СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗНОГО АНАТОКСИНА Российский патент 2004 года по МПК A61K39/04 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к ветеринарии, и может быть использовано в технологии получения биологических препаратов для специфической профилактики инфекционных заболеваний животных.

Известен способ получения туберкулезного анатоксина путем выращивания микобактерий туберкулеза с последующей их деструкцией, отделением культуральной жидкости, добавлением к ней формалина, сорбцией целевого продукта на гидроокиси алюминия и его стерилизацией автоклавированием (Патент РФ № 2053791, МКИ⁶ А 61 К 39/04. Способ получения анатоксина. Бюл. № 4, 1996). В известном способе к культуральной жидкости добавляют формалин одномоментно из расчета 1 мг на 1 мл анатоксина.

Недостатком известного способа является получение туберкулезного анатоксина плохого качества (содержание в нем высокой концентрации токсина и формалина - токсических для организма веществ) с небольшим сроком хранения.

Известен также способ получения туберкулезного анатоксина путем выращивания с последующей деструкцией микобактерий туберкулеза, отделением культуральной жидкости, добавлением к ней формалина, сорбцией целевого продукта на гидроокиси алюминия и его стерилизацией автоклавированием, причем формалин добавляют в начале до концентрации его в смеси 0,3-0,4% и инкубацией при температуре 37-40°С в течение 7-10 суток, а затем - до конечной концентрации формалина в смеси 0,5-0,6% с последующей инкубацией при температуре 44-46°С в течение 5-8 суток, а деструкцию микобактерий туберкулеза проводят гамма облучением Со⁶⁰ дозой 1,0-2,0×10⁶R (патент РФ № 2139090, МКИ А 61 К 39/04. Бюл. 28, 1999). В известном способе к культуральной жидкости добавляют формалин двукратно.

Однако в результате использования известного способа получают туберкулезный анатоксин недостаточно высокого качества.

Целью предлагаемого изобретения является увеличение качества целевого продукта.

Поставленная цель достигается в способе получения туберкулезного анатоксина путем выращивания с последующей деструкцией микобактерий туберкулеза, отделением культуральной жидкости, детоксикации ее формалином, сорбцией целевого продукта на гидроокиси алюминия и его стерилизации автоклавированием тем, что формалин к культуральной жидкости добавляют трехкратно с интервалом 5-9 суток в конечной концентрации 0,2-0,25%, 0,3-0,4% и 0,5-0,6% соответственно, причем при первом добавлении формалина температура реакционной среды поддерживается в интервале 40-42°С, втором - 43-45°С, третьем - 46-47°С.

В патентной и научно-технической литературе неизвестны технические решения, аналогичные заявляемому, что позволяет сделать вывод о соответствии предложения условию патентоспособности - “новизна”.

Только сочетание заявленных режимов в определенной последовательности позволяет достичь эффект, указанный в цели изобретения, т.е. заявленный способ удовлетворяет условию патентоспособности - “изобретательский уровень”, в частности проведение добавления формалина в три этапа при определенных соотношениях компонентов и при определенной температуре реакционной среды позволило получить неочевидный положительный эффект. Нами впервые установлено, что в течение первого этапа добавления формалина при низких его концентрациях происходит взаимодействие свободных аминогрупп и в первую очередь лизина. При этом образуются метилоламинные группы. На втором этапе в реакции участвуют активные радикалы циклических аминогрупп, содержащие фенольные, гуанидиновые и индольные группы - это тирозин, аргинин, гистидин и триптофан. Эти группы прочно соединяются за счет активных атомов водорода с метилоламинными группами остатков лизина через метиленовые мостики. При этом блокирование формалином активных радикалов токсина приводит к его детоксикации (обезвреживанию) и образованию полимеров. Добавление формалина на третьем этапе приводит к необратимой стабилизации анатоксина и исключает реверсию токсикоаллергенов.

Способ используют для получения биологических препаратов специфической профилактики инфекционных заболеваний животных, поэтому заявленное предложение соответствует условию патентоспособности - “промышленная применимость”.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется на следующих примерах.

Пример 1. Микобактерии туберкулеза выращивают, как и в известном способе на питательной среде в течение 60 дней. Затем проводят автоклавирование при 1,0 атм в течение 120 минут, а отделение культуральной жидкости проводят фильтрованием. Детоксикацию проводят добавлением к культуральной жидкости формалина в три этапа: а) до концентрации его в смеси 0,2% и инкубацией при температуре 40°С в течение 5 суток; б) далее формалин добавляют к реакционной смеси до конечной концентрации 0,3% и инкубации при температуре 43°С в течение 5 суток; в) и, в заключении, формалин добавляют до его конечной концентрации 0,5% и инкубацией смеси при температуре 46°С в течение 5 суток. По завершении процесса детоксикации к культуральной жидкости добавляют, как и в известном способе, гидроокись алюминия в конечной концентрации 1 мг/мл.

Через 12 часов после отстоя надосадочную жидкость удаляют (50% объема всей жидкости), а оставшийся осадок (целевой продукт) расфасовывают по флаконам, закрывают резиновьми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками и повторно подвергают автоклавированию при 0,6 атм в течение 20 минут.

Пример 2. Микобактерии туберкулеза выращивают, как и в известном способе на питательной среде в течение 55 дней. Затем проводят гамма-облучение Со⁶⁰ дозой 1,0×10⁶R. Отделение культуральной жидкости проводят фильтрованием. Детоксикацию проводят добавлением к культуральной жидкости формалина в три этапа: а) до концентрации его в смеси 0,25% и инкубацией при температуре 42°С в течение 9 суток; б) далее формалин добавляют к реакционной смеси до конечной концентрации 0,4% и инкубации при температуре 45°С в течение 9 суток; в) и, в заключении, формалин добавляют до его конечной концентрации 0,6% и инкубацией смеси при температуре 47°С в течение 9 суток. По завершении процесса детоксикации к культуральной жидкости добавляют, как и в известном способе, гидроокись алюминия в конечной концентрации 1 мг/мл.

Сразу после центрифугирования надосадочную жидкость удаляют (50% объема всей жидкости), а оставшийся осадок (целевой продукт) расфасовывают по флаконам, закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, подвергают автоклавированию при 0,6 атм в течение 20 минут.

Пример 3. Микобактерии туберкулеза выращивают, как и в известном способе на питательной среде в течение 60 дней. Затем микобактерии разбивают на ультразвуковом дезинтеграторе при длине волны 4 мкм и экспозиции 30 минут, а отделение культуральной жидкости проводят фильтрованием. Детоксикацию проводят добавлением к культуральной жидкости формалина в три этапа: а) до концентрации его в смеси 0,225% и инкубацией при температуре 41°С в течение 7 суток; б) далее формалин добавляют к реакционной смеси до конечной концентрации 0,35% и инкубацией при температуре 44°С в течение 7 суток; в) и, в заключении, формалин добавляют до его конечной концентрации 0,55% и инкубацией смеси при температуре 46,5°С в течение 7 суток. По завершении процесса детоксикации к культуральной жидкости добавляют, как и в известном способе, гидроокись алюминия в конечной концентрации 1 мг/мл.

Через 12 часов после отстоя надосадочную жидкость удаляют (50% объема всей жидкости), а оставшийся осадок (целевой продукт) расфасовывают по флаконам, закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, подвергают автоклавированию при 0,6 атм в течение 20 минут.

Протективные свойства туберкулезного анатоксина, полученного согласно примерам 1-3, были испытаны на морских свинках. Схемой проведения опытов предусматривалось одно - двукратная иммунизация морских свинок вакциной БЦЖ и туберкулезным анатоксином (полученного согласно примерам 1-3) с последующим их заражением суспензией микобактерий туберкулеза штамма Валле в дозе 0,00001 мг/мл из расчета на одно животное. Полученные туберкулезный анатоксин вводили морским свинкам в область внутренней поверхности бедра животного. Результаты испытаний представлены в таблице.

Предлагаемый способ позволяет увеличить качество целевого продукта за счет повышения протективных свойств целевого продукта, в частности исключается заболевание туберкулезом у животных, иммунизированных туберкулезным анатоксином, полученным согласно заявляемому способу.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии. Выращивают с последующей деструкцией микобактерии туберкулеза. Отделяют культуральную жидкость, добавляют к ней формалин. Сорбируют целевой продукт на гидроокиси алюминия и стерилизуют его автоклавированием. Формалин к культуральной жидкости добавляют трехкратно с интервалом 5-9 суток в конечной концентрации 0,2-0,25, 0,3-0,4 и 0,5-0,6% соответственно, причем при первом добавлении формалина температуру реакционной среды поддерживают в интервале 40-42°С, втором - 43-45°С, третьем - 46-47°С. Способ позволяет повысить активность целевого продукта. 1 табл.

Способ получения туберкулезного анатоксина путем выращивания с последующей деструкцией микобактерий туберкулеза, отделением культуральной жидкости, детоксикации ее формалином, сорбцией целевого продукта на гидроокиси алюминия и его стерилизации автоклавированием, отличающийся тем, что формалин к культуральной жидкости добавляют трехкратно с интервалом 5-9 суток в конечной концентрации 0,2-0,25%, 0,3-0,4% и 0,5-0,6% соответственно, причем при первом добавлении формалина температура реакционной среды поддерживается в интервале 40-42°С, втором - 43-45°С, третьем - 46-47°С.