ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ E.COLI 0157:H7 Российский патент 2000 года по МПК C12N1/20 C12Q1/10 C12N1/20 C12R1/19 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, и может быть использовано при бактериологическом исследовании различных клинических материалов и объектов внешней среды.

В последние годы отмечаются вспышки эшерихиозов, вызванных высокопатогенным для человека штаммом E.Coli O157:Н7, который является возбудителем не только диарей, но и геморрагических колитов, гемолитического уремического синдрома и тромботической тромбоцитопенической пурпуры (1).

В Японии в 1996 г. во время вспышек и спорадических случаев пострадало 9000 человек, 11-со смертельным исходом. Особенно опасна эта инфекция для детей, т.к. нарушает работу почек вплоть до летального исхода (2).

Для диагностики заболевания, вызываемого вышеназванным микроорганизмом, необходимо выделение его в чистой культуре и последующая его идентификация.

Известно использование для этих целей питательных сред Макконки-сорбитол агара и агара Жабо (3). Недостатком этих сред является необходимость введения в их состав дорогостоящих ингредиентов: желчных солей, метилумбеллиферил-бета-Д-глюкуронида (МИГ) и цефиксим-теллуритовой добавки, благодаря которым достигается селективность сред. Наиболее близким решением задачи того же назначения к заявляемому изобретению по совокупности признаков является сорбитол E. coli O157:Н7 агар (4), содержащий в качестве азотистого питания панкреатический гидролизат рыбной муки, экстракт пекарных дрожжей, натрия хлорид, Д-сорбит, натрия сульфит, натрия гидрофосфат, фуксин основной, агар.

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании известной среды, принятой за прототип, является то, что сорбитол E.coli О157:Н7 агар является слабо селективной средой, не подавляет ползучий рост (роение) протеев и в случае наличия их в исследуемом материале невозможно выделить искомый микроб - возбудитель в чистой культуре. Недостатком среды является также многокомпонентность состава и светочувствительность, вследствие чего она не подлежит хранению.

Задача предлагаемого изобретения - повышение селективных свойств среды и упрощение ее состава.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что предлагаемая среда содержит в качестве источника азотистого питания электролит дефицитную питательную основу с содержанием хлористого натрия 0,4-1,2%, в качестве ингибитора роста грамположительных микроорганизмов - кристаллический фиолетовый, в качестве индикатора кислотообразования - бромкрезоловый пурпуровый или бромтимоловый синий при следующем соотношении компонентов, г/л:
Электролитдефицитная питательная основа с содержанием хлористого натрия 0,4-1,2% - 20,0-28,0
Д-сорбит - - 10,0-20,0
Кристаллический фиолетовый - 0,001-0,002
Бромкрезоловый пурпуровый или бромтимоловый синий - 0,03-0,05
Вода дистиллированная - остальное
Готовая среда содержит 0,008-0,034% хлористого натрия, что позволяет рассматривать ее как электролитдефицитную.

Дефицит солей в среде ингибирует образование у протеев жгутиков, что способствует росту этих микроорганизмов в виде изолированных колоний, тем самым создается возможность выделения E.coli O157:Н7 в чистой культуре. Содержание в среде кристаллического фиолетового подавляет рост грамположительных микроорганизмов, а бромкрезоловый пурпуровый или бромтимоловый синий позволяет провести предварительную идентификацию микроорганизмов по тесту расщепления сорбита: сорбитоположительные штаммы образуют колонии желтого цвета (E.coli O55:К59, S.typhimurium), сорбитоотрицательные - бесцветные (E. coli O157:Н7, Pr.mirabilis, Pr.vilgaris, Sh.flexneri).

Среду получают следующим образом.

Пример 1. К 10 кг белкового сырья (фарш рыбы) добавляют 20 л водопроводной воды, смесь перемешивают в течение 10-15 мин, нагревают до 48-50^oC, вносят 1,1 кг фарша поджелудочной железы крупного рогатого скота или 0,3 кг панкреатина и ведут гидролиз в течение 5-6 часов до содержания аминного азота 0,5-0,6%. По окончании гидролиза смесь кипятят 10-15 мин и фильтруют. Фильтрат подщелачивают водным раствором аммиака до рН 8,2-8,5, кипятят 10-15 мин и фильтруют. Фильтрат упаривают до 50-60% сухих веществ, нагревают до 48-50^oC и вносят в него агар из расчета: на 100 г упаренного гидролизата 35-40 г агара.

Смесь перемешивают, гранулируют и высушивают при 50-60^oC до остаточной влаги не более 7% и измельчают до порошкообразного состояния.

Полученную сухую электролитдефицитную питательную основу, содержащую 0,4-1,2 % хлористого натрия, в количестве 20 г растворяют в 1 л дистиллированной воды, далее последовательно растворяют 10,0 г Д-сорбита, 0,03 г бромкрезолового пурпурного или бромтимолового синего и 0,001 г кристаллического фиолетового. Смесь нагревают до полного расплавления агара, стерилизуют 15 мин при 121^oC и разливают в стерильные чашки Петри, предварительно охладив среду до 45-50^oC, чашки со средой подсушивают в термостате при 37±1^oC в течение 90-120 мин. Контроль качества среды осуществляют путем посева тест-штаммов E. coli O157:H7 N 214 и наиболее вероятных ассоциантов - Pr.mirabilis, Pr.Vulgaris Нх19, Sh.flexneri la 8516, S.typhimurium, E.coli N 3912/41 (O55: K59), St.aureus N 209 "P".

Учет результатов производят через 18-20 ч инкубации посевов при 37^oC.

Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что в 1 литре воды растворяют 24 г питательной основы, 15 г Д-сорбита, 0,04 г бромкрезолового пурпурового или бромтимолового синего 0,0015 г кристаллического фиолетового. Далее согласно примеру 1.

Пример 3. Отличается от примеров 1,2 тем, что в 1 л воды растворяют 28 г питательной основы, 20 г Д-сорбита, 0,05 г бромкрезолового пурпурного или бромтимолового синего, 0,002 г кристаллического фиолетового. Далее согласно примеру 1.

Результаты бактериологического контроля предлагаемой и известной среды представлены в таблице.

Из таблицы видно, что предлагаемая среда имеет преимущество, так как она подавляет роение протеев, которые растут в виде изолированных О-форм колоний, что позволяет выделить E.coli O157:Н7 в чистой культуре, тем самым повышается эффективность диагностики при бактериологических исследованиях.

Известная среда не подавляет роение протеев, которые образуют по всей поверхности чашки вуалеобразный налет (Н-форма), что затрудняет выделение штамма E.coli O157:Н7 в чистой культуре.

Предлагаемая среда малокомпонентна, содержит 4 ингредиента, известная среда - 8. Кроме того, предлагаемая среда не содержит светочувствительных ингредиентов (сульфит натрия - фото, фуксин), вследствие чего не требует специальных условий хранения.

Предлагаемая среда экономически выгодна, проста в приготовлении, не требует дополнительных затрат. Использование ее в практике здравоохранения будет способствовать улучшению диагностики заболевания, вызываемого патогенным штаммом E.coli O157:Н7.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ДАННЫЕ
1. Easfon Lorrise, Escherichia coli O157: Oceurrence, transmission and laboratory defection, Brit. Y.Biomed. Sce, 1997, 54, N 1 -P.57-64.

2. Shinoda Sumio, Yamamoto Shigeo, Tomochila Kenichi, Migoschi Shin-iche. Jap.J.Toxical and Enriron. Health, 1997,43, N 1 -P. 1-14.

3. Среды бактериологические сухие. Бактериологические тест-сыворотки и тест-антигены, краски. Каталог N 2, фирма "Гем", ноябрь, 1997 г. Москва, с. 21,39.

4. Бактериологические среды для санитарной и клинической микробиологии, биотехнологии и контроля лекарственных средств. Каталог, изд. Третье, исправленное - Оболенск, 1998, С.21-22.

Изобретение предназначено для бактериологического исследования различных клинических материалов и объектов внешней среды. Среда малокомпонентна, содержит четыре ингредиента, не светочувствительна. В качестве источника азотистого питания микробов она содержит электролитдефицитную питательную основу с содержанием хлористого натрия 0,4-1,2%, в качестве ингибитора грамположительных микроорганизмов - кристаллический фиолетовый, в качестве индикатора кислотообразования - бромкрезоловый пурпуровый или бромтимоловый синий. Среда подавляет роение протеев, которые растут в виде изолированных колоний. Это позволяет выделить Е.coli O157:Н7 в чистой культуре. Изобретение повышает селективные свойства среды и упрощает ее состав. 1 табл.

Питательная среда для выделения и идентификации E.coli 0157:H7, содержащая источник азотистого питания, Д-сорбит, ингибитор грамположительной микрофлоры, индикатор кислотообразования, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве источника азотистого питания она содержит электролитдефицитную питательную основу из рыбы с содержанием хлористого натрия 0,4 - 1,2%, в качестве ингибитора грамположительных микроорганизмов кристаллический фиолетовый, в качестве индикатора кислотообразования бромкрезоловый пурпуровый или бромтимоловый синий при следующем соотношении компонентов, г/л:
Электролитдефицитная питательная основа из рыбы с содержанием хлористого натрия 0,4 - 1,2% - 20,0 - 28,0
Д-сорбит - 10,0 - 20,0
Кристаллический фиолетовый - 0,001 - 0,002
Бромкрезоловый пурпуровый или бромтимоловый синий - 0,03 - 0,05
Вода дистиллированная - Остальное