СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗНОГО АНАТОКСИНА Российский патент 1999 года по МПК A61K39/04 C12N1/06 C12N13/00 C12N1/06 C12R1/32 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к ветеринарии, и может быть использовано в технологии получения биологических препаратов для специфической профилактики инфекционных заболеваний животных.

Известен способ получения туберкулезного анатоксина путем выращивания микобактерий туберкулеза с последующей их деструкцией, отделением культуральной жидкости, добавлением к ней формалина, сорбцией целевого продукта на гидроокиси алюминия и его стерилизацией автоклавированием. (Патент РФ N 2053791, МКИ⁶ A 61 K 39/04. Способ получения анатоксина, БИ N 4, 1996). В известном способе к культуральной жидкости добавляют формалин одномоментно из расчета 1 мг на 1 мл анатоксина.

Недостатком известного способа является получение туберкулезного анатоксина плохого качества (содержание в нем высокой концентрации токсина и формалина - токсических для организма веществ) с небольшим сроком хранения.

Целью предлагаемого изобретения является увеличение сроков хранения целевого продукта.

Поставленная цель достигается в способе получения туберкулезного анатоксина путем выращивания микобактерий туберкулеза с последующей их деструкцией, отделением культуральной жидкости, добавлением к ней формалина, сорбцией целевого продукта на гидроокиси алюминия и стерилизацией автоклавированием тем, что формалин добавляют вначале до концентрации его в смеси 0,3-0,4% и инкубацией при температуре (37-40^oC в течение 7-10 суток, а затем до конечной концентрации формалина в смеси 0,5-0,6% с последующей инкубацией при 44-46^oC в течение 5-8 суток.

Поставленная цель достигается также тем, что деструкцию микобактерий туберкулеза проводят гамма облучением Co⁶⁰ дозой (1-2)•10⁶R.

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, аналогичные заявляемому, что позволяет сделать вывод о соответствии предложения условию патентоспособности - "новизна".

Только сочетание заявленных режимов в определенной последовательности позволяет достичь эффект, указанный в цели изобретения, т.е. заявленный способ удовлетворяет условию патентоспособности - "изобретательский уровень", в частности, проведение добавления формалина в два этапа при определенных соотношениях компонентов позволило получить неочевидный положительный эффект. Нами впервые установлено, что в течение первого этапа добавления формалина при низких его концентрациях происходит взаимодействие свободных аминогрупп и в первую очередь лизина. При этом образуются метилоламинные группы. На втором этапе в реакции участвуют активные радикалы циклических аминогрупп, содержащие фенольные, гуанидиновые и индольные группы - это тирозин, аргинин, гистидин и триптофан. Эти группы прочно соединяются за счет активных атомов водорода с метилоламинными группами остатков лизина через метиленовые мостики. При этом блокирование формалином активных радикалов токсина приводит к его детоксикации (обезвреживанию) и образованию полимеров. Следовательно, добавление формалина в два этапа приводит к двум процессам: собственно к детоксикации токсина и стабилизации образовавшегося полимера, которая достигается внесением новой порции формалина и повышением температуры реакционной смеси. Обратное превращение анатоксина в токсин в условиях предлагаемого способа исключено.

Способ используют для получения биологических препаратов специфической профилактики инфекционных заболеваний животных, поэтому заявленное предложение соответствует условию патентоспособности - "промышленная применимость".

Предлагаемое изобретение иллюстрируется на следующих примерах.

Пример 1. Микобактерии туберкулеза выращивают, как и в известном способе, на питательной среде в течение 60 дней. Затем проводят автоклавирование при 1,0 атм в течение 120 минут, а отделение культуральной жидкости проводят фильтрованием. Детоксикацию проводят добавлением к культуральной жидкости формалина в два этапа: до концентрации его в смеси 0,3% и инкубацией при 37^oC в течение 7 суток с последующим добавлением формалина до его конечной концентрации 0,5% и инкубацией смеси при 44^oC в течение 5 суток. По завершении процесса детоксикации к культуральной жидкости добавляют, как и в известном способе, гидроокись алюминия в конечной концентрации 1 мг/мл.

Через 12 часов после отстоя надосадочную жидкость удаляют (50% объема всей жидкости), а оставшийся осадок (целевой продукт) расфасовывают по флаконам, закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками и повторно подвергают автоклавированию при 0,6 атм в течение 20 минут.

Пример 2. Микобактерии туберкулеза выращивают, как и в известном способе, на питательной среде в течение 55 дней. Затем проводят гамма облучение Co⁶⁰ 1•10⁶R. Отделение культуральной жидкости проводят фильтрованием. Детоксикацию проводят добавлением к культуральной жидкости формалина в два этапа: вначале до концентрации его в смеси 0,4% и инкубацией при температуре 40^oC в течение 10 суток с последующим добавлением формалина до его конечной концентрации 0,6% и инкубацией смеси при 46^oC в течение 8 суток. По завершении процесса детоксикации к культуральной жидкости добавляют, как и в известном способе, гидроокись алюминия в конечной концентрации 1 мг/мл.

Сразу после центрифугирования надосадочную жидкость удаляют (50% объема всей жидкости), а оставшийся осадок (целевой продукт) расфасовывают по флаконам, закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, подвергают автоклавированию при 0,6 атм в течение 20 минут.

Пример 3. Микобактерии туберкулеза выращивают, как и в известном способе, на питательной среде в течение 60 дней. Затем проводят гамма облучение Co⁶⁰ дозой 2•10⁶R. Отделение культуральной жидкости проводят фильтрованием. Детоксикацию проводят добавлением к культуральной жидкости формалина в два этапа: до концентрации его в смеси 0,3% и инкубацией при 37^oC в течение 7 суток с последующим добавлением формалина до его конечной концентрации 0,5% и инкубацией смеси при 44^oC в течение 5 суток. По завершении процесса детоксикации к культуральной жидкости добавляют, как и в известном способе, гидроокись алюминия в конечной концентрации 1 мг/мл.

Через 12 часов после отстоя надосадочную жидкость удаляют (50% объема всей жидкости), а оставшийся осадок (целевой продукт) расфасовывают по флаконам, закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, подвергают автоклавированию при 0,6 атм в течение 20 минут.

Пример 4. Микобактерии туберкулеза выращивают, как и в известном способе, на питательной среде в течение 55 дней. Затем проводят автоклавирование при 1,0 атм в течение 180 минут, а отделение культуральной жидкости проводят фильтрованием. Детоксикацию проводят добавлением к культуральной жидкости формалина в два этапа: до концентрации его в смеси 0,4% и инкубацией при 40^oC в течение 10 суток с последующим добавлением формалина до его конечной концентрации 0,6% и инкубацией смеси при 46^oC в течение 8 суток. По завершении процесса детоксикации к культуральной жидкости добавляют, как и в известном способе, гидроокись алюминия в конечной концентрации 1 мг/мл.

Сразу после центрифугирования надосадочную жидкость удаляют (50% объема всей жидкости), а оставшийся осадок (целевой продукт) расфасовывают по флаконам, закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, подвергают автоклавированию при 0,6 атм в течение 20 минут.

Предлагаемый способ позволяет увеличить сроки хранения целевого продукта с 6 месяцев до 3-5 лет, т.е. в 5-10 раз.

Изобретение предназначено для специфической профилактики инфекционных заболеваний животных. Выращивают микобактерии туберкулеза и подвергают их деструкции. Отделяют культуральную жидкость. Добавляют к ней формалин в два этапа: вначале до концентрации его в смеси 0,3-0,4% и инкубацией при 37-40°С в течение 7-10 суток, затем до конечной концентрации формалина в смеси 0,5-0,6% и инкубацией при 44-46°С в течение 5-8 суток. Деструкцию микобактерий туберкулеза можно проводить гамма облучением Co⁶⁰ дозой (1-2)•10⁶R. По завершении процесса детоксикации к культуральной жидкости добавляют гидроокись алюминия. В качестве целевого продукта используют осадок, образовавшийся после центрифугирования или отстоя. Его расфасовывают и подвергают автоклавированию. Изобретение позволяет увеличить сроки хранения анатоксина до 3-5 лет. 1 з.п.ф-лы.

1. Способ получения туберкулезного анатоксина путем выращивания с последующей деструкцией микобактерий туберкулеза, отделением культуральной жидкости, добавлением к ней формалина, сорбцией целевого продукта на гидроокиси алюминия и его стерилизацией автоклавированием, отличающийся тем, что формалин добавляют в начале до концентрации его в смеси 0,3 - 0,4% с инкубацией при 37 - 40^oС в течение 7 - 10 суток, а затем до конечной концентрации формалина в смеси 0,5 - 0,6% с последующей инкубацией при 44 - 46^oС в течение 5 - 8 суток. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что деструкцию микобактерий туберкулеза проводят гамма-облучением Co⁶⁰ дозой (1 - 2) • 10⁶R.