор в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,4. На фоне приготовленного раствора растворяют глюкозооксидазу 10 М. По 0,1 мл этой смеси смешивают в лунках полистироловых планшетов для иммунологических реакций с О,1 мл глюкозо содержащим раствором. После. 30-минутной экспозиции по 0,02 мл смеси, содержащей продукт ферментат шной реакции - гидрохинон, наносят с помощью автоматической микропипетки на поверхность засвеченной полоски фотоматериала (фотопластинка, фотобумага или фотопленк-а) . При появлении на фотопластинке темных пятен интенсивность которых достаточна для фотометрирования, фотопластинку промьгоагот водой и фиксируют в растворе тиосульфата натрия обычным способом. Интенсивность пятен определяют на микрофотометре МФ-4 и полученные величины сравнивают с градуиро- вочным графиком, построенным с известными концентрациями глюкозы на той же фотопластинке.

Диапазон определяемых содержаний глюкозы 100-0,2 мМоль. Минимально определяемая концентрация глюкозы 2 мг% (.0,1 мМоль/л) , что соответствует клинически значимым концентрациям.

4QSnf 4

В качестве субстратов в реакции (яфеделения оксидоредуктаз .могут исиользонаны не только -гидро- хиноп, но и другие электронодонор- 1ые соединения: кятехол, резерци- НОЛ, р-крезол, пирогаллол, фенол, о-фенилендиамин, р-фенилендиамин, Ферроцианид, аскорбат, индолеацетат,

10 которые, как известно, используются в фотографии при проявлении, дублении и усилении изображения.

Таким образом, изображение п.озво- ляет значительно ускорить процесс

15 определения активности оксидоредук-- таз по сравнению с известным способом - 20-30 мин вместо 10-24 ч, упростить его (за счет использования засвеченных фотоматериалов и

20 проведение определения на свету), а также увеличить чувствительность определения - 2 вместо 20-30 нг/мл.

Формула изобретения

25 Способ определения оксидоредук- . тазной активности ферментов и имму- ноферментных коньюгатов, включающий инкубацию ферментсодержащих препаратов в присутствии субстратов и из30 мерение концентрации одного из субстратов с помощью фоточувствительных материалов, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа и увеличения его чувствительности, в качестве одного из субстратов исггользуют электронодонор- ные соединен :я, реагирующие с галоид- ньми солями серебра фотоматериала, а фоточувствительный материал предва40 рительно засвечивают.

35

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к технике проведения ферментативного анализа, может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, химической, пищевой и фармацевтической промышленности, а также в биотехнологии и постановке биохимических экспериментов. Цель изобретения - ускорение и упрощение способа определёняя оксидоредуктаз, а также увеличение его чувствительности. Способ заключается в том, что для определения оксидо- редуктазной активности ферментов, а также иммуноферментных конъюгатов проводят инкубацию анализируемого фремента в присутствии субстратов, один из которых является электроно- донорным соединением, реагирующим с галоидными солями серебра . фотоматериала, т.е. в качестве субстрата используют разные соединения, являющиеся проявителями. Измерение концентрации такого субстрата в ходе ферментативной реакции проводят с помощью предварительно засвеченного фотоматериала, определяя интенсивность затемнения фотоматериала после нанесения образца и сопоставляя ее с градуировочным графиком. Способ позволяет использовать засвеченный фотоматериал. Применение способа ускоряет определение активности оксидоредуктаз в 20- 40 раз и увеличивает его чувствительность в 10-20 раз. (Л 4 О9 СО ел о ф