ШТАММ ВНУТРИВИДОВЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК SUIS DOMESFICE, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСА КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ Российский патент 1997 года по МПК C12N5/06 

Предлагаемое изобретение относится в области ветеринарной биотехнологии, в частности, к получению штамма внутривидовых гибридных клеток свиньи Suis Domestica для выделения и культивирования вируса классической чумы свиней. Получение штаммов, используемых для выделения и диагностики вирусов, в настоящее время является актуальной проблемой.

Известен штамм вируса ринопневмонии лошадей Egvina rhinophnevmonitis virus NCB/69, используемый для изготовления вакцины против ринопневмонии лошадей (1).

Клетки штамма активно растут и хорошо развиваются на синтетических и полусинтетических питательных средах с добавлением сыворотки крупного рогатого скота. Штамм чувствителен к вирусу ринопневмонии лошадей, герпес вирусу 3 типа.

Известен также штамм перевиваемых клеток почки эмбриона овцы ППЭО, используемый для вирусологических исследований. Получен штамм путем последовательных пересевов первичной культуры клеток почки эмбриона овцы с периодической сменой культурной жидкости (2). Он обладает следующими свойствами.

Морфологическая характеристика
Культура представлена в монослое фибробластоподобными клетками с крупным ядром овальной формы. Ядра содержат 1 -6 ядрышек, цитоплазма чистая плотная.

Культуральные свойства
Культура хорошо пассируется, образуя сплошной монослой. В качестве ростовой среды используется среда ГЛА 0,5% 199 и Игла с 10% сыворотки крови крупного рогатого скота. Посевная концентрация 20 -30 тыс. клеток/мл. Для снятия клеток используются 0,02% раствор версена или раствор версен трипсин в соотношении 5:1. Коэффициент пересева (1:2) (1:3). Митотический индекс к 2 -3 суткам культивирования составляет 25 -35.

Сведения о контаминантах. Бактерии, грибы, микроплазмы не обнаружены, вирусы не обнаружены.

Криоконсервацию штамма осуществляют в криозащитной среде, состоящей из 0,5% ГЛА или 199 и Игла, 20% сыворотки к.р.с. и 10% глицерина. Режим замораживания эквилибрация при 4^oC в течение 1 час. далее снижение температуры до 70^oC со скоростью 1 ^o/мин. Затем помещают в жидкий азот при -196^oC. Выживаемость клеток после размораживания 80%
Чувствительность к вирусам. Клетки ППЭО чувствительны к вирусу классической чумы свиней КЧС. По данным Ильясовой 1992 г. титр вируса КЧС в культуре ППЭО составляет 3,5 -4 lg.

Штамм перевариваемых клеток почки эмбриона овцы ППЭО депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток с/х и промысловых животных Всесоюзного научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко ВСКК (СХЖ) под номером 29 г. Москва.

Предложенный штамм внутривидовых гибридных клеток свиньи Suis Domestica получен путем слияния спленоцитов плода свиньи с перевиваемыми мутантными клетками свиньи СПЭВ-13-А4-ТК с помощью 50%-ного раствора полиэтиленгликоля с последующей селекцией гибридов в среде ГАТ.

Внутривидовой гибридный штамм свиньи обладает следующими свойствами.

Морфологическая характеристика
Культура представлена клетками 2-х типов эпителиоподобного и лимфоцитоподобного. Эпителиоподобные клетки обладают высокими адгезивными свойствами. Лимфоцитоподобные низкоадгезивными свойствами и накапливаются, кроме мультислоя, в культуральной жидкости на 3 -6 сутки культивирования в концентрации 50 -100 тыс.кл/мл. Культура представлена в монослое клетками эпителиоподобного типа до 60 -70% и клетками лимфоцитоподобного до 30 -40% Эпителиоподобные клетки имеют полигональную форму, плотно примыкают друг к другу. Лимфоцитоподобного типа клетки с плотными ядрами и узким ободком цитоплазмы.

Культуральные свойства
Основная среда культивирования для постоянного поддержания культуры клеток 199, Игла с 5 -7% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота или телят-доноров. Для масштабирования клеток, в целях выращивания вирусов, могут применяться отечественные питательные среды на основе белков крови (ПБК-С) и мышц крупного рогатого скота (ФГМ-С) в течение 3 -4 пассажей. Посевная концентрация 80 -100 тыс. клеток/мл. Для снятия клеток используется 0,25% раствор трипсина и 0,02% раствор версена в соотношении 1:8 1:9. Коэффициент пересева 1:4 1:6.

Модальное число хромосом 40 имеют 46% клеток популяции. Разброс числа хромосом составляет 38 -45.

Способ хранения
Криоконсервацию штамма осуществляют замораживанием клеток до -30^oC по 1-2^oC в мин. а далее до -70^oC по 3-5^oC в мин. По достижении "минус" 70^oC амплитуду с клетками помещают в жидкий азот (-195^o-196^oC). Концентрация клеток при замораживании составляет 3-4 млн/мл. Состав криозащитной среды: 45 -50% среды Игла, 40 -45% сыворотки телят-доноров, 10% ДМСО.

Сведения о контаминантах. Бактерии, грибы при бактериологическом исследовании не обнаружены.

Пример 1. На культивирование клеток культуру клеток A₄C выращивают на одной из питательных сред: 199, Игла, ГБК-С, ФГМ-С с 5% сыворотки телят-доноров. В матрасы вносили суспензию клеток, содержащую 100 тыс.клеток/мл и инкубировали без смены среды при 37^oC. Монослой формируется на 3 сутки культивирования. Клетки снимают со стекла диспергирующим раствором и определяют индекс пролиферации. Результаты представлены в таблице.

Пример 2. На выделение эпизоотического вируса (оптимум).

Культуру клеток выращивают на покровных стеклах. После образования монослоя, через 3 суток, его отмывают от ростовой среды раствором Хенкса и инфицируют вирусом. Через 60 мин. после контакта при 37^oC, жидкость с вирусом удаляют, вносят поддерживающую среду с 2% сыворотки крови и помещают в термостат при 37^oC в течение 48 -72 час. По истечение этого времени инфицированную культуру клеток фиксируют смесью метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1). Окрашивают специфическим ФИЦ-глобулином к вирусу классической чумы свиней и просматривают в люминесцентном микроскопе. Результаты анализа показывают, что специфическое свечение в клетках A₄xC более интенсивно, чем в клетках ППЭО, РК-15, СПЭВ, RK-13. Процент выявления полевого вируса в РИФ с использованием культуры клеток A₄xC на 5 -10% выше, чем на культурах клеток ППЭО, РК-15, СПЭВ, RK-13. Выделенным вирусом заражают свиней подкожно. Животные заболевают.

Пример 3. На накопление вируса (оптимум). Культуру клеток культивируют на среде Игла с добавлением 5% сыворотки телят-доноров. Инфицирование проводят аналогично примеру 2. После окончания культивирования вирусосодержащую суспензию замораживают и оттаивают, центрифугируют. В надосадочной жидкости устанавливают накопление вируса методом флуоресцирующих антител. Вирус классической чумы свиней штамм "Гудзон" (аттенуированный штамм), штамм "Ши-Мынь" (вирулентный) накапливается в культуре клеток A₄xC в титрах 5,5 -6,5 Lg, что на 0,5 -1 lg выше контрольных культур клеток РК-15, ППЭО, RK-13, СПЭВ.

Предложенный штамм внутривидовых гибридов клеток Suis Domestica, используемых для выделения и культивирования вируса классической чумы свиней, хранится в Специализированной коллекции перевариваемых соматических клеток с/х и промысловых животных Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко под номером 48. г. Москва, ВСКК (СХЖ). Справка о депонировании прилагается.

Штамм апробирован нами с положительным результатом при культивировании и диагностике вируса классической чумы свиней.

Штамм может найти применение в биотехнологии, вирусологии, ветеринарии для выделения и культивирования вирусов.

Использование: культура клеток. Сущность изобретения получен штамм внутривидовых гибридных клеток Suis Domestica. Штамм обладает всеми свойствами, присущими гибридным клеткам, и позволяет идентифицировать вирус классической чумы свиней и обеспечивает его получение в титрах 5,5-6,5. Штамм депонирован в ВСКК (СХЖ) под номером 48. 1 табл.

Штамм внутривидовых гибридных клеток Suis Domestica, ВСКК(СХЖ) N 48, используемый для выделения и культивирования вируса классической чумы свиней.