Иммуносорбент Советский патент 1981 года по МПК C07G7/00 C12N11/08 G01N33/54 

(54) 1{ММУНОСОРБЕНТ

Ti3o6peTeHHe относится к области получения иммуносорбентов для иммунологических исследований. Иммуносорбенты представляют собой иммобилизованные антигены (или антитела , способные к специфическим реакциям. Переведенные в нерастворимую форму они связьшают антитела (или антигень) , которые при этом также стано вятся нерастворимыми. Отмывая затем иммуносорбент, удаляют все возможные примеси, загрязняюцц е препарат антител (или антигенаУ, которые далее, после диссоциации иммунного комплекса можно выделить в чистом виде. Одной из главных характеристик иммуносорбента является его емкость, т.е. то максимальное количество антител, которое можно извлечь одним миллилитром сорбента. Емкость в основном определяется количеством антигена, иммобилизованного на одном миллиметре носителя и стерической доступностью этого связанного антигена. Известны различные иммуносорбенты. Для их получения белок ковалентно связывают с матрицей. Сложность синтеза иммуносорбентов состоит в том, что различные антигены имеют очень широкий спектр физико-химических и иммунологических свойств, и поэтому фактически каждый антиген требует индивидуального подхода. Известен иммуносорбент, представляющий собой коллаген 1 типа, связанный с диазотированной парааминОбензилцеллюлозой (РАВ-целлюлоза l,, Указанный сорбент получают следующим образом. Парааминобензилцеллюлозу модифицируют - диазотируют смесью соляной кислоты и нитрита натрия на холоде. Затем при смешивании диазотированного производного ПАБ-целлюлозы с раствором коллагена происходит иммобилизация последнего с образованием иммуносорбента. Недостатком сорбента является его малая емкость (0,06 мг антител/мг 38 j/larena в сорбенте , поскольку не удается иммобилизовать достаточно большое количество антигена (коллагена) на единицу объема иммуносорбента. Это происходит по многим причинам. Во-пер вых, коммерческий препарат ПАБ-целлюлозы имеет малое количество параамйно бензильных групп и- они труднодоступны для таких крупных неглобулярных белков как коллаген. Во-вторых, получаемое при диазотировании активное производное ПАБ-целлюлозы не стабильно в физиологических условиях, при которых происходит иммобилизация. Кроме этого, стерические затруднения приводят также к тому, что иммобилизованны белки, имеющие малое количество антигенных детерменант, как, например, коллаген, плохо работают как иммуносорбёнты. Кроме того, изготовление им муносорбентов на основе ПАБ-целлюлозы очень трудоемко. Полученные по этому методу сорбенты мало подходят для колоночной аффинной хроматографии вслед ствие малой механической прочности, которая вызывает усадку сорбента в ко лонке и затрудняет работу с ним. Целью изобретения является новый иммуносорбент на основе коллагена 1 типа, обладающего высокой емкостью, механической прочностью и минимальной неспецифической сорбцией компонентов сывороток. Указанная цель достигается свойствами нового иммуносорбента, представляющего собой коллаген 1 типа, связан ный с модифицированным полиакриламидным гелем и имеющий следующий элементарный состав .(на сухое вещество) ,%: С 50,,02 Н 7,04±0,01 О 22,53tO,01 N 19,72±0,01 S 0,003 ±0,001 Соединение представляет собой белый водонаполненный гель с содержанием воды от 75% до 97%, слаборастворимо в диамине и не растворимо в воде, водных растворах солей, спиртах, ацетоне, эфире и уксусной кислоте. Способ получения нового иммуносорбента основан на известном методе 2 иммобилизации белков на полиакриламид ном геле, модифицированном глутаровым альдегидом и осуществляется следующим образом. Сначала проводят модификацию полиакриламидного геля, которую ведут дли тельно и в больщом избытке глутарово3го альдегида при комнатной температуре, так как амидные группы полиакриламида реагируют с альдегидами не очень активно. При использовании 3-10% глутарового альдегида в реакционной смеси за 10-30 ч при комнатной температуре достигается высокая степень модификации исходного геля. После окончания активации удаляют избыток глутарового альдегида и тщательно омывают водой активированный гель. Так как получаемое на этой стадии активное производное полиакриламида-и глутарового альдегида вполне устойчиво при физиологических условиях в широком инТ рвале температур, дальнейшую иммобилизацию коллагена с полученным ранее гелем проводят в фосфатном буфере рН 8,0-9,4 при 16-25С в течение 20-60 ч с последующим восстановлением азометиновых связей и альдегидных групп продукта. В результате степень пришивки белка подчас превьшает 90%, т.е. почти весь коллаген связывается с нерастворимой матрицей-гелем. Предлагаемый иммуносорбент позволяет сорбировать более 0,2 мг белка антител на 1 мл сорбента, что более чем втрое превышает аналогичный показатель известного сорбента. Полученный иммуносорбент отличается механической прочностью и химической стабильностью. Высокая механическая прочность обеспечивается использованием в качестве матрицы гранулированного полиакриламидного геля. Химическая стабильность связана с химической стабильностью геля-носителя и „высокой устойчивостью коллагеновых белков к различным денатурационным воздействиям, и с тем, что образовавщиеся в ходе иммобилизации относительно лабильные азометиновые связи (основания ШнФфа) в конечном продукте восстановлены. Указанные свойства позволяют в хроматографических колонках, наполненных сорбентом, обеспечить высокую скорость подачи раствора. Так, нанесение сыворотки и элюция проводятся со скоростью 1-2 мл/см, а отмывка колонки от неспецифически связавшихся белков - со скоростью 3-20 мл/см, что вдвое быстрее, чем с известным сорбентом. Сорбент выдерживает многократные обработки водными растворами буфером с рН от 2 до 11, водными растворами 8 М мочевины, 5 М гуанидина, 3,5 М роданида натрия. 5 Отмеченные химическая стабильность и механическая прочность предлагаемого иммуносорбента позволяют использовать его в различных иммунологических исследованиях лабораторий и клиник де сятки раз без заметного изменения сор ционных свойств и не перепаковывая хроматографические колонки. Предлагаемый иммуносорбент обладает также очень низкой неспецифической сорбцией (около 1,7 мкг неспецифических белков на 1 мл.сорбента). Пример 1. 60 гсухого гранулированного полиакриламидного геля (ра,змер гранул 35-75 мкм) суспендируЮ1 в 300 мл 0,15 М фосфатного буфера рН 8,5. Набухший гель занимает объем 230 мл. В суспензию вносят 150 мл 25%-ного глутарового альдегида, доводят рН до 8,0 и оставляют перемешиваться на магнитной мешалке при комна ной температуре на сутки. После этого полученньй активированный глутаровым альдегидом гель отмывают на ворон ке со стеклянным фильтром раствором хлористого натрия до полного исчезновения запаха глутарового альдегида и еще 1,5 л 0,15 М фосфатного буфера рН 9,0. Отфильтрованный насухо гель вносят в 230 мл раствора с концентрацией 2,3 мг коллагена первого типа в миллилитре фосфатного буфера 0,15 М, рН 9,0. Общий объем реакционной смеси 440 мл, в ней содержится в общей сложности 529 мг коллаге.на. После тре .суток перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре гель отфильтровывают, промывают 1 л 0,15 М фосфатного буфера рН 9,0, 1 л 1 М хло ристого натрия и снова 1 л 0,15 М фосфатного буфера рН 9,0. Охлаждают гель в 0,15 М фосфатном буфере рН 9,0 до и, насухо отфильтровав, вн сят его в охлажденный до 0°С раствор 5 г боргидрида натрия в 150 мл этого же буфера. Реакционную смесь интенсив но перемешивают на холоде магнитной мешалкой в течение 40 мин, а затем отфильтровывают. . ПолучениъпЧ восстанов ленный гель проьшвают 1 л холодного 0,15 М фосфатного буфера рН 9,0, а за тем при комнатной температуре заливают гель буфером 0,2 М глицин-НС 1 рН 2,2 для полного разложения остатков боргидрида натрия. После прекращения выделения пузырьков водоуида 1ело про мывают 1 л О,15 М фосфатного буфера рН 9,0 и затем 2 л изотонического , раствора хлористого натрия. Получает534ся 240 мл геля, пригодного для использования в качестве иммуносорбента. Один миллилитр конечного продукта содержит 2 мг иммобилизованного коллагена I типа (т.е. 90,7% введенного в реакционную смесь белка иммобилизуется на носителе . Состав сухого вещества иммуносорбента включает 50,70% углерода, 7,04% водорода, 22,53% кислорода, 19,72% азота, 0,003% серы. Полученное вещество представляет собой водонаполненный гель белого цвета, содержащий 75% воды, который не растворяется в воде, водных растворах солей и ни в каких распространенных органических растворителях за исключением диамина. Хранят полученньй иммуно- сорбент при в изотоническом растворе хлористого натрия с добавлением 0,02% азида натрия. П р и М е р 2. Условия получения соединения идентичны описаннь1М в примере 1 за исключением того, что в качестве носителя для приготовления иммуносорбента берут 5 г крупнопористого гранулированного полиакриламидного ,ч гранулированного полиакриламидного геля (с тем же размером гранулV Общий объем полученного геля составляет .. 180 мл. Полученное соединение содержит 1,1 мг иммобилизованного коллагена I типа на 1 мл геля конечного продукта. Состав сухого вещества иммуносорбента включает 50,70% углерода, 7,04% водорода, 22,53 кислорода, 19,72% азота, 0,002% серы. Полученное вещество представляет собой водонапол- ненный полиакриламидный гель, содержащий 97% воды. Как видно из примеров 1 и 2, понижение содержания сухого вещетсва в составе геля-носителя с 25% (пример l) до 3% (пример 2) приводит к снижении содержания иммобилизованного коллагена в конечном продукте из-за уменьшения количества активных групп, возникающих в результате активации матрицы. Пример 3. Условия получения соединения идентичны описанным в примере 1 за исключением времени активации носителя глутаровым альдегидом, которое в данном случае составляет 9 ч. Полученное соединение содержит 1,2 мг иммоби-тизованного коллагена 1 типа на 1 мл геля конечного продукта. Общий объем полу--.енного геля составляет 240 мл. Количество соединенногос носителем коллагена зависит o-i степени активации носителя.

Как видно из примеров 1 и 2, на свойства полученного сорбента влияет время активации носителя глутаровым альдегидом, которое должно быть не менее 10 ч. Активация длительнее 30 ч нецелесообразна, так как это не ведет к увеличению степейи пришивки коллагена к носителю.

Сорбционная активность полученных соединений иллюстрируется следующим примером.

Пример 4. 30 мл иммуносорбента, полученного в примере 1, заполняют колонку диаметром 16 мм и длиной 160 мм. Колонку с сорбентом, предварительно обработанным нормальной сывороткой, промывают 100 мл буфера 0,1 глицин-НС 1 рН 2,2, а затем изотоническим раствором хлористого натрия до нейтрального рН выходящего раствора. После этого наносится 100 мл иммунной сыворотки с титром 1:1000 по РИГА (реакция пассивной гемагглютинации) со скоростью 20-30 мл/ч, которая смывается изотоническим раствором хлористого натрия до нуля оптической Плотности при 280 нм выходящего из лонки раствора. Обычно требуете 300500 мл жидкости для полного отмывания колонки от неспецифических белков. Дл элюцйи связавшихся с сорбентом антител используют 100 мл 0,1 М буфера глицин-HGl рН 2,2 при скорости протока 5-10 мл/ч. Из 100 мл указанной иммунной сыворотки элюируется около 6 м чистых антител, причем основная их часть выходит из колонки в объеме 6-10 мл. При этом выходящие из колонки антитела растворены и изотопическом растворе хлористого натрия Heirrрального рН, не содержащем глицина. Полученные элюаты, содержащие чистые антитела, при необходимости концентрируют ультрафильтрацией и хранят замороженными при -25°С.

Формула изобретения

Иммуносорбент, представляющий собой коллаген 1 типа, связанный с модифицированным полиакриламиднЫм гелем, имeюuц й следующий элементарный состав (на сухое вещество, %: С 50,7010,02 . Н 7,04tO,01 О 22,,01 19,7210,01 S 0,,001

Белый водонаполненный гель с содержанием воды от 75 до 97%, слаборастворим в диамине и не растворим в воде, водных растворах солей, спиртах, ацетоне, эфире и уксусной кислоте.

.Источники, информации, принятые во внимание при экспертизе

Z. Ifnmupitatsforsch, 1967, 134, 4, 391-396.

1, М., 1976, изд-во

к. Мартинека. Т. МГУ, с. 184.