СПОСОБ ФОРМИРОВАНИЯ СРЕД С ЗАДАННЫМ ПРОФИЛЕМ PH Российский патент 1999 года по МПК G01N27/26 

Изобретение относится к области анализа биополимеров с помощью электрофореза и других родственных методов (электрохроматография, ионообменная хроматография) и предназначено для создания специальных сред с определенным профилем pH или так называемым pH-градиентом (pH или водородный показатель: pH= -lg[H⁺], где [H⁺] - концентрация ионов водорода), и может применяться, в частности, для изоэлектрического фокусирования и зонального электрофореза в градиенте pH.

Известны различные способы получения pH-градиентов, основанные на создании в жидкой фазе необходимого концентрационного распределения веществ, обладающих кислотными и/или основными свойствами, наиболее важным из которых в практическом отношении является метод естественных или самоорганизующихся pH-градиентов [Svensson Н. , Acta. Chem. Scand., 15 (1961); Svensson H., Acta. Chem. Scand., 16 (1962), 456-466]. Недостатком всех этих способов является то, что распределения концентраций для веществ, формирующих pH-градиент, в той или иной степени подвержены деформациям, как вследствие продолжительного действия электрического поля, так и под действием самих веществ, подвергающихся разделению, что является препятствием в достижении высокой разрешающей способности.

Техническим решением, наиболее близким к предлагаемому изобретению, является способ получения pH-градиентов, в соответствии с которым вещества, несущие электрически заряженные группы, ковалентно пришиваются к неподвижной матрице, образуя тем самым пространственно неподвижное распределение pH, неизменное при приложении электрического поля - так называемые "иммобилизованные pH-градиенты" [G 01 N 26/27, 204/180G: Rozentgren A., et. al. US patent No 4130470, December 19, 1978]. Использование "иммобилизованных" pH-градиентов, приводит к некоторому повышению разрешающей способности метода изоэлектрического фокусирования по сравнению с "естественными", образованными при помощи набора амфотерных веществ (так называемых амфолитов-носителей).

Принципиальное ограничение в достижении высокой разрешающей способности для рассматриваемого способа заключается в методе создания концентрационного распределения веществ, задающих форму pH-градиента и подвергающихся в дальнейшем иммобилизации. Согласно данному способу применяется технология наполнения вертикально стоящей формы с использованием градиента концентрации (как правило, линейного) вспомогательного вещества повышенной плотности, создаваемого посредством обычного двухкамерного градиентного смесителя. Данный способ обеспечивает теоретически создание градиента любой протяженности и достаточно близкого к линейному (что осуществляется путем выбора концентраций электролитов в каждой из камер смесителя). Между тем, в процессе смешивания двух растворов оказывается невозможным полностью избежать ряда негативных эффектов (образование турбулентных течений непосредственно в зоне текущего формирования градиента, нестабильностей в работе системе подачи растворов), существенно искажающих получающийся в конечном итоге профиль pH. В случае плоско-параллельного слоя к непостоянству функции pH в поперечном (горизонтальном) направлении прибавляется существенная немонотонность в направлении градиента концентрации (вертикальном). Все это приводит к значительному уширению зон разделяемых веществ и является препятствием в достижении высокой разрешающей способности.

Задача, решаемая изобретением, состоит в получении сред, несущих "иммобилизованные pH-градиенты" и обладающих высоким уровнем пространственной стабильности. Технический результат, который может быть достигнут при осуществлении изобретения, - повышение разрешающей способности метода (электрофоретического или хроматографического) за счет сужения зон разделяемых веществ.

Согласно изобретению для получения сред с заданным профилем pH, содержащих иммобилизованные заряды (ковалентное связанные с неподвижной матрицей протолитические группы), дополнительно проводят предварительную стабилизацию концентрационного распределения веществ, образующих pH-градиент, посредством электролиза до момента достижения стационарного (квазистационарного) состояния, после чего производят быструю иммобилизацию полученного в результате электролиза концентрационного распределения.

По завершении стабилизации (в качестве косвенного критерия достижения такого состояния может служить, например, условие стабилизации тока, если электролиз проводится при постоянном напряжении) осуществляют процесс быстрой иммобилизации пространственного распределения веществ-электролитов, а следовательно, и распределения pH.

Механизм иммобилизации может быть как используемым традиционно для этой цели, в котором образование твердой неподвижной фазы (геля) и инкорпорация в нее веществ электролитов происходят одновременно [Rozentgren A., et. al. US patent No 4130470, December 19: LKB-Pharmacia Application Note, Uppsala, Sweden] , так и состоящим в процессе их посадки на готовую поверхность (т.е. уже существующую на момент начала иммобилизации).

Сам процесс иммобилизации осуществляется быстро, и, что также существенно, время между моментом отключения тока и началом иммобилизации также очень мало, чтобы воспрепятствовать нарушению достигнутого концентрационного распределения в результате диффузии. Химическая фиксация инициируется путем фото- или термоинициации, а также за счет скачкообразного возрастания концентраций катализатора и/или инициатора для реакций иммобилизации всех типов молекул электролита, находящихся в растворе.

Предварительная стабилизация электрическим полем обеспечивает формирование монотонного концентрационного распределения вещества-электролита (безразлично, является ли он кислотой (сильной или слабой), основанием (сильным или слабым) или амфотерным веществом. Таким образом, на момент начала процесса иммобилизации имеется стабилизированный абсолютно монотонный градиент pH. В случае использования нескольких электролитов одновременно распределение амфотерного электролита может иметь два участка с различным типом монотонности (со сменой типа монотонности в точке максимума концентрации). В любом случае финальное распределение pH будет монотонным (см, например, Svensson Н., Prot. Biol. Fluids, 15 (1967), 515).

В случае неполной инкорпорации веществ-электролитов в матрицу, а также различной степени инкорпорации для различных компонентов, возможна коррекция необходимых количеств последних на основе экспериментально определенных коэффициентов инкорпорации.

Вещества-электролиты, содержащие протолитические группы и способные инкорпорироваться в матрицу (напр., полиакриламидный гель), в настоящее время производятся в достаточном ассортименте (2-acrylamido-2-methylpropane sulfonic acid; 2-acrylamido glycolic acid: N-acryloyl glycine; 3-acrylamido propanoic acid; 4-acrylamido butyric acid; 2-morpholino etilacrylamid; 3-morpholino propylacrylamid: N.N-dimethylaminoethyl acrylamid; N,N-dimethylaminopropyl acrylamid; N,N-diethylaminoethyl acrylamid.) рядом фирм (Sigma, США; Pharmacia, Швеция и др.).

Рассмотрим некоторые количественные данные для сред, полученных по способу прототипа и по предлагаемому способу: пример N 1 (прототип) - определение степени отклонения профиля концентрации плотности для вспомогательного вещества (бромфеноловый синий) от постоянного в поперечном направлении, произведенное методом определения оптического поглощения, составляет от 5 до 10% от общего перепада концентрации на всей длине в направлении продольном;
пример N 2 (прототип) - определение степени отклонения профиля pH от постоянного в поперечном направлении, произведенное при помощи поверхностного pH-электрода, составляет от 2 до 5% от общей величины градиента;
пример N 3 (предлагаемый способ) - методика, описанная в примере N 2, не выявляет достоверных отклонений pH;
пример N 4 (предлагаемый способ) - аналитическое изоэлектрическое фокусирование препарата для биохимических исследований (Papain, Sigma) в стандартных условиях выявляет дополнительно шесть новых компонентов (метод детекции при помощи CBB-R250), по сравнению со способом-прототипом:
пример N 5 (предлагаемый способ) - аналитическое изоэлектрическое фокусирование препарата (Papain, Sigma) в стандартных условиях выявляет наличие основного компонента при концентрациях внесения по крайней мере в 2-3 раза меньших по сравнению со способом-прототипом.

Последние два примера могут служить в качестве косвенной оценки стабильности градиента в продольном направлении.

За счет предварительной стабилизации электрическим полем концентрационного распределения веществ, формирующих pH-градиент, удается добиться формирования градиента с достаточно малым уровнем отклонения от желаемого pH-профиля, высокой степенью воспроизводимости и, что наиболее существенно, крайне низким уровнем флуктуаций производной pH-функции по координате, в частности, сохранение монотонности имеет место вплоть до существенно более малых расстояний по сравнению с известными способами. Таким образом, указанные действия позволяют достичь повышения разрешающей способности электрофоретических и хроматографических методов при использовании вышеописанных сред.

Предложенный способ может найти широкое применение в здравоохранении (диагностика заболеваний), в фармацевтической промышленности (контроль качества препаратов), в пищевой промышленности, а также для научных и практических задач, связанных с разделением биоорганических веществ, слабо различающихся по своим физико-химическим свойствам (близкие изоэлектрические точки).

Способ используется для аналитического и препаративного разделения биополимеров (белки, нуклеиновые кислоты и др.) путем использования данных сред для проведения различных видов электрофореза и некоторых видов хроматографии (электрохроматография, ионообменная хроматография). Создание и стабилизацию концентрационного распределения веществ, образующих рН-градиент, производят при помощи электрического поля. Предварительная стабилизация электрическим полем позволяет добиться формирования градиента с низким уровнем флуктуаций производной рН-функции по координате. Сохранение монотонности имеет место вплоть до существенно более малых расстояний. Технический результат: обеспечена высокая разрешающая способность.

Способ создания сред с заданным профилем рН, характеризующихся высоким уровнем пространственной стабильности, включающий иммобилизацию веществ, формирующих рН-градиент, отличающийся тем, что создание и стабилизацию их концентрационного распределения производят путем электролиза до момента достижения стационарного или квазистационарного состояния, после чего производят быструю иммобилизацию полученного в результате электролиза концентрационного распределения.