Способ получения иммобилизованного @ Н-градиента для изоэлектрического фокусирования белков Советский патент 1990 года по МПК G01N27/26 

(Л

с

Изобретение относится к получению иммобилизиванного PH-градиента для изоэлектрического фокусирования белков в полиакриламидном геле. Цель изобретения - расширение диапазона PH - градиента и упрощение процесса. Получение ведут путем введения в полимеризуемую смесь содержащую акриловый мономер, инициатор полимерзиации и акриламид [N-этиленсульфоновую кислоту], акриламидотетраэтилентетрамин. Процесс идет в две стадии против восьми. 3 ил.

Изобретение относится к способу , получения иммобилизованного рН-гра- диента для изоэлектрического фокусирования белков, которьй может найти применение в биохимии.

Цель изобретения - повышение надежности получения линейного иммобилизованного рН-градиента широкого диапазона, упрощение и удешевление технологии его получения.

На фиг.1 изображена кривая титрования акриламидопентаэтиленпентамина (1) и акриламидотетраэтилентетрамина (2); на фиг.2 - кривая титрования рН 7.0 иммобилина.

Пример. Формирование иммоби- лизованного рН-градиента в полиакри- ламидном геле, где в качестве буфе- рирующего компонента использован акриламидотетраэтилентетрамин-(АТЭТА):

Н, -б(Ш-СН.-СН,-)Ш

7

буферирующий в широком диапазоне

рН (от 3 до 10)о

Для создания иммобилизованного рН-градиента используют двухкамерный градиентный смеситель, в одну из камер которого вносят раствор конца основного состава, а в другую - раствор конца кислого состава формируемого градиента.

Основной, легкий раствор: 530 мкл смеси акриламида (28,8 вес.%/объем) с бисакриламидом (1,2 вес./объем), 40 мкэкв. АТЭТА, т.е. 2,43 мг, мол.вес 243 и 4 мкэкв. акриламидо- этиленсульфоновой кислоты (АЭСК), т.е. 716 мкт, мол.вес. 179.

СП

со 4 4

о

Добавляют до 3500 мкл воду и 25 мкл 1Q%-Horo N,N, N , N -тетра- v метилэтиДендиамииа (ТЕМЕД), доводят рН до 7,0, добавляют 20 мкл 10%-ного рствора персульфата аммония и довюдят объем раствора до 4000 мкл.

Кислый, тяжелый раствор: 1000 мкл 20%-ного глицерина, 530 мкл смеси акриламида (28,8 вес.%/объем) с биса- 0 криламидом (1,2 вес,%/объем), 40 мкэкв,, АТЕТА т.е. 2,43 мг, и 36 мкэкв. АЭСК т.е. 6,44 мг.

Добавляю т до 3500 мкл воду и„

25 мкл 10%-ного ТЕМЕД, доводят рН до j ляется процесс за счет применения 7,0, добавляют 20 мкл 10%-ного раст- недорогих и доступных исходных ком- вора персульфата аммония и доводят понентов (буферирующего и титранта), объем раствора до 4000 мкл.

Градиент перемешивают в течение 3-8 мин при комнатной температуре, оставляют для уравновеготвания при той же температуре на 15 мин и затем осуществляют полимеризатщю в. термот- стате в темноте при в течение 60 мин. Полученный гель толщиной О,5 мм отмывают от незаполимеризо- вавшихся компонентов сначала в течение 1 ч в 1 л воды, затем еще в течение 1 ч в 1л 1%-ного глицерина и, наконец, сушат при комнатной температуре. Выход геля, установленный экспериментально, составляет практически 100%о Необезврженный гель может храниться при в герметичной упаковке (например, в полиэтиленовом пакете) в течение нескольких недель (не менее 2-3). Высушенный же гель в тех же условиях может храниться в течение нескольких месяцев (не менее 5-6) „

Pf

10 9

8

:7

6

S

3

Перед использованием сухому гелю дают набухнуть в течение 2 ч в ячейке содержащей только воду или при необходимости, воду, включаю19ую антикол- вейционные компоненты - сахарозу, глицерин и т.п., а также амфолиты (до 0,5%).

При осуществлении предлагаемого способа достигается упрощение технологии получения рН за счет сокращения числа исходных компонентов (2 вместо 8, кроме входящих в поли- меризационную смесь геля), удешев- ;

повышается надежность получения линейного иммобилизованного рП-гра- 20 диента; изменяется лишь угол наклона, но не характер (форма) кривой титрования .

Формула изобретения 25Способ получения иммобилизованного

рН-граднента для изоэлектрического фокусирования.белков в полиакриламид- ном геле путем введения в полимери- зуемую смесь, содержащую акриловый 30 мономер, инициатор полимеризагщи и титрующий компонент, буферирзпощего . компонента и последующей полимеризации, отличающийся тем, что, с целью расширения диапазона рН-градиента и упрощения процесса, в качестве буферирую1цего компонента используют акриламидотетраэтилен- тетрамин, а в качестве титрующего компонента - акриламид (10-этилен- jtQ сульфоновую кислоту.

„

ляется процесс за счет применения недорогих и доступных исходных ком- понентов (буферирующего и титранта),

Перед использованием сухому гелю дают набухнуть в течение 2 ч в ячейк содержащей только воду или при необходимости, воду, включаю19ую антикол- вейционные компоненты - сахарозу, глицерин и т.п., а также амфолиты (до 0,5%).

При осуществлении предлагаемого способа достигается упрощение технологии получения рН за счет сокращения числа исходных компонентов (2 вместо 8, кроме входящих в поли- меризационную смесь геля), удешев-

ляется процесс за счет применения недорогих и доступных исходных ком- понентов (буферирующего и титранта),

повышается надежность получения линейного иммобилизованного рП-гра- диента; изменяется лишь угол наклона, но не характер (форма) кривой титрования .

Формула изобретения Способ получения иммобилизованного

рН-граднента для изоэлектрического фокусирования.белков в полиакриламид- ном геле путем введения в полимери- зуемую смесь, содержащую акриловый мономер, инициатор полимеризагщи и титрующий компонент, буферирзпощего . компонента и последующей полимеризации, отличающийся тем, что, с целью расширения диапазона рН-градиента и упрощения процесса, в качестве буферирую1цего компонента используют акриламидотетраэтилен- тетрамин, а в качестве титрующего компонента - акриламид (10-этилен- сульфоновую кислоту.