СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОДВИЖНОСТИ МУЖСКИХ КЛЕТОК В ЭЯКУЛЯТЕ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/48 

Интерес, возросший за последнее время к проблеме мужского бесплодия, обусловлен высокой частотой нарушений репродуктивной функции мужчин, составляющей в бесплодном браке 40 - 50%. Важнейшим методом в оценке функционального состояния половых желез и суждении о плодовитости мужчин является исследование спермы. В связи с этим выявление мужского фактора при обследовании бесплодных пар в большой степени зависит от точного и корректного определения показателей подвижности сперматозоидов в сперме. Признание значимости объективного определения характеристик подвижности клеток привело к созданию различных методических подходов к решению этой задачи. Например, созданы компьютерные системы анализа эякулята, включающие микроскоп и видеокамеру с цифровой обработкой изображений. Эти устройства являются весьма дорогостоящими и требуют применения сложных алгоритмов обработки больших массивов данных. Высокая стоимость приборов, большая продолжительность выполнения анализа и не всегда отвечающая полным требованиям оценки анализа воспроизводимость результатов являются постоянными объектами критики таких методических подходов.

Наиболее близким к заявляемому можно считать способ определения подвижности сперматозоидов с помощью регистрации оптической плотности с последующим вычислением коэффициента подвижности половых клеток.

Однако вопрос применимости этого параметра в клинической практике остается открытым. Также нерешенными остаются вопросы стандартизации измерений. Это в первую очередь касается температурного режима, типа камеры и состава среды для разведения образцов.

Техническим результатом наших разработок явилось создание нового метода оценки подвижности сперматозоидов в неразбавленном эякуляте. Сущность изобретения заключается в том, что создан способ определения подвижности мужских половых клеток в нативном эякуляте, включающий взятие эякулята у пациента, помещение пробы в приспособление для оценки подвижности сперматозоидов с последующей оценкой результатов подвижности, при этом пробу исследуют в емкости, которой снабжен измеритель количества движущихся клеток (спермоанализатор), в емкости поддерживают t = 37 ± 0,5^oС, глубину емкости обеспечивают не менее 200 мкм, перед исследованием пробы оценивают адекватность показаний измерителя за счет проведения испытаний подвижности сперматозоидов в нормальной сперме, содержащей обездвиженные клетки, и нормальной сперме, лишенной клеток, а оценку подвижности мужских половых клеток проводят по количеству активно и медленно движущихся сперматозоидов.

Еще один немаловажный признак изобретения состоит в использовании конкретной среды исследования подвижности сперматозоидов.

Исследовали влияние процента подвижных клеток в пробе эякулята на показания метода. Для изучения зависимости получаемых результатов от соотношения подвижных и неподвижных клеток в пробе использовали ряд разведений образцов нормальной спермы. Для этого образец разделяли на две равные части, где одну пробу хранили при температуре 22 - 26^oС, а вторую инкубировали при 60^o ± 5^oС в течение 4 - 6 минут, что вызвало прекращение двигательной активности клеток. Результаты этого исследования показаны на фиг.1. График регистрирует линейную зависимость подвижности сперматозоидов от степени разбавления неподвижными клетками при сохранении одинаковой их общей концентрации (на графике: А - активно подвижные клетки; А + В - активно и медленно движущиеся клетки).

Оценка способа в зависимости от концентрации клеток в образце показаны на фиг.2 (данные приведены в виде среднего ± среднеквадратичное отклонение 5 измерений). Для изменения количества клеток в пробе образец делили на две равные части. Один объем хранили при температуре помещения. Второй центрифугировали при 1000xg в течение 10 ± 2 мин, а затем бесклеточный супернатант отбирали в отдельную пробирку. Аликвоты нативного эякулята смешивали с бесклеточным эякулятом в разных пропорциях и полученные пробы исследовали с помощью спермоанализатора. Анализ полученных данных показал, что новый метод регистрировал линейное уменьшение концентрации сперматозоидов в зависимости от степени разбавления, в то время как процентный состав подвижных и активно подвижных клеток сохранялся практически неизменным.

Все исследования проводились с помощью измерителя количества движущихся клеток, принципиальная электрическая схема которого приведена на фиг.3.

Измеритель содержит источник 1 света, пространственный модулятор 2 периодической функцией, емкость 3 исследуемого материала, фотоприемник 4, анализатор спектра 5, сумматор 6 мощности. (На конструкцию данного прибора подана заявка на патент N 97104743 и получено положительное решение 23.11.98 г.).

Однако для осуществления заявленного способа могут быть использованы и другие приспособления, предназначенные для определения характеристик передвижения клеток (напр. 4).

Способ осуществляют следующим образом: хорошо перемешанная проба с помощью пипетки объемом 50 микролитров помещалась в специальную стеклянную емкость, где под действием капиллярных сил заполняла рабочий объем. При движении клеток в камере возникали периодические колебания оптической плотности с частотой, соответствующей скорости перемещения клеток и периоду модуляции интенсивности света. Колебания интенсивности света, которые регистрировались фотоприемником, поступали в аналого-цифровой преобразователь и далее в компьютер. Так как интенсивность света вдоль рабочей поверхности камеры была модулирована периодической функцией (период модуляции составлял 15 мкм), то после спектрального анализа сигнала по его мощности в соответствующем диапазоне частот вычисляли количество клеток, имеющих определенную скорость. В наших экспериментах поддерживалась стабильная и более высокая температура камеры 37^oС, чем при исследовании с помощью микроскопа при температуре помещения 22 - 26^oС, что позволило в более физиологических условиях оценивать скорость движения половых клеток, при этом проводили учет только подвижных (активных и медленных) клеток, что является адекватной оценкой подвижности сперматозоидов.

Проведено исследование спермы у 74 мужчин, состоящих в бесплодном браке с нормо- и патозооспермией. Клинико-лабораторное исследование выполнялось под контролем врача-андролога. Для интерпретации полученных результатов и оценки их информативности использовались данные, изложенные в Руководстве ВОЗ по лабораторному исследованию спермы человека и взаимодействию с цервикальной жидкостью, рекомендованные для практического применения (1992 г.).

Анализ спермы осуществляли при половом воздержании не менее 3-х дней и не больше 7 дней. Сбор спермы производили в стерильный пластмассовый контейнер, ранее проверенный на токсичность к сперматозоидам. Все манипуляции с хранением и транспортировкой образцов осуществляли при температуре 22 - 26^oС. Контрольное исследование спермы выполняли в камере Маклера при 200-кратном увеличении микроскопа в течение 1 часа после сбора образца. Скорость движения клеток определялась по времени (в секундах), необходимому для преодоления расстояния (0,1 мм).

Верификация данных нового метода показала, что коэффициент корреляции Спирмана составил 0,62 (n=74, p<0,001) для подвижных сперматозоидов категории А+Б и 0,73 (n=74, p<0,001) для активно подвижных клеток категории А. Новый метод регистрировал более высокую подвижность клеток в образцах, чем это получалось при исследовании с помощью микроскопа (44% и 32% для категории А+Б, 11% и 9% для категории А соответственно).

Осуществляя новый методический подход для анализа спермы, авторам удалось создать простой и удобный метод, преимуществом которого является высокая точность и воспроизводимость получаемых результатов в широком диапазоне концентраций клеток, характерных для нативного эякулята.

Нами обследовано 74 мужчины, состоящих в бесплодном браке в возрасте от 21 до 42 лет. Распределение пациентов в зависимости от принятых нами характеристик подвижности клеток следующее: нормозооспермия 45%, астенозооспермия 18%, олигозооспермия 14%, олигоастенозооспермия 12%, тератозооспермия 7%, азооспермия 4%.

Таким образом, заявленный способ анализа семенной жидкости адекватно и корректно отражает основные показатели подвижности сперматозоидов. К достоинствам метода относится возможность исследования спермы в нативной среде, высокая точность и воспроизводимость получаемых результатов, а также простота и небольшое время проведения анализа. Использование такого методического подхода в клинической практике позволит быстро и точно оценивать основные параметры подвижности спермы и выявлять мужской фактор бесплодия, что в дальнейшем поможет определить тактику ведения бесплодной пары.

Способ определения подвижности мужских половых клеток в эякуляте осуществляют путем взятия эякулята у пациента, помещение пробы в емкость, которой снабжен измеритель количества движущихся клеток, в емкости поддерживают t = 37 ± 0,5^oС, глубину емкости обеспечивают не менее 200 мкм, перед исследованием пробы оценивают адекватность показаний измерителя за счет проведения испытаний подвижности сперматозоидов в нормальной сперме, содержащей обездвиженные клетки, и нормальной сперме, лишенной клеток, а оценку подвижности мужских половых клеток проводят по количеству активно и медленно движущихся сперматозоидов. Предпочтительно получение нормальной спермы, содержащей обездвиженные клетки, путем обработки при температуре 60 ± 5^oС. Предпочтительно получение нормальной спермы, лишенной клеток, путем центрифугирования при 1000g в течение 10 ± 2 мин. Способ обеспечивает возможность быстро и точно оценивать основные параметры подвижности сперматозоидов и выявлять мужской фактор бесплодия. 2 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ определения подвижности мужских половых клеток в эякуляте, включающий взятие эякулята у пациента, помещение пробы в приспособление для оценки подвижности сперматозоидов с последующей оценкой результатов подвижности, отличающийся тем, что пробу исследуют в емкости, которой снабжен измеритель количества движущихся клеток, в емкости поддерживают температуру 37 ± 0,5^oС, глубину емкости обеспечивают не менее 200 мкм, перед исследованием пробы оценивают адекватность показаний измерителя за счет проведения испытаний подвижности сперматозоидов в нормальной сперме, содержащей обездвиженные клетки, и нормальной сперме, лишенной клеток, а оценку подвижности мужских половых клеток проводят по количеству активно и медленно движущихся сперматозоидов. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что нормальную сперму, содержащую обездвиженные клетки, получают путем ее обработки при температуре 60 ± 5^oС. 3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что нормальную сперму, лишенную клеток, получают путем центрифугирования при 1000g в течение 10 ± 2 мин.