Способ получения амфолитаносителя для изоэлектрического фокусирования и изотахофореза Советский патент 1983 года по МПК C07K1/28 

Изобретение относится к биохимии, а именно: к способам разделения белковых веществ. Известны способы синтеза амфолитов-носителей для изоэлектрического фокусирования, в частности сп соб получения амфолитов-носителей путем взаимодействия акриловой кис лоты с полиэтиленполиаминами (ПЭПА например с триэтилентетрамином, тетраэтиленпентамином и пентаэтиленгексамином или их смесями ij . Однако такие амфолиты-носители обладают недостаточной разделяющей способностьЕо, малой буферной емкостью и малой проводимостью в ней тральной области рН. Наиболее близким к предлагаемому является способ получения амфолита-носителя из акриловой кислоты ,и полиэтиленполиаминов, модифицированньях N,N -метилен-бх/С-акриламидом 2j . ,. Однако N,N -метилен-6iic-акриламид связывает амины и noBHUjaeT но лекулярную массу амфолита-носителя что усложняет его отделение от ана лизируемых белков. Амфолиты-носители, полученные известным способо обладают недостаточной буферной ем костью в нейтральной области рН, ь образуют недостаточно линейный гра диент рН. Цель изобретения - улучшение эксплуатационных свойств амфолитаносителя. Для достижения цели согласно способу получения амфолита-носителя для изоэлектрического фокусиров ния и изотахофореза путем модифицирования полиэтиленполиамина непредельным соединёние.м и взаимодей оствия модифицированного полиэтилен полиамина с акриловой кислотой, в качестве непредельного соединения используют соединения, содержащие активированную электроноакцепторными группами этиленовую связь общ формулы Rj-OH e где X - CN; -COOR; -сок,- -CONRR , -POCOR) 2-3- или 4 пиридил R и R - атом водорода, алкил или арил; .. R(И атом водорода, -СН-з или Х,: и модифицирование осуществляют в водной среде при 20-70 С в течение 1-20 ч при молярном соотношении модификатора и полиэтиленполиамина (1-3):1. В ходе модификаций происходит присоединение .первичных и вторичны аминогрупп полиэтиленполиаминов к активированной этиленовой связи с образованием смеси веществ формулыUH -OH -N-feT , где Y Н или -CR,, п 1-6, Модификацию ПЭПА предпочтительно проводить перед их взаимодействием с акриловой кислотой, так как при этом обеспечивается быстрая и полная реакция модификаторов, но возможна модификация в ходе действия и после действия акриловой к-ислоты, Разделяющая способность изоэлектрического фокусирования определяется как разность наиболее близких изоэлектрических точек белков, еще разделяе мых фокусированием. Согласно .теории изоэлектрического фокусиров,ания,два амфотерных электролита (амфолита) с различными изо|электрическими точками не могут |быть разделены путем изоэлектрического фокусирования на отдельные зоны. Для этого необходим третий амфолит, имеющий изоэлектрическую точку в интервале между изоэлектрическими точками разделяемых веществ. Например, для разделения белков с близкими значениями изоэлектрических точек в амфолитеносйтеле должны быть вещества с промежуточными значениями изоэлектрических точек. Поэтому для достижения высокой разделяющей способности изоэлектрического фокусирования необходимо, чтобы в составе амфолитаносителя было возможно большее количество компонентов, распределенных во всем рабочем интервале рН. Это обеспечивает и прямолинейность градиента рН, Изоэлектрическая точка амфотерног.о вещества определяется константами диссоциации его кислой и основной групп. Изменение констант диссоциации обуславливает изменение изоэлектрических точек амфотерных электролитов. Сближение констант диссоциации кислотной и основной группы увеличивает буферную емкость и проводимость амфотерного электролита. Это создает возможность снижения концентрации амфолита-носи-теля, уменьшает выделяемое во время анализа тепло, стабилизирует градиенты рН Предлагаемый способ получения амфолитов-носителей улучшает их свойства, так как увеличивается число индивидуальных амфотерных соединений в составе амфолита-носителя. Например, при взаимодействии ,1 моль триэтилентетрамина с 1 моль

акриловой кислоты образуется две амфотерные аминокислоты, содержащие в молекуле по одному J-карбоксиэтильному остатку и. меньше пяти аминокислот, содержании; по два таких остатка. Таким образом, в амфолите-носителе содержатся в заметных количествах 7 амфотерных соединений. Если же на 1 моль тркэтилентетрамина подействовать 1 моль модификатора (например, акрилонитрила) и 1 моль акриловой кислоты, число образующихся амфотерных производных возрастает до 56, т.е. увеличивается восьмикратно. Если использовать не один модификатор, а несколько, число производных еще многократно увеличится. Таким, образом, предлагаемая модификация дает возможность увеличить на порядок и более число амфотерных компонентов амфолита-носителя. Это улучшает линейность градиента рН и разделяющую способность при изоэлектрическом фокусировании.

Кроме того, при модификации смещаются константы диссоциации аминогрупп. Известно, что присоединение к аминам веществ, содержащих активированную этиленовую связь, изменяет константу диссоциации данного амина. Так, присоединение винилметидсулъфона уменьшает кон станту диссоциации (pKq) на 2,823,13 ед-. , присоединение акрилонитрила - на 2,21-2,50, 2-метилакрилонитрила - на 2,37-2,65, р, р-дихлорэтилового эфира винилфосфиновой кислоты - на 1,70, винилметилкетона - на 0,40. Предлагаемая, модификация понижает значения pKq аминогрупп и сближает их с константами диссоциации кислотных групп. Поэтому предлагаемый амфо.лит носитель приобретает большую бу ферную емкость и проводимость, по сравнению с известными.

Предлагаемый амфолит-носитель готовят следующим образом.

Пример. В трехгорлой колбе емкостью 100 мл с мешалкой, капельной воронкой и приспособлением для продувки азотом помещают 9,0 г {0,06 моль) триэтилентетрамина и 20 мл деионизированной воды. При перемешивании по каплям вводят 1,59 г (0,03 моль) акрилонитрила и 4,9 г (0,03 моль) метилового эфира винилфосфоновой кислоты. Смесь перемешивают 2 ч при 70с, затем охлаждают до комнатной температуры, добавляют по каплям 6,46 г - . (0,09 моль) свежеперегнанной акриловой кислоты и перемешивают 16 ч, при . Продукт реакции разбавляют до 88 мл, трижды обрабатывают активированным углем (в атмосфере азота) при бО-ЭО С и фильтруют.

Полученный таким образом амфолит-носитель образует прямолинейный градиент рЧ в интервале 3-9 при изоэлектрическом фокусировании в градиенте плотности. При изоэлектрическом фокусировании в тонком слое сефадекса амфолитноситель образует примерно прямо0линейный градиент рН в интервале 5,5-8,0. Аналогичные амфолиты-носители, изготовленные по известным методикам, дают нелинейные градиенты рН.

Пример 2. В аппаратуру,

5 описанную в примере 1, помещают 9,45. г (0,4 моль) смеси полиэтиленполиаминов (фракция, кипящая при 100-220°С/1 мм), 30 мл деионизированной воды, 3,3 г (0,025 моль)

0 вийилфенилчетона, 2,65 г (0,032 моль виЕ илметилсульфона, 2,15 г (0,025 моль) метилового эфира акриловой кислоты и 1,75 г (0,035 моль) винилметилкетона. Смесь перемеши5вают в течение 5 ч при комнатной температуре, затем по каплям до,бавляют 1,2 г акриловой кислоты и перемешивают 20 ч при 70°С. Реакционную смесь разбавляют до 100 мл

0 и o6pa6a.LHBamT как описано в примере 1.

Синтезированный таким путем амфолит-носитель образует прямолинейный градиент рН в интервале 3-8.

Пример 3. В аппаратуру, описанную в примере 1, помещают 11,3 г (0,07 моль) смеси полиэтт;ленполиаминов (фракция, кипящая при 100-200 c/l мм) и 20 мл деионизи.рованной воды. Через капельную воронку вводят смесь 7,0 г (0,04 моль) акрилоилморфолина, 3,44 г (0,04 моль) кротононитрила, 5,.15 г (0,04 моль) винилсульфонамида и 6,48 г (0,09 моль) акриловой кислоты. Смесь перемешивают при 50°С в течение 18 ч, разбавляют деионизированной водой до 110 мл и обрабатывают как описано в примере 1.

Синтезированный таким образом . амфолит-носитель образует прямолинейный градиент рН в интервале 3-9.

, Снижение температуры дистилляции До исключает образование окрашенных смол, что улучшает качество амфолита-носителя.

П р и м е р 4. (изоэлектрическое фокусирование белков).

С помощью амфолита-носителя, полученного по предлагаемому способу, .проводят изоэлектрическое фокусирование модельных белков в тонком слое сефадекса и в градиенте плотности. Определяют изоэлектрические 65 точки белков изоэлектрическим фоку-.

сированием в тонком слое сефадекса с использованием амЛолита-носителя,

изготовленного по примеру 2, Данные приведены в таблице.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМФОЛИТАНОСИТЕЛЯ ДЛЯ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ФОКУСИРОВАНИЯ И ИЗОТАХОФОРЕЗА путем модифицирования полиэтиленполиамина непредельным соединением ивзаимодействия модифицированного полиэтиленполиамина с акриловой кислотой, отличающийся тем, что, с целью увеличения эксплуатационных свойств амфолита-носителя, в качестве непредельного соединения используют соединения, содержа.щие активированную электроноакцепторными группами этиленовую связь общей формулы RJ-OH O: X ) где X - rCN ; , -COR-; -CONRR ; ; -PO(OR) ; 2-3- или 4-пиридил; R и R- атом водорода, алкил или ари л; (Л атом водорода, -СН или X, и модифицирование осуществляют в водной среде при 20-70с в течение 1-20 ч при молярном соотношении модификатора и полиэтиленполиамина

Изоэлектрические точки белков, полученный с использованием предлагаемого амфолита-носителя, хорошо совпадают с литературными данными.

Paздeляющs o способность амфолитаносителя определяют изоэлектрическим фокусированием гемоглобина в градиенте плотности. Визуальное сравнение разделенных полос гемоглобина показало, что оно выше, чем в предлагаемом экг:перименте с амфолитрмносителем, полученным по известному способу.

Преимуществом предлагаемого способа является также упрощение процесса изготовления амфолитов-носителей за счет использования более легкокипящих фракций технической смеси полиэтиленполиаминов при сохранении достаточно хорошей, линейности градиента рН, Снижение температуры перегонки упрощает этот процесс, кроме того, уменьшается возможность образования побочных окрашенных продуктов, что улучшает качество амфолита-носителя.