СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР ИЗ МИКРОБИОМА ТРЮФЕЛЬНЫХ ГРИБОВ Российский патент 2025 года по МПК C12N1/14 C12P7/6409 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к процессу получения мицелиальной биомассы грибов, выделенных из микробиома плодовых тел трюфелей.

Широко известны способы получения мицелиальных форм грибной биомассы, ориентированные на использование получаемой биомассы в пищевой или медицинской биотехнологии. В этих случаях целевыми продуктами в составе биомассы являются либо белок и вкусовые компоненты (пищевая биотехнология), либо отдельное конкретное биохимическое соединение (медицинская биотехнология). Вместе с этим в получаемой биомассе могут присутствовать ненасыщенные жирные кислоты, являющиеся антиоксидантами.

Известны способы аналоги получения биомассы мицелия грибов «ин витро» (здесь и далее «ин витро» означает: не на плантациях в почве, не в природных условиях, а как культур, выращиваемых в лабораторных или цеховых условиях) Примерами таких патентов-аналогов являются следующие: [1] [2]. Оба эти способа ориентированы на целевое получение белковой биомассы, а не на получение ненасыщенных жирных кислот (антиоксидантов). Оба эти способа предусматривают аэрацию среды при культивировании.

Аналогичным образом проводится культивирование биомассы мицелия и в тех случаях, когда заявители не указывают целью получение белка. Например, патенты [3], [4]. Режим аэрации при культивировании в этих случаях не является предметом патентования и описывается косвенно, например, как свободное поступление воздуха из атмосферы в чашки Петри с культурой: «Мицелий белых трюфелей (например, Tuber borchii или Tuber magnatum) или черных трюфелей (например, Tuber melanosporum) на первом этапе выращивают в стерильных условиях и в чашках Петри в культуральной среде, благоприятной для его роста (например, в отвержденной среде, содержащей агар). (10 г/л) с добавлением солодового экстракта (1%) или картофельно-декстрозного агара (15 г/л) с доведением рН до 6-5-7,0.» (Patent US 9277760 В2).

Известны также способы получения биомассы чистых культур трюфельных и других грибов «ин витро» методом глубинного культивирования, что означает выращивание биомассы в жидкой среде, сопровождаемое аэрацией (барботажем). В процессе глубинного культивирования грибная биомасса растет в жидкой среде в динамических условиях, где осуществляется непрерывный барботаж питательной среды воздухом. Принято считать, что постоянная аэрация энергетически (за счет поставки окислителя-кислорода) обеспечивает усиленный рост биомассы. Примеры этих способов приведены в следующих источниках: [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13].

Все перечисленные способы культивирования грибов с получением биомассы мицелия «ин витро» не рассматривают подбор культур грибов как отбор из микробиома трюфеля по продукции ненасыщенных жирных кислот; также все перечисленные способы культивирования грибов с получением биомассы мицелия «ин витро» не рассматривают продукцию ненасыщенных жирных кислот (антиоксидантов) как результат задаваемых условий культивирования по аэрации и не ставят целью снижение содержания окислителя (кислорода).

По сути ни один из способов не рассматривает в качестве патентуемого способа установление пониженных значений содержания окислителя по концентрации растворенного кислорода. Аэрация в приведенных способах-аналогах рассматривается как способ увеличения биомассы грибов, а не содержания в биомассе целевых биохимических продуктов (ненасыщенных жирных кислот).

Наиболее близким к предлагаемому способу по совокупности существенных признаков и поэтому выбранному авторами в качестве прототипа является способ по патенту US 9277760 B2 «Производство натуральных трюфельных ароматизаторов из мицелия трюфелей» [3]. В известном способе мицелий выращивают «ин витро». В соответствии с описанием этого способа в нем приведены сведения о получаемом составе биомассы трюфелей при культивировании без какого-либо ограничения доступа кислорода воздушной среды: «Мицелий белых трюфелей (например, Tuber borchii или Tuber magnatum) или черных трюфелей (например, Tuber melanosporum) на первом этапе выращивают в стерильных условиях и в чашках Петри в культуральной среде, благоприятной для его роста (например, в отвержденной среде, содержащей агар). (10 г/л) с добавлением солодового экстракта (1%) или картофельно-декстрозного агара (15 г/л) с доведением рН до 6-5-7,0.»

Недостатками этого способа прототипа в сравнении с патентуемым способом являются:

1. Отсутствие предварительного отбора культур по способности к быстрому росту и образованию ненасыщенных жирных кислот, что приводит к отсутствию гарантированной продукции ненасыщенных жирных кислот в значимых количествах.

2. Отсутствие ограничения аэрации при культивировании, что приводит к пропорционально большему окислению биохимических продуктов биомассы, то есть, соответственно меньшему содержанию недоокисленных продуктов (антиоксидантов, ненасыщенных и полиненасыщенных жирных кислот).

Задачей предлагаемого изобретения является создание такого способа получения мицелиальной биомассы грибов, выделенной из микробиома плодовых тел трюфелей, который обеспечивает повышенное содержание ненасыщенных жирных кислот в целевой биомассе.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение биомассы мицелия культур с повышенным содержанием ненасыщенных жирных кислот, выделенных из микробиома плодовых тел трюфеля.

Технический результат достигается тем, что в способе получения биомассы мицелиальных культур из микробиома трюфельных грибов, включающем выращивание «ин витро» в стерильных условиях на культуральной среде биомассы мицелиальных культур, предлагается предварительно отбирать культуры по способности к быстрому росту и образованию ненасыщенных жирных кислот, тогда как выращивание биомассы проводить в условиях пониженного содержания кислорода.

Дополнительными отличиями способа являются:

- в качестве микробиома трюфельных грибов используют Tuber magnatum (трюфель белый пьемонтский), и/или Choiromyces venosus (трюфель белый троицкий), и/или Tuber melanosporum (трюфель черный перигорский);

- в качестве культуральной среды используют смесь органических соединений, содержащую белки;

- содержание кислорода при выращивании биомассы в атмосфере камеры культивирования от 2 до 10%;

- отбирают культуры для выращивания по способности воспроизведению аутентичных культур мицелия при последовательных пассажах (пересевах) и по образованию культурами мицелия жирных кислот более 10% от веса сухой биомассы мицелия, при этом ненасыщенных жирных кислот более 30% от общего количества жирных кислот;

- выращивание биомассы проводят при температуре 22-28°С и влажности 60-80% в течение 14-30 дней.

Пример 1

Лабораторную посуду (стаканы, используемые в качестве камер культивирования) наполняли сыпучей средой Т с влажностью до 30%.

Стаканы со средой Т стерилизовали в течение 30 мин при повышенном давлении в 0,5 атм и при температуре 105°С. Простерилизованные среды засевали чистой культурой, раннее полученной путем микробиологического выделения из плодовых тел трюфельных грибов Choiromyces venosus (также Choiromyces meandriformis, трюфель белый троицкий).

Засеянные культурой стаканы со средами инкубировали при температуре 24°С в микроаэробных условиях. Микроаэробные условия достигали путем частичной герметизации камер культивирования без нарушения аутентичности засеянных культур (то есть без загрязнения другими микроорганизмами).

Рост грибов контролировали визуально. Через 14 и 28 дней роста отбирали для анализа жирных кислот.

Для проведения анализа биомассу грибов лиофилизовали (обезвоживали при пониженной температуре до сухого состояния) и метилировали.

Аналогичным образом подготавливали биомассу плодовых тел грибов, выросших в природных условиях: плодовые тела измельчали, лиофилизовали (обезвоживали при пониженной температуре до сухого состояния) и метилировали.

Анализ жирных кислот проводили принятыми методами с использованием хромато-масс-спектрометра газового Agilent 5977В GC/MSD с газовым хроматографом 7890В и с программным обеспечением, при использовании колонки HP-5MS (5% фенилметилсиликон, 30 м × 0.25 мм × 0.25 мкм).

В соответствии с возможностями метода и приборным обеспечением:

1) анализируемые жирные кислоты идентифицировали;

2) определяли соотношение (вес. %) в анализируемых жирных кислотах;

3) учитывая веса анализируемых образцов и количество жирных кислот в сравниваемых стандартах, определяли весовое содержание жирных кислот в расчете на единицу сухого вещества грибной биомассы.

Результаты анализов жирных кислот культуры, выращенных в микроаэробных условиях «ин витро» на среде Т, сравнивали с результатами анализов жирных кислот плодовых тел трюфельных грибов Ch. venosus, выросших в естественных условиях.

Результаты анализов идентификации жирных кислот и определения их соотношений в биомассе Ch. venosus (таблица 1) показали следующее:

1) биомассы культур грибов, выращенных в микроаэробных условиях «ин витро», содержали тот же и даже более богатый спектр ненасыщенных жирных кислот, что и биомассы плодовых тел, росших в естественных условиях;

2) со временем культивирования «ин витро» в выращиваемой биомассе мицелия соотношение между различными жирными кислотами изменялось.

В таблице 1 приведены данные сравнения жирнокислотного состава (вес. % от суммы анализируемых) биомассы мицелия, выращенной в микроаэробных условиях «ин витро», с биомассой природных плодовых тел грибов Ch. venosus. Жирным шрифтом в составе жирных кислот выделены ненасыщенные.

Проверка весового содержания жирных кислот в расчете на единицу сухого вещества грибной биомассы Ch. venosus в культивируемой «ин витро» грибной биомассе и в природных плодовых телах (таблица 2) показала следующее: в целом содержание жирных кислот в единице сухой биомассы, культивируемой «ин витро», за 28 дней роста увеличивалось и превышало содержание в природных плодовых телах.

В таблица 2 приведены данные сравнения содержания жирных кислот (вес. % от сухой биомассы) биомассы мицелия, выращенной в микроаэробных условиях «ин витро», с биомассой природных плодовых тел грибов Ch. venosus в зависимости от времени культивирования.

Пример 2

Пример 2 отличается от Примера 1 объектом, а именно: видом трюфельного гриба. В примере 2 простерилизованные среды засевали чистой культурой, раннее полученной путем микробиологического выделения из трюфельных грибов Tuber magnatum (трюфель белый пьемонтский).

Все условия и процедуры культивирования и анализов в Примере 2 те же, что и в Примере 1.

Результаты исследований и анализов по Примеру 2 представлены в таблицах 3 и 4.

В таблице 3 приведены данные сравнения жирнокислотного состава (вес. % от суммы анализируемых) биомассы мицелия, выращенной в микроаэробных условиях «ин витро», с биомассой природных плодовых тел грибов Tuber magnatum. Жирным шрифтом в составе жирных кислот выделены ненасыщенные.

В таблице 4 приведены данные сравнения содержания жирных кислот (вес. % от сухой биомассы) биомассы мицелия, выращенной в микроаэробных условиях «ин витро», с биомассой природных плодовых тел грибов Tuber magnatum в зависимости от времени культивирования и варианта среды культивирования «ин витро».

Результаты анализов идентификации жирных кислот и определения их соотношений в биомассе Tuber magnatum (таблица 3) показали то же, что и в Примере 1, а именно:

1) биомассы культур грибов, выращенных в микроаэробных условиях «ин витро», содержали тот же и даже более богатый спектр ненасыщенных жирных кислот (в том числе омега-ненасыщенных жирных кислот), что и биомассы плодовых тел, росших в естественных условиях;

2) со временем культивирования «ин витро» в выращиваемой биомассе соотношение между различными жирными кислотами, включая омега-ненасыщенные жирные кислоты, изменялось.

Проверка весового содержания жирных кислот в расчете на единицу сухого вещества грибной биомассы в культивируемой «ин витро» грибной биомассе и в природных плодовых телах (таблица 4) показала то же, что и в Примере 1, а именно: в целом содержание жирных кислот в единице сухой биомассы, в том числе омега-ненасыщенных жирных кислот в культивируемой «ин витро» биомассе, за 28 дней культивирования увеличивалось и превышало содержание в природных плодовых телах.

Заключение по примерам 1-2

Использование предлагаемого способа выращивания «ин витро» биомассы мицелия культур, выделенных из микробиома плодовых тел трюфелей, по сравнению со способом-прототипом позволяет получить более высокое содержание в биомассе биологически активных ненасыщенных жирных кислот (антиоксидантов).

Виды трюфельных грибов Tuber magnatum и Choiromyces venosus относятся к разным родам семейства Tuberaceae (Трюфельные), таким образом, применимость метода к двум разным родам семейства трюфельных свидетельствует о возможности его применения к разным видам этой группы. В качестве дополнительной проверки предлагаемый способ с аналогичным положительным результатом был опробован заявителями при выделении целевой мицелиальной культуры, образующей ненасыщенные жирные кислоты, из плодового тела трюфеля Tuber melamosporum (трюфель черный перигорский).

Предлагаемый способ может быть использован для продукции грибной биомассы с высоким содержанием ненасыщенных жирных кислот (антиоксидантов). Выращенная биомасса и/или получаемые из нее антиоксиданты могут быть использованы в качестве сырья для косметической продукции, а также в качестве кормовых или пищевых добавок.

Использованная патентная и научно-техническая литература:

[1] Способ получения белковой биомассы гриба. Патент RU 2189395 С2. Опубл. 20.09.2002. Бюл. №26.

[2] Способ получения грибной белковой биомассы. Патент RU 2511041 С1. Опубл. 10.04.2014. Бюл. №10.

[3] Production of natural truffle flavours from truffle mycelium. Patent US 9277760 B2, дата приоритета 26.04.2012, дата приоритета вне США 03.07.2009: WO 2011/001349 А1.

[4] Способ производства грибов. Патент RU 2689951, дата начала отсчета срока действия патента 30.09.2016, конвенционный приоритет: 01.10.2015 IT 102015000057159.

[5] Бухало А.С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре. Киев: Наукова думка, 1988, 144 с.

[6] Liu Q.N., Liu R.S., Wang Y.H., Mi Z.Y., Li D.S., Zhong J.J., Tang Y.J. Fed-batch fermentation of Tuber melanosporum for the hyperproduction of mycelia and bioactive Tuber polysaccharides. Bioresour. Technol. 2009. V. 100 (14): 3644-3649.

[7] Дедюхина Э.Г., Чистякова Т.П., Вайнштейн М.Б. Биосинтез арахидоновой кислоты микромицетами (обзор). Прикладная биохимия и микробиология, 2011, т. 47 (2), с. 125-134.

[8] Способ получения грибной белковой биомассы. Патент RU 2511041 C1, дата приоритета 10.09.2012.

[9] Dedyukhina E.G., Chistyakova T.I., Kamzolova S.V., Vinter M.V., Vainshtein M.B. Arachidonic acid synthesis by glycerol-grown Mortierella alpina. European Journal of Lipid Science and Technology. 2012. V. 114: 833-841.

[10] Dedyukhina E.G., Chistyakova T.I., Mironov A.A., Kamzolova S.V., Morgunov I.G., Vainshtein M.B. Arachidonic acid synthesis from biodiesel-derived glycerol by Mortierella alpina. European Journal of Lipid Science and Technology. 2014. V. 116 (4): 429-437.

[11] Дедюхина Э.Г., Чистякова Т.П., Миронов А.А., Камзолова С.В., Минкевич И.Г., Вайнштейн М.Б. Влияние рН, аэрации и температуры на синтез арахидоновой кислоты Mortierella alpine. Прикладная биохимия и микробиология. 2015. Т. 51 (2). С. 243-250.

[12] Способ получения белковой биомассы базидиального гриба Pleurotus pulmonarius. Патент RU 2588474 C1, дата приоритета 11.03.2015.

[13] Tang Y.J., Liu R.S., Li Н.М. Current progress on truffle submerged fermentation: apromising alternative to its fruiting bodies. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2015. V. 99: 2041 2053.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения биомассы мицелиальных культур из микробиома трюфельных грибов, включающий выращивание «ин витро» в стерильных условиях на культуральной среде биомассы мицелиальных культур, при этом предварительно отбирают культуры при последовательных пассажах-пересевах по способности к быстрому росту и образованию культурами мицелия жирных кислот более 10% от веса сухой биомассы мицелия и ненасыщенных жирных кислот более 30% от общего количества жирных кислот. Выращивание биомассы проводят при 22-28°C в условиях содержания кислорода от 2 до 10% и влажности 60-80% в течение 14-30 дней. В качестве культуральной среды используют смесь органических соединений, содержащую белки. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способов получения биомассы мицелия, выделенного из микробиома трюфельных грибов, с повышенным содержанием ненасыщенных жирных кислот. 1 з.п. ф-лы, 4 табл., 2 пр.

1. Способ получения биомассы мицелиальных культур из микробиома трюфельных грибов, включающий выращивание «ин витро» в стерильных условиях на культуральной среде биомассы мицелиальных культур, отличающийся тем, что предварительно отбирают культуры при последовательных пассажах-пересевах по способности к быстрому росту и образованию культурами мицелия жирных кислот более 10% от веса сухой биомассы мицелия, при этом ненасыщенных жирных кислот более 30% от общего количества жирных кислот, а выращивание биомассы проводят в условиях пониженного содержания кислорода от 2 до 10% при температуре 22-28°C и влажности 60-80% в течение 14-30 дней; а в качестве культуральной среды используют смесь органических соединений, содержащую белки.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве микробиома трюфельных грибов используют Tuber magnatum (трюфель белый пьемонтский), или Choiromyces venosus (трюфель белый троицкий), или Tuber melanosporum (трюфель черный перигорский).