СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТАФИЛОКОККОВОЙ АНАТОКСИН-ВАКЦИНЫ Российский патент 1999 года по МПК A61K39/85 C12N1/06 C12N13/00 C12N1/06 C12R1/44 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к ветеринарии, и может быть использовано для профилактики и лечения маститов, ускорения заживления ран, иммуностимуляции и неспецифической профилактики ринотрахеита и парагриппа-3 крупного рогатого скота.

Известен способ получения стафилококковой анатоксин-вакцины путем выращивания с последующей деструкцией стафилококков, отделением культуральной жидкости, детоксикацией ее формалином, сорбцией целевого продукта на гидроокиси алюминия и его стерилизацией автоклавированием (Патент РФ N 1706631, МКИ⁶ A 61 K 39/085. Способ получения анатоксин-вакцины против стафилококкоза птиц. Бюл. N 3, 1992). В известном способе деструкцию проводят нагреванием микробных клеток до 85-100^oC в течение 1,0-1,5 часов, к культуральной жидкости добавляют формалин одномоментно из расчета 0,6-0,8% формалина в конечной концентрации при экспозиции 45-55^oC в течение 7-10 дней.

Недостатком известного способа является получение анатоксин-вакцины плохого качества (содержание в ней токсина возрастает через короткое время хранения).

Целью предлагаемого изобретения является увеличение сроков хранения целевого продукта.

Поставленная цель достигается в способе получения стафилококковой анатоксин-вакцины путем выращивания стафилококков с последующей их деструкцией, детоксикацией смеси формалином, сорбцией целевого продукта на гидроокиси алюминия и его стерилизацией автоклавированием тем, что формалин добавляют в начале до концентрации его в смеси 0,3-0,4% и инкубацией при температуре 37-40^oC в течение 7-10 суток, а затем - до конечной концентрации формалина в смеси 0,5-0,6% с последующей инкубацией при температуре 44-46^oC в течение 5-8 суток.

Поставленная цель достигается также тем, что деструкцию стафилококков проводят гамма-облучением Co⁶⁰ дозой 1,0-2,0•10⁶R.

В патентной и научно-технической литературе неизвестны технические решения, аналогичные заявляемому, что позволяет сделать вывод о соответствии предложения условию патентоспособности - "новизна".

Только сочетание заявленных режимов в определенной последовательности позволяет достичь эффекта, указанного в цели изобретения, т.е. заявленный способ удовлетворяет условию патентоспособности - "изобретательский уровень", в частности, проведение добавления формалина в два этапа при определенных соотношениях компонентов позволило получить неочевидный положительный эффект. Нами впервые установлено, что в течение первого этапа добавления формалина при низких его концентрациях происходит взаимодействие свободных аминогрупп, и в первую очередь лизина. При этом образуются метилоламинные группы. На втором этапе в реакции участвуют активные радикалы циклических аминогрупп, содержащие фенольные, гуанидиновые и индольные группы - это тирозин, аргинин, гистидин и триптофан. Эти группы прочно соединяются за счет активных атомов водорода с метилоламинными группами остатков лизина через метиленовые мостики. При этом блокирование формалином активных радикалов токсина приводит к его более качественной детоксикации (обезвреживанию) и образованию полимеров. Следовательно, добавление формалина в два этапа приводит к двум процессам: собственно к детоксикации токсина и стабилизации образовавшегося полимера, которая достигается внесением новой порции формалина и повышением температуры реакционной смеси. Обратное превращение анатоксина в токсин в условиях предлагаемого способа исключено.

Способ используют для получения стафилококковой анатоксин-вакцины, используемой для профилактики стафилококкоза птиц, плотоядных, а также для профилактики и лечения маститов, пневмоний, ускорения заживления ран, иммуностимуляции и неспецифической профилактики ринотрахеита и парагриппа-3 крупного рогатого скота, поэтому заявленное предложение соответствует условию патентоспособности - "промышленная применимость".

Предлагаемое изобретение иллюстрируется на следующих примерах.

Пример 1. Стафилококки выращивают, как и в известном способе, на питательной среде в течение 10 дней. Затем проводят автоклавирование при 1,0 атм в течение 30 минут. Детоксикацию проводят добавлением к суспензии стафилококков формалина в два этапа: до концентрации его в смеси 0,3% и инкубацией при температуре 37^oC в течение 7 суток с последующим добавлением формалина до его конечной концентрации 0,5% и инкубацией смеси при температуре 44^oC в течение 5 суток. По завершении процесса детоксикации к суспензии стафилококков добавляют, как и в известном способе, гидроокись алюминия в конечной концентрации 1 мг/мл и расфасовывают по флаконам, закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, подвергают автоклавированию при 0,6 атм в течение 20 минут.

Пример 2. Стафилококки выращивают, как и в известном способе, на питательной среде в течение 15 дней. Затем проводят гамма-облучение Co⁶⁰ силой 1,0•10⁶R. Детоксикацию проводят добавлением к суспензии стафилококков формалина в два этапа: до концентрации его в смеси 0,4% и инкубацией при температуре 40^oC в течение 10 суток с последующим добавлением формалина до его конечной концентрации 0,6% и инкубацией смеси при температуре 46^oC в течение 8 суток. По завершении процесса детоксикации к суспензии стафилококков добавляют, как и в известном способе, гидроокись алюминия в конечной концентрации 1 мг/мл и расфасовывают по флаконам, закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, подвергают автоклавированию при 0,6 атм в течение 20 минут.

Пример 3. Стафилококки выращивают, как и в известном способе, на питательной среде в течение 10 дней. Затем проводят гамма-облучение Co⁶⁰ силой 2,0•10⁶R. Детоксикацию проводят добавлением к суспензии стафилококков формалина в два этапа: до концентрации его в смеси 0,3% и инкубацией при температуре 37^oC в течение 7 суток с последующим добавлением формалина до его конечной концентрации 0,5% и инкубацией смеси при температуре 44^oC в течение 5 суток. По завершении процесса детоксикации к суспензии стафилококков добавляют, как и в известном способе, гидроокись алюминия в конечной концентрации 1 мг/мл и расфасовывают по флаконам, закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, подвергают автоклавированию при 0,6 атм в течение 20 минут.

Пример 4. Стафилококки выращивают, как и в известном способе на питательной среде в течение 15 дней. Затем проводят автоклавирование при 1,0 атм в течение 20 минут. Детоксикацию проводят добавлением к суспензии стафилококков формалина в два этапа: до концентрации его в смеси 0,4% и инкубацией при температуре 40^oC в течение 10 суток с последующим добавлением формалина до его конечной концентрации 0,6% и инкубацией смеси при температуре 46^oC в течение 8 суток. По завершении процесса детоксикации к суспензии стафилококков добавляют, как и в известном способе, гидроокись алюминия в конечной концентрации 1 мг/мл и расфасовывают по флаконам, закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, подвергают автоклавированию при 0,6 атм в течение 20 минут.

Предлагаемый способ позволяет увеличить сроки хранения целевого продукта с 6 месяцев до 3-5 лет, т.е. в 5-10 раз.

Изобретение предназначено для получения препарата для профилактики и лечения стафилококковых инфекций, обладающего иммуностимулирующим действием. Стафилококки выращивают в течение 10 дней. Далее осуществляют деструкцию стафилококков автоклавированием при 1,0 атм в течение 30 мин. Проводят детоксикацию добавлением к суспензии стафилококков формалина в два этапа. Формалин добавляют в начале до концентрации его в смеси 0,3-0,4% и инкубируют при температуре 37-40°С в течение 7-10 сут. Затем - до конечной концентрации 0,5-0,6% и инкубацией при температуре 44-46°С в течение 5-8 сут. Деструкцию стафилококков можно проводить гамма-облучением Со⁶⁰ дозой 1,0-2,0•10⁶R. Далее целевой продукт сорбируют на гидроокиси алюминия и стерилизуют автоклавированием. Изобретение повышает срок хранения и стабилизацию целевого продукта. 1 з.п.ф-лы.

1. Способ получения стафилококковой анатоксин-вакцины путем выращивания стафилококков с последующей их деструкцией, детоксикацией смеси формалином, сорбцией целевого продукта на гидроокиси алюминия и его стерилизацией автоклавированием, отличающийся тем, что формалин добавляют в начале до концентрации его в смеси 0,3 - 0,4% с инкубацией при температуре 37 - 40^oС в течение 7 - 10 сут, а затем - до конечной концентрации формалина в смеси 0,5 - 0,6% с последующей инкубацией при температуре 44 - 46^oС в течение 5 - 8 сут. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что деструкцию стафилококков проводят гамма-облучением Co⁶⁰ дозой 1,0 - 2,0 • 10⁶ R.