СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ЖИВЫХ СПЕРМАТОЗОИДОВ С ПОМОЩЬЮ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ СРЕДЫ ПРИ АБСОЛЮТНОЙ АСТЕНОЗООСПЕРМИИ В РАМКАХ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ Российский патент 2016 года по МПК C12N5/76 

Абсолютная астенозооспермия, то есть 100% неподвижных сперматозоидов в эякуляте, встречается с частотой 1 на 5000 случаев в когорте бесплодных пациентов [1]. Причинами полного отсутствия движений жгутика могут служить нарушения строения динеиновых ручек аксонемы жгутика, аномалии конфигурации микротрубочек, а также причины, связанные с эпидидимальным хранением сперматозоидов до эякуляции (посттестикулярная трансформация сперматозоидов) [2]. В случае отказа супружеской пары от использования донорской спермы при тяжелом мужском факторе бесплодия проводят оплодотворение неподвижными сперматозоидами. При выполнении оплодотворения методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ) неподвижными сперматозоидами основная задача, стоящая перед клиническим эмбриологом, - дифференцирование живых неподвижных сперматозоидов (только такие пригодны для оплодотворения и дальнейшего развития эмбриона) от мертвых (не пригодны для оплодотворения, происходит распад мужской ДНК, запущены необратимые процессы деградации всех внутриклеточных структур). Именно поэтому частота оплодотворения ооцитов в циклах ИКСИ при абсолютной астенозооспермии существенно ниже по сравнению с другими патологиями сперматозоидов [1]. Отсутствие движения как головки, так и жгутика также часто встречается при работе с образцами биоптата эпидидимиса/яичка и после криоразморозки спермы (особенно длительно хранящейся, более 5 лет).

Целью настоящего изобретения является разработка диагностической культуральной среды для дифференцировки живых сперматозоидов, пригодных для использования в рамках лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения.

Эта задача решается применением двухкомпонентной среды, позволяющей инициировать колебательные движения головки/жгутика сперматозоидов и использовать данные мужские половые клетки для оплодотворения методом ИКСИ в той же чашке Петри. В качестве составляющих разработанной культуральной среды использованы пентоксифиллин (Pentoxyphyllinum) в увеличенной концентрации 3,6 мМ/л и кофеин (Coffeine) в концентрации 5 мМ/л, добавленных в среду KSOM с буфером HEPES (21 мМ) и 5 мг/мл (0,5%) человеческого сывороточного альбумина HSA.

Наиболее применимые в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) стимуляторы подвижности сперматозоидов - ингибиторы фосфодиэстеразы (пентоксифиллин, кофеин, теофиллин). В отсутствии ингибиторов содержание циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) в мужской половой клетке остается неизменным и коррелирует только с гиперподвижностью и амплитудой латерального смещения головки сперматозоида. Накопление цАМФ, в свою очередь, стимулирует цАМФ-зависимые киназы, которые индуцируют фосфорилирование белков хвостика, что и инициирует непродолжительные биения [3]. Согласно литературным данным, исследователи эмпирически подбирают концентрации данных стимуляторов и проводят дифференцировку живых сперматозоидов с последующим оплодотворением методом ИКСИ [1-6]. В частности, на применение пентоксифиллина в конечной концентрации 3,5 мМ/л при оплодотворении методом ИКСИ получен патент №31979 А Украины, МПК 6 А61К 31/52 [7]. Однако при применении пентоксифиллина необходимо учитывать тот факт, что это неспецифический ингибитор фосфодиэстераз, именно поэтому использование только пентоксифиллина для инициации биений головки или жгутика сперматозоида не всегда дает необходимый результат: сперматозоиды в некоторых образцах эякулята/биоптата при наличии живых мужских половых клеток остаются неподвижными. Отличие разработанной диагностической культуральной среды с увеличенной концентрацией пентоксифиллина (3,6 мМ/л) и добавкой кофеина (5 мМ/л), добавленных в среду KSOM с буфером HEPES (21 мМ) и 5 мг/мл (0,5%) человеческого сывороточного альбумина HAS, позволяет инициировать движение и в таких сложных клинических случаях. Так как Руководство ВОЗ по анализу и обработке эякулята человека 5-го пересмотра [8] не рассматривает случаи тяжелого мужского бесплодия и не содержит указаний по работе с образцами при абсолютной неподвижности сперматозоидов, клинические эмбриологи вынуждены разрабатывать собственные протоколы.

При использовании разработанной культуральной среды для дифференцировки живых сперматозоидов протокол работы выбран следующий.

1. Нагреть диагностическую культуральную среду до комнатной температуры.

2. Приготовить стандартную чашку для выполнения ИКСИ, поместив каплю диагностической среды в центре.

3. Добавить эякулят в каплю с диагностической средой.

4. В течение не более 10 мин провести дифференцировку живых пригодных для оплодотворения сперматозоидов, перенеся их в каплю со стандартной средой для половых клеток.

5. Провести процедуру оплодотворения методом ИКСИ.

6. Далее культивирование эмбрионов осуществлять по стандартной методике.

Преимущества предлагаемой культуральной среды были подтверждены на 36 образцах сперматозоидов с тотальной неподвижностью (абсолютная астенозооспермия и образцы биопсии тестикулярной ткани). Все пациентки подписали добровольное информированное согласие на применение среды для дифференцировки сперматозоидов. Подвижность была инициирована во всех образцах. Процент оплодотворения был 79,5%, что ниже по сравнению с циклами ИКСИ при использовании нативного эякулята (89%), частота дробления в группе составила 76,9% (против 92%). Качество эмбрионов и стадии дробления на день переноса эмбрионов в полость матки были сопоставимы. В исследуемой группе было получено 8 беременностей (22,2%), из которых 5 закончились выкидышем на раннем сроке (в том числе по причине хромосомной патологии у плода), 2 беременности в настоящий момент прогрессируют, рожден 1 здоровый ребенок.

Клинические примеры

Пример 1. Пациентка К., 28 лет, обратилась по поводу лечения бесплодия методами ЭКО/ИКСИ и переноса эмбрионов. Проведено полное клиническое обследование. В анамнезе беременностей не было. Гинекологический и эндокринологический статусы без особенностей. Муж, 34 лет, по результатам спермограммы выявлена тяжелая степень олигоастенотератозооспермии, первичное бесплодие. Супруге проведена стимуляция овуляции по модифицированному короткому протоколу с ант-ГнРГ, выполнена трансвагинальная пункция фолликулов, получено 10 ооцитов. У мужа в день оплодотворения обнаружена абсолютная неподвижность единичных сперматозоидов. Перед выполнением ИКСИ использовали разработанную среду для дифференцировки живых сперматозоидов. Оплодотворение произошло в 6 ооцитах, культивирование эмбрионов выполняли до стадии бластоцисты. В полость матки осуществлен перенос 2 эмбрионов. Наступила одноплодная беременность. На 40-й неделе выполнена плановая операция кесарево сечения, родился здоровый доношенный мальчик.

Пример 2. Пациентка С., 31 год, обратилась по поводу лечения бесплодия методами ЭКО/ИКСИ и переноса эмбрионов. В анамнезе беременностей не было, маточные трубы проходимы, гормональный статус в норме, практически здорова. Муж, 32 года, по результатам спермограммы астенотератозооспермия, некрозооспермия. Количество живых сперматозоидов 4%, первичное бесплодие. Супруге проведена стимуляция овуляции по модифицированному короткому протоколу с ант-ГнРГ, выполнена трансвагинальная пункция фолликулов, получено 8 ооцитов. У мужа в день оплодотворения в эякуляте подвижных сперматозоидов не найдено (живых сперматозоидов 1%). При добавлении к обработанной сперме только пентоксифиллина инициации биений жгутика не произошло. Использование разработанной культуральной среды с кофеином позволило отобрать живые сперматозоиды по небольшим колебательным движениям головки. Оплодотворение произошло в 4 ооцитах, культивирование эмбрионов выполняли до 5 суток. В полость матки произведен перенос 2 бластоцист хорошего качества. Беременность не наступила.

Таким образом, разработанная культуральная среда является эффективным методом дифференцировки неподвижных живых сперматозоидов от мертвых при абсолютной астенозооспермии, что позволяет повысить эффективность программ лечения бесплодия методом ИКСИ, не увеличивая время, затрачиваемое на процедуру оплодотворения, что является существенным преимуществом по сравнению с другими методиками.

Список литературы

1. Ortega С. et al. Absolute asthenozoospermia and ICSI: what are the options? // Human Reproduction, 2011, Vol. 17, No 5, pp. 684-692.

2. Holstein A.F., Schulze W., Davidoff M. Understanding spermatogenesis is a prerequisite for treatment // Repr. Biol. Endocrinol. - 2003. - V. 1 - P. 107-123.

3. Lewis S., Moohan J., Thompson W. Effect of pentoxifylline on human sperm motility in normozoospermic individuals using computer-assisted analysis // Fert. and Steril. - 1993. - 59. - 418-23.

4. Nassar A., Mahony M., Morshedi M. et al. Modulation of sperm tail protein tyrosine phosphorylation by pentoxifylline and its correlation with hyperactivated motility // Fert. and Steril. - 1999. - 71. - 919-23.

5. Elsraite O. et al. Effect of caffeine on human sperm mortility in vitro // 15^th world congress on in vitro fertilization, 2009.

6. Momozawa K, Fukuda Y. Caffeine in fertilization medium is not essential for bovine IVF by fully capacitated spermatozoa // Journal of reproduction anf development, vol. 49, No 6, 2003, p. 507-512.

7. Лучко НА., Грищенко В.И., Кучков И.Н., Калугин Ю.В. Способ повышения подвижности спермиев человека. Патент №31979А Украины, МПК 6 A61K 31/52. Опубл. в Б.И., 2000, №7-11, с. 168.

8. Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека / под ред. Курило Л.Ф., перевод Макарова Н.П., 5-е изд. - М., 2012.

Настоящее изобретение относится к области андрологии, репродуктологии и клинической эмбриологии. Способ дифференцировки живых сперматозоидов при абсолютной астенозооспермии в рамках экстракорпорального оплодотворения предусматривает использование диагностической культуральной среды для дифференцировки живых сперматозоидов с увеличенной концентрацией пентоксифиллина 3,6 мМ/л и кофеином в концентрации 5 мМ/л. Существенным преимуществом использования совместно двух компонент (кофеина и пентоксифиллина) служит расширение клинических случаев, когда удается добиться кратковременной инициации колебательных движений головки/жгутика, что приводит к достижению оптимального времени при отборе живых сперматозоидов и выполнения оплодотворения методом ИКСИ. Применение разработанной культуральной среды позволяет клиническому эмбриологу проводить одновременно простую дифференцировку живых половых клеток и в этой же чашки Петри проводить оплодотворение методом ИКСИ. 2 пр.

Способ дифференцировки живых сперматозоидов при абсолютной астенозооспермии в рамках экстракорпорального оплодотворения, отличающийся тем, что используют диагностическую культуральную среду для дифференцировки живых сперматозоидов с увеличенной концентрацией пентоксифиллина 3,6 мМ/л и кофеином в концентрации 5 мМ/л.