СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА ГАПТЕН-БЕЛОК Российский патент 1999 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к области биохимии, а именно к способам синтеза веществ, используемых для получения и иммуноанализа антител. Известны методы синтеза конъюгатов гаптен-белок на основе реакции свободной альдегидной группы гаптена со свободными аминогруппами белка (И.Е.Ковалев, О.Ю.Полевая. Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным химическим соединениям. М., 1985, с. 14-21).

Наиболее близким к предлагаемому является метод Накане получения конъюгатов фермент-белок (Теория и практика иммуноферментного анализа. М., 1991, с. 182-183; Иммуноферментный анализ. /Под ред. Т. Т. Иго и Г. Ленхоффа, М. , 1988, с. 175-176; P. К. Nakane, A. Kawaoi. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 1974, v. 22, N 12, p. 1084-1091), используемый в патенте Российской Федерации 2014610, G 01 N 33/535, 15.06.94, который заключается в том, что:
для получения конъюгата к раствору белка-носителя при pH 8,8-9,5 добавляют раствор гаптена, имеющего активные альдегидные группы. Через 1-3 часа образуется конъюгат с ковалентными азометиновыми связями между аминогруппами белка и альдегидной группой гаптена и затем для стабилизации конъюгатов их обрабатывают раствором боргидрида натрия, в результате чего происходит восстановление азометиновых связей гаптен-белок до устойчивых к гидролизу вторичноаминных связей.

Недостатки прототипа состоят в том, что:
стабилизация конъюгатов восстановлением азометиновых связей приводит к одновременному восстановлению внутримолекулярных дисульфидных связей в белках-носителях с образованием тиоловых групп. При высушивании таких конъюгатов или хранении их растворов без добавок значительных количеств дополнительных стабилизаторов, таких как сывороточные альбумины (до 20 г/л), мертиолат (0,02%), глицерин (50%) или меркаптоэтанол (0,1%), происходит образование нерастворимых полимерных продуктов за счет окисления тиоловых групп с образованием межмолекулярных дисульфидных связей. Это существенно уменьшает выход растворимой фракции или делает невозможным использование конъюгата в иммуноанализе.

Перечисленные недостатки особенно проявляются в тех случаях, когда гаптенами служат гидрофобные химические соединения, например полициклические ароматические углеводороды.

Заявляемое изобретение направлено на решение следующей задачи - получения хорошо растворимых конъюгатов гаптен-белок, содержащих минимальные количества полимерных продуктов и устойчивых без специальных стабилизаторов.

Для решения поставленной задачи при получении конъюгата гаптен-белок предлагается способ проведения совместной реакции гаптена и белка-носителя в щелочном растворе и восстановление конъюгата в реакционном растворе добавлением боргидрида натрия в присутствии соединения, блокирующего образование нерастворимой полимерной фракции, при молярном соотношении белка и блокирующего соединения 1:100 - 1:1000 соответственно.

При этом в качестве блокирующего предлагается использовать соединение, взятое из группы производные иодуксусной кислоты, производные акриловой кислоты, непредельные производные гетероциклических соединений, циклические имины, оксираны.

Сущность изобретения заключается в том, что стадию стабилизации конъюгата проводят в присутствии блокирующих соединений, т.е. способных необратимо реагировать с тиоловыми группами белка с образованием сульфидов, таких как производные иодуксусной или акриловой кислот (иодацетамид, иодацетат натрия или акрилонитрил, акриламид, акрилат натрия, метилакрилат), непредельные производные гетероциклических соединений (N-винилпирролидон, 4-винилпиридин), циклические имины (этиленимин) и оксираны (окись этилена), при молярном соотношении белка к блокирующему соединению соответственно от 1:100 до 1: 1000. Нижний предел концентрации блокирующего соединения обусловлен количеством тиоловых групп в молекуле белка, а верхний предел концентрации - ограничением его растворимости. При этом происходит введение дополнительных гидрофильных групп в структуру белков, что также способствует повышению растворимости конъюгатов. Использование предлагаемых блокирующих соединений позволяет повысить выход растворимой фракции с 15% до 95%.

Пример 1. Для получения конъюгата антрацен (АЦ) - бычий сывороточный альбумин (БСА) к раствору белка 0,1 г (1,5 мкМ) БСА в 1 мл 0,1Н гидроксида натрия прибавляют по каплям при перемешивании и охлаждении 1,5 мл пиридина и затем 16 мг 9-антраценальдегида (АЦА). После трехчасового перемешивания при 25^oC вносят блокирующее соединение 50 мг (0,7 мМ) акриламида (АА) и раствор восстановителя 10 мг боргидрида натрия в 1 мл воды. Через 30 мин прибавляют 4 капли ледяной уксусной кислоты и осаждают белок 8 мл ацетона. Через 15 мин осадок центрифугируют и промывают 5 раз по 8 мл ацетона. После высушивания осадка под вакуумом получают конъюгат, дающий при растворении в 10 мл 0,01Н гидроксида натрия менее 5% нерастворимой фракции. Спектрофотометрически определено, что конъюгат имеет (25±3) моль АЦ на 1 моль БСА. Конъюгат сохраняется в растворимой форме при доведении pH раствора до 7,2 - 7,4. Нерастворимые полимерные продукты не образуются при хранении раствора при температуре 5^oC как минимум в течение полугода.

Пример 2. Аналогично примеру 1, но с использованием 10 мг АА, получают конъюгат, по свойствам аналогичный конъюгату примера 1.

Пример 3. Аналогично примеру 1, но с использованием 100 мг АА, получают конъюгат, по свойствам аналогичный конъюгату примера 1.

Примеры 4-6. Аналогично примерам 1-3, но с использованием соответственно 0,1; 0,02 и 0,2 мл акрилонитрила (АН) вместо АА, получают конъюгаты, по свойствам аналогичные конъюгату примера 1.

Примеры 7-9. Аналогично примерам 1-3, но с использованием соответственно 0,15; 0,03 и 0,3 мл 50%-ного водного раствора окиси этилена (ОЭ) вместо АА, получают конъюгаты, по свойствам аналогичные конъюгату примера 1.

Примеры 10-12. Аналогично примерам 1-3, но с использованием соответственно 0,08; 0,015 и 0,15 мл этиленимина (ЭА) вместо АА, получают конъюгаты, по свойствам аналогичные конъюгату примера 1.

Примеры 13-15. Аналогично примерам 1-3, но с использованием соответственно 0,15; 0,025 и 0,25 мл N-винилпирролидона (ВП) вместо АА, получают конъюгаты, по свойствам аналогичные конъюгату примера 1.

Для сравнения предлагаемого решения с прототипом выполняли синтез конъюгатов АЦ-БСА без использования блокирующих соединений.

Пример 16. Аналогично примеру 1, но без использования АА, АН, ОЭ, ЭИ или ВП, получают конъюгаты, дающие при растворении более 85% нерастворимой фракции, которая не переходит в раствор при использовании 8М мочевины или 5% додецилсульфоната натрия.

Изобретение относится к области биохимии, а именно к способам синтеза веществ, используемых для получения и иммуноанализа антител. Проводят совместную реакцию гаптена и белка-носителя в щелочном растворе, а восстановление коньюгата в реакционном растворе осуществляют добавлением боргидрида натрия в присутствии соединения, блокирующего образование нерастворимой полимерной фракции, при молярном соотношении белка и блокирующего соединения 1:100 - 1: 1000 соответственно. При этом в качестве блокирующего используют соединение, взятое из группы производные иодуксусной кислоты, производные акриловой кислоты, непредельные производные гетероциклических соединений, циклические имины, оксираны. Способ позволяет подучить хорошо растворимые коньюгаты гаптен-белок, содержащие минимальные количества полимерных продуктов и устойчивые без специальных стабилизаторов. 1 з.п.ф-лы.

1. Способ получения конъюгата гаптен-белок для иммуноанализа антител, включающий проведение совместной реакции гаптена и белка в щелочном растворе и восстановление конъюгата в реакционном растворе добавлением боргидрида натрия, отличающийся тем, что стадию восстановления проводят в присутствии соединений, блокирующих образование нерастворимой полимерной фракции, при молярном соотношении белка и блокирующего соединения 1 : 100 - 1 : 1000 соответственно. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве блокирующего используют соединение, взятое из группы производные иодуксусной кислоты, производные акриловой кислоты, непредельные производные гетероциклических соединений, циклические имины, оксираны.