СТАБИЛИЗИРУЮЩАЯ СРЕДА ДЛЯ α-GST В МОЧЕ И СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА α-GST В МОЧЕ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/68 G01N33/573 

Изобретение относится к стабилизирующей среде для альфа-глутатионовой S-трансферазы ( (α-GST) в моче и использованию ее в иммуноферментном анализе на α-GST.

Предпосылки к созданию изобретения
Глутатионовые трансферазы (GST) являются ферментами, которые обнаружены в самых разнообразных количествах в тканях человека. Эти ферменты образуют три основных класса, обозначенные α, π и μ. Эти три класса ферментов значительно отличаются по своим свойствам.

α-GST обнаружена в области проксимального канальца почки и выделяется в мочу у здоровых индивидуумов, как подтверждается иммуноферментным анализом и анализом вестерн-блоттинга (Campbell, J.A.H. et аl. (1991) Cancer (Philadelphia), 67, 1608-1613). Любое явление, которое ускоряет повреждение проксимального канальца, может привести к выделению α-GST в мочу в количествах, превышающих нормальный уровень. Таким образом, повышение уровней α-GST в моче может служить признаком повреждения проксимального канальца (Sherman, R.А. et аl. (1985) Uremla Investigation, 8, 111-115). Недавние работы показали, что вызванное цисплатином повреждение проксимального канальца у крыс Wistar, связано с повышенными уровнями активности мочевой α-GST и пониженным клиренсом креатинина сыворотки (Stojanov, М. et аl. (1994) Clin. Chem. , 14, 1125), и что острый некроз канальца и инфаркт почечного трансплантанта у человека дают быстрое повышение уровней как α-GST, так π-GST (Sundberg, A.G.M. et al. (1994) Nephron 67, 308-316).

Возможность использования мочи в качестве образца жидкости организма для определения и установления фермента, являющегося признаком нарушений в почке и, в частности, в конкретной области почки, представляет собой существенное преимущество, особенно потому, что не требуется инвазивного сбора образца организма. Обычно требуется оценить уровень α-GST у тяжело больных людей, при этом очень желательно не причинять им лишних травм.

Обычно для оценки α-GST в моче использовался радиоиммуноанализ с присущими ему недостатками, связанными с использованием вещества, меченного радиоактивным изотопом.

Часто невозможно осуществить необходимую оценку α-GST в моче за значительный промежуток времени, например, несколько дней, после того, как был собран образец. Соответственно, часто необходимо хранить образцы мочи при очень низких температурах, обычно порядка -20^oC. Однако, обнаружено, что хранение мочи при таких низких температурах приводит к потере иммунореактивности α-GST и, таким образом, низкой чувствительности любого иммуноанализа. Эта потеря иммунореактивности, скорее всего, связана с денатурацией при замораживании с последующим оттаиванием.

Соответственно, есть необходимость в среде, дающей возможность сохранять α-GST в моче при температурах порядка -20^oC без существенных потерь иммунореактивности α-GST в иммуноанализе, применяемом для определения α-GST.

B соответствии с вышеизложенным изобретение направлено на создание стабилизирующей среды для GST в моче, которая содержит стабилизирующее количество неферментного белка, хелатирующий агент и буфер, так чтобы среда имела pH в диапазоне 7.0-7.5 и была способна предотвратить потерю иммунологической активности α-GST.

Стабилизирующая среда по данному изобретению может быть использована для хранения образцов мочи при температурах порядка - 20 ϒ SOO ϒ TC без какой-либо потери иммунореактивности. Однако, кроме того, было обнаружено, что стабилизирующая среда по данному изобретению улучшает иммунореактивность, будучи добавленной к свежей моче, которая хранится временно, до проведения анализа, при 2-8 ϒ SOO ϒ TC не более двух часов.

Предпочтительно, неферментный ( α-GST) белок является альбумином.

Белок может быть смесью альбумина и гидролизованного желатина. Гидролизаты такого желатина имеются на рынке и могут быть приобретены, например, у Sigma Chemicals (Код G-0262, ферментативно образованный).

Особо предпочтительным альбумином (негидролизованным) является альбумин сыворотки, особенно альбумин бычьей сыворотки (BSA).

Предпочтительной смесью альбумина сыворотки и гидролизованного желатина является смесь равных количеств (w/v) альбумина бычьей сыворотки и гидролизата желатина.

Концентрация неферментного белка является приемлемой в диапазоне 5-15% w/v, а более конкретно - порядка 10% w/v.

Хелатирующим агентом может быть соль щелочного металла EDTA. Приемлемая концентрация соли стабилизирующей среды может быть в диапазоне 4-5% w/v. Наиболее приемлемы соли или соли щелочных металлов, а еще более предпочтителен хлорид натрия.

Включение соли типа хлорида натрия способствует растворению альбумина и/или гидролизата желатина или других используемых неферментных белков, которые имеют необходимые стабилизирующие свойства.

Не вдаваясь в какие-либо теоретические объяснения изобретения, можно отметить, что считается, что соль может действовать путем снижения "фона" анализа, т.е. неспецифического связывания.

Приемлемая стабилизирующая среда может также включать в себя ингибитор протеазы. Предпочтительным ингибитором протеазы является ингибитор трипсина типа апротинина.

Приемлемым буфером является цвиттерионный буфер такого типа, как описанный в работе N. E.Good and S.lzawa ((1972) Methods in Enzymol., 24, Part B, 53). Особенно приемлемым буфером является HEPES при pH 7.3.

Стабилизирующая среда по данному изобретению может также включать другие добавки, например, различные антимикробные агенты или консерванты.

Приемлемые консерванты включают азид натрия, и консерванты, содержащие меркуротиолат, также известны как тиомерсал и тиомеросал.

Стабилизирующая среда по данному изобретению смешивается перед хранением с образцом мочи, который должен подвергаться анализу на α-GST после хранения при -20^oC в течение определенного периода времени.

Изобретение также обеспечивает способ количественного определения α-GST в моче, который включает в себя взаимодействие образца мочи с нерастворимой формой анти-α-GST lgG, причем образец мочи предварительно обрабатывается стабилизирующей средой, описанной выше, определение количества α-GST, связанного с анти-α-GST lgG, посредством контакта связанного GST с анти-α-GST lgG, меченным ферментом, и измерение активности метки фермента.

Стабилизирующая среда по данному изобретению позволяет достичь чувствительности при иммуноанализе на мочевую α-GST, которая близка к чувствительности иммуноанализа, проводимого на образцах свежей мочи. В отличие от случая, когда образцы мочи хранятся при -20^oC при отсутствии стабилизирующей среды, здесь фактически отсутствует потеря иммунореактивности, что является следствием хранения таких образцов в присутствии стабилизирующей среды по данному изобретению, как это показано далее на примерах.

Предпочтительной меткой фермента является пероксидаза, а более конкретно - пероксидаза хрена.

Другим предпочтительным конъюгатом пероксидазы является, комплекс биотинилированного авидина (включает стрептавидин) с пероксидазой, который может быть использован с антитело-биотиновым конъюгатом для амплификации ферментного анализа обычным способом. При таком ферментном анализе антиген в нерастворимой форме на твердофазном антителе связывается с антитело-биотиновым конъюгатом, который, в свою очередь, связывается с биотинилированным авидин/стрептавидин-пероксидазным комплексом, посредством которого измеряется активность пероксидазы.

Далее, предпочтительно, чтобы конъюгат анти-α-GST lgG-HRP, использующийся при иммуноферментном анализе, находился в жидкостной стабильной форме в стабилизирующей среде, содержащей стабилизирующее количество цитохрома с и стабилизирующее количество альбумина сыворотки, поверхностно-активное вещество, полиол и буфер, так чтобы среда имела pH порядка 6.5 и чтобы окончательная концентрация полиола была в диапазоне 5-15% w/v.

Цитохром с предпочтительно присутствует в количестве 0.02-2% в соотношении массы и объема. Тогда, как увеличение концентрации цитохрома с более чем до 2% в соотношении массы и объема не оказывает существенного влияния на стабилизацию, уменьшение концентрации ниже 0.02% приводит к снижению стабилизирующего эффекта буфера.

Под цитохромом с здесь понимается цитохром, в котором имеются ковалентные связи между боковыми цепями части гема и белком.

Стабилизирующим белком является предпочтительно альбумин сыворотки, который присутствует в количестве 0-5-2% в соотношении массы и объема.

Особо приемлемым альбумином сыворотки является альбумин бычьей сыворотки (BSA). Тогда, как увеличение количества BSA более чем до 2% в соотношении массы и объема не оказывает существенного влияния на стабилизацию, как и в случае с цитохромом с, уменьшение концентрации ниже 0.5% приводит к снижению стабилизирующего эффекта буфера.

Альбумин сыворотки может быть дополнен также стабилизирующим белком, например, эмбриональной телячьей сывороткой, которая богата BSA.

Поверхностно-активным веществом является предпочтительно неионогенное поверхностно-активное вещество, выбранное из полиоксиэтиленовых сложных эфиров жирных кислот, полиоксиэтиленовых сорбитановых сложных эфиров, полиоксиэтиленовых спиртов, полиоксиэтиленовых изоспиртов, полиоксиэтиленовых простых эфиров, полиоксиэтиленовых сложных эфиров, полиоксиэтилен-p-t-октилфенолов или конденсатов оксида октилфенил-этилена, конденсатов оксида этилена с жирными спиртами, полиоксиэтиленовых нонилфенолов, смесей полиалкиленовых гликолей или их смеси.

Особо предпочтительные неионогенные поверхностно-активные вещества включают: полиэтиленовые сорбитановые сложные эфиры под торговой маркой Tween, особенно полиоксиэтиленовый сорбитановый монолаурат или Tween 20, но также и Tween 60 и Tween 80; полиоксиэтиленовые простые эфиры под торговой маркой Triton, например, Triton X100, Triton Х114, Triton X110E и Triton N1, а также Brij; конденсат оксида октилфенил-этилена под торговой маркой Nonidet Р40; конденсаты оксида этилена жирных спиртов под товарной маркой Lubrol, особенно Lubrol PX; и смесь одной весовой части полиэтиленового гликоля и четырех весовых частей полипропиленового гликоля под торговой маркой Synperonic F108. (Tween, Triton, Brij, Nonidet, Lubrol и Synperonic являются товарными марками).

Наиболее приемлемым поверхностно-активным веществом является Synperonic F108.

Полиол стабилизирует взаимодействия по типу белок-белок. Приемлемые полиолы включают в себя глюкозу, глицерин, маннит, сорбит и сахарозу, или их смесь. Особо предпочтительным полиолом является глицерин с окончательной концентрацией порядка 10% w/v.

Особенно приемлемым буфером является забуфренный фосфатом физиологический раствор.

Стабилизирующая среда для анти-α-GST lgG-HRP-конъюгата может также включать другие добавки в зависимости от характера ферментного конъюгата, например, различные антимикробные агенты, консерванты и ингибиторы протеазы, вещества, которые стабилизируют взаимодействия по типу белок-белок, антиоксиданты и красящие вещества, способствующие идентификации.

Приемлемым антимикробным агентом является гентамицин.

Приемлемые консерванты включают в себя консерванты, содержащие меркуротиолат, известный также как тиомерсал или тиомеросал.

Приемлемым ингибитором протеазы является, например, такой ингибитор трипсина, как апротинин.

Приемлемым красящим веществом является карминовый краситель.

Далее изобретение будет проиллюстрировано на следующих примерах.

Лучший способ осуществления данного изобретения
Пример 1
Стабилизирующая среда для мочевой α-GST с pH 7.3 была приготовлена из следующих реагентов:
Реагенты
HEPES - 0.5 М
Na₂ EDTA - 10 mM
NaCl - 4.5% (w/v)
BSA - 5% (w/v)
Гидролизат желатина - 5% (w/v)
Апротинин - 10 mg/ml
Тиомерсал - 0.01% (w/v)
Азид натрия - 0.05% (w/v)
Все вышеуказанные компоненты были добавлены к 80% от окончательного объема деионизированной воды, и pH установлен 7.3 при помощи NaOH. Затем раствор был приведен к окончательному объему при добавлении деионизированной воды. В случае добавления BSA и гидролизата желатина важно, чтобы они добавлялись раздельно, причем первый компонент должен полностью раствориться до того, как будет добавлен второй компонент.

Стабилизирующая среда, приготовленная таким образом, используется для стабилизации мочевой α-GST путем добавления одной части среды к четырем частям мочи (1/5 раствора), медленного перемешивания и замораживания образца при -20^oC, или временного хранения, до проведения анализа, при 2-8^oC не более двух часов.

Пример 2
Стабилизирующая среда для анти-α-GST lgG-HRP-конъюгата с pH 6.5 была приготовлена из следующих реагентов:
Реагент - Количество
NaCI - 8.000 g
NaH₂ PO₄•2H₂O - 0.260 g
Na₂ H₂PO₂•2Н₂O - 1.425 g
Цитохром с - 0.250 g
Symperonic F108 - 10.000 g
BSA - 10.000 g
Эмбриональная телячья сыворотка - 25.000 ml
Тиомерсал - 0.100 g
Гентамицин - 0.100 g
Карминовый краситель - 0.930 g
Концентрированный HCl (для корректировки pH) - Переменное
Деионизированная вода - Переменное
Доводится до 1000 мл добавлением деионизированной воды.

700 мл деионизированной воды было добавлено в стеклянный резервуар. Затем были добавлены NaCI, NaH₂ Р0₄•2H₂О, Na₂ H₂ PO₄•2H₂О и тиомерсал при перемешивании до растворения реагентов. Затем к раствору был добавлен Synperonic F108 при перемешивании до растворения поверхностно-активного вещества. Затем был проверен pH раствора и установлен 6-5 посредством 5М HCl. Затем к раствору был добавлен BSA до его растворения. Затем была добавлена эмбриональная телячья сыворотка с последующим перемешиванием до растворения. Затем были добавлены гентамицин, цитохром с и карминовый краситель с последующим перемешиванием до растворения. Затем вновь был проверен pH и откорректирован до 6.5. Окончательный объем был доведен до 1000 мл, и буфер был отфильтрован через фильтр 0.2 мк и готов для хранения. При использовании девять частей буфера добавляются к одной части глицерина.

Пример 3
Устойчивость анти-α-GST lgG-HRP-конъюгата, имеющегося в настоящее время в лиофилизированном виде в наборе для иммуноферментного анализа, поставляемого фирмой Biotrin International Limited под торговой маркой Nephkit, была исследована в стабилизирующей среде, приготовленной как это описано в Примере 2. Анализ с Nephkit обеспечивает способ количественного определения α-GST в моче и может служить показателем повреждения проксимального канальца в почке.

100%-ная устойчивость концентрата 10 x была достигнута, когда конъюгат хранился в течение двадцати четырех часов при комнатной температуре в стабилизирующей среде, приготовленной в соответствии с Примером 2.

Пример 4
Использование стабилизирующей среды по Примеру 1 для стабилизации мочевой α-GST при хранении при -20^oC
Девять образцов мочи (мужской и женской) были сразу по получении подвергнуты анализу на α-GST с использованием набора для иммуноферментного анализа, поставляемого фирмой Biotrin International Limited, Mount Merrion, County Dublin, Ireland, под торговой маркой Nephkit. Результаты представлены в колонке 2 Таблицы 1.

Затем образцы были разделены, и стабилизирующая среда, приготовленная в соответствии с Примером 1, добавлена к образцам одной партии (-20^oC (SM)) и не добавлена к образцам другой партии (-20^oC).

Образцы выдерживались при -20^oC в течение трех дней, после чего они были подвергнуты анализу с использованием Nephkit.

Было обнаружено, что показатели образцов, хранившихся при - 20^oC в стабилизирующей среде, были близки к первоначально полученным данным (свежие образцы при 400). Однако, все образцы, замороженные без стабилизирующей среды, показали снижение иммунореактивности. Как указано выше, эта потеря иммунореактивности, вероятно, обусловлена денатурацией при замораживании и оттаивании.

Пример 5
Стабилизация образцов мочи с α-GST
Два образца мочи, A и B, каждый из которых был поделен на пять частей, уровни α-GST в которых были доведены до 10, 25, 50, 100 и 500 ng/mg, затем хранились в присутствии стабилизирующей среды по Примеру 1 в течение двух дней при 4^oC и - 20^oC. Результаты представлены в Таблицах 2 и 3.

Из результатов, представленных в Таблицах 2 и 3, явствует, что присутствие стабилизирующей среды защищает GST от потери иммунологической активности, что облегчает определение при использовании иммуноферментного анализа.

Пример 6
Два образца, обозначенные C 200 и D 200, были приготовлены с содержанием 200 ng/mI α-GST, и стабилизирующая среда по Примеру 1 была добавлена в каждый образец.

Каждый из двух образцов был затем разделен, и полученные разделенные образцы в каждом случае хранились при 4^oC и -20^oC.

После хранения в течение двух дней каждый из образцов был подвергнут анализу при разной степени разбавления (1/40 -1/320) в растворителе с использованием метода анализа с Nephkit, описанного в Примере 4.

Результаты представлены в Таблицах 4 и 5.

Из данных, представленных в таблицах 4 и 5, явствует, что степень разбавления образца не влияет на определение GST, и что хранение при -20^oC гораздо предпочтительнее хранения при 4^oC.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения количества α-глутатионовой-S-трацсферазы в моче с помощью иммуноферментного анализа. Стабилизирующая среда для α-GST содержит стабилизирующее количество неферментного белка, например, смесь равных количеств альбумина бычьей сыворотки и гидролизата желатина, хелатирующий агент и буфер. Величина рН среды колеблется в диапазоне 7,0-7,5. Для определения количества α-GST в моче исследуемый образец сначала обрабатывают стабилизирующей средой для эффективного предотвращения потери иммунологической активности α-GST. После обработки осуществляют контактирование пробы мочи с нерастворимой формой анти-α-GSTJgG. Определение количества α-GST, связанного с анти-α-GST JgG, осуществляют посредством контакта, связанного α-GST с меченым ферментом анти-α-GST JgG, и измерением активности ферментной метки. Стабилизирующая среда может использоваться для хранения образцов мочи при температурах порядка -20^oC без какой-либо потери иммунореактивности α-GST, которая наблюдается в образцах, которые хранились без такой стабилизирующей среды, также улучшает иммунореактивность α-GST, будучи добавленной к свежей моче, которая хранится временно, до проведения анализа, при 2-8^oС не более двух часов. 2 с. и 16 з. п.ф-лы, 5 табл.

1. Стабилизирующая среда для α-GST в моче, отличающаяся тем, что она содержит стабилизирующее количество неферментного белка, хелатирующий агент и буфер и имеет pH в диапазоне 7,0 - 7,5 для эффективного предотвращения потери иммунологической активности альфа-глутатионовой S-трансферазы (α-GST). 2. Стабилизирующая среда по п.1, отличающаяся тем, что неферментный белок представляет собой альбумин. 3. Стабилизирующая среда по п.1 или 2, отличающаяся тем, что неферментный белок представляет собой смесь альбумина и гидролизованного желатина. 4. Стабилизирующая среда по п.3, отличающаяся тем, что указанная смесь представляет собой смесь альбумина сыворотки и гидролизованного желатина. 5. Стабилизирующая среда по п.3 или 4, отличающаяся тем, что указанная смесь представляет собой смесь в равном процентном соотношении веса и объема альбумина бычьей сыворотки и гидролизата желатина. 6. Стабилизирующая среда по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что концентрация неферментного белка составляет порядка 10% веса к объему. 7. Стабилизирующая среда по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что хелатирующий агент представляет собой соль щелочного металла ЕДТА. 8. Стабилизирующая среда по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит соль, концентрация которой находится в диапазоне 4 - 5% веса к объему. 9. Стабилизирующая среда по п.8, отличающаяся тем, что указанная соль представляет собой соль щелочного металла. 10. Стабилизирующая среда по п.8 или 9, отличающаяся тем, что указанная соль представляет собой хлорид натрия. 11. Стабилизирующая среда по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что она дополнительно включает в себя ингибитор протеазы. 12. Стабилизирующая среда по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что указанный буфер представляет собой буфер цвиттериона. 13. Стабилизирующая среда по п.12, отличающаяся тем, что указанный буфер представляет собой HEPES. 14. Стабилизирующая среда по любому из предыдущих пунктов, отличающаяся тем, что указанный буфер имеет pH 7,3. 15. Способ определения количества альфа-глутатионовой S-трансферазы (α-GST) в моче, включающий измерение активности ферментной метки с использованием меченого фермента, отличающийся тем, что осуществляют контакт образца мочи, предварительно обработанного стабилизирующей средой по любому из пп. 1 - 14, с нерастворимой формой анти-α-GST IgG, определение количества α-GST, связанного с анти-α-GST IgG, посредством контакта, связанного α-GST с меченым ферментом анти-α-GST IgG. 16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что указанная ферментная метка представляет собой пероксидазу. 17. Способ по п.15 или 16, отличающийся тем, что указанная пероксидаза представляет собой пероксидазу хрена. 18. Способ по п.17, отличающийся тем, что анти-α-GST IgG - HRP конъюгат находится в жидкостной стабильной форме в стабилизирующей среде, содержащей стабилизирующее количество цитохрома C и стабилизирующее количество альбумина сыворотки, поверхностно-активное вещество, полиол и буфер, при этом указанная среда имеет pH порядка 6,5, а окончательная концентрация полиола находится в диапазоне 5 - 15% веса к объему.