Область назначения изобретения
Это изобретение относится к способу определения или обнаружения присутствия вещества, полученного из органа-донора, в биологической жидкости, указывающего на поражение органа-донора после ксенотрансплантации.
Уровень техники
В настоящее время во всем мире существует нехватка органов-доноров для аллотрансплантации (например, печень, почка и сердце), и было предложено и показано, что эту проблему можно преодолеть, хотя и временно, путем использования органов животных до ортотопической трансплантационной хирургии. Чари Р. С. и др. ("The New England Journal of Medicine" (1994), том 33, N 4, стр. 234-237) лечили печеночную недостаточность путем перфузии печени свиньи ex vivo с последующей ортотопической трансплантацией печени. Один пациент получил стабилизацию на 10 дней и затем подвергся успешной ортотопической трансплантации печени. Однако предыдущие попытки межвидовой трансплантации органов (ксенотрансплантации) не были успешными из-за феномена, известного как сверхострое отторжение, поскольку вновь пересаженный орган подавляется и отторгается иммунной системой реципиента в течение нескольких часов после трансплантации в реципиента. Последние успехи в области молекулярной генетики сделали возможным появление трансгенных животных (в основном свиней), чьи органы подвергаются генной инженерии, чтобы быть менее иммуногенными при пересадке в другие виды (т.е. примат человек/примат не человек) (Transplant News (1995); том 5, N 9). В этом сообщении постулируется, что иммунологическая толерантность достигается экспрессией гена человека "фактор ускорения распада" в трансгенном органе, который предотвращает активацию в реципиенте комплементных компонентов (например, комплекса Cb3) и поэтому сводит к минимуму сверхострое (гиперострое) отторжение. Однако, как и в случае межвидовой трансплантации органов (аллотрансплантация), отторжение ксенотрансплантата все еще остается проблемой, которую должен решать врач-трансплантатор, и она еще более осложняется тем очевидным фактом, что в реципиенте, подвергнутом трансплантации, присутствуют ткани различных видов.
Традиционные тесты функции печени не способны выявить различие между веществами, полученными из органов донора и реципиента (например, свиньи и человека). Например, измерения сывороточных аланин аминотрансферазы (ALT)/ аспарат аминотрансферазы (AST) не позволяют выявить различия между ферментами свиньи и человека, тем самым делая тщетной любую попытку идентифицировать ферментный источник пост-трансплантата. Аналогичная ситуация будет иметь место в случае анализа ксенотрансплантата почки. Фактически, сейчас нет общепринятого белкового маркера целостности почки.
S-трансферазы глютатиона (GST) представляют собой мультигенное семейство белков, состоящее в основном из изоформ альфа ( α GST), мю ( μ GST), пи ( π GST) и тета-класса ( Θ GST), как они определены изоэлектрической точкой, которые отвечают за детоксикацию целого набора ксенобиотиков, в основном посредством образования конъюгатов с глютатионом (Беккет Дж.Дж. и Хейс Дж.Д., "Advances in Clinical Chemistry" (1993); 30, 281-380). У людей равномерное печеночное распределение α GST в печени вместе с относительно высоким содержанием в печени и коротким периодом полувыведения плазмы (примерно 1 час) означает, что этот фермент более чувствителен, чем аминотрансферазы в качестве индикатора статуса печени после трансплантации и вызванного лекарствами повреждения печени.
В EP-A 0 640 145 раскрывается способ, который помогает при ранней диагностике отторжения у реципиента трансплантата печени и который включает в себя измерение увеличения содержания α GST в плазме или сыворотке у реципиента в отсутствие любого изменения трансаминазы плазмы или сыворотки или до такого изменения.
S-трансфераза пи-глютатиона локализуется в цитоплазме эпителиальных клеток желчного протока в печени и, как считается, существует только в гомодимерной форме. Такое гетерогенное распределение GST в печени говорит о том, что разные изоферменты имеют уникальные функции in vivo в разных участках печени, и потому можно сделать вывод, что измерение содержания GST в плазме или желчи облегчит отслеживание статуса печени человека. Аналогичное уникальное распределение также существует в почечных тканях, где α GST находится в проксимальной области трубочки, a π GST сосредоточена в периферической области трубочки нефрона (Кэмпбелл Дж. А. Х. и др., "Рак" (Филадельфия) (1991); 67, 1608-1613). В опубликованном недавно сообщении предлагалось использовать одновременное обнаружение α/π GST в моче человека для выявления различия между нефротоксичностью циклоспорина A и отторжением трансплантата, соответственно, благодаря специфичному к расположению характеру соответствующего поражения ткани (Сандберг А.Дж.М. и др., "Нефрон", (1994); 67, 306-316.
Соответственно, существует необходимость в способе различения между веществами реципиента и полученными от трансплантата как средство обнаружения повреждения органа трансплантата или, на самом деле, для проведения различия между повреждением органа реципиента или/и трансплантата.
Раскрытие изобретения
Изобретение предусматривает способ определения или обнаружения присутствия полученного из органа-донора вещества, в принципиально лишенной донора биологической жидкости, в присутствии или отсутствие соответствующего вещества реципиента, указывающего на повреждение органа донора после ксенотрансплантации, что позволяет идентифицировать повреждение органа ксенотрансплантата в этом реципиенте, причем этот способ включает в себя захват или обнаружение этого донора антителом, которое:
а) специфично для полученного из органа-донора вещества; или
б) способно к вступлению в перекрестную реакцию с этим полученным из органа-донора веществом;
и непосредственное или косвенное определение полученного из органа-донора вещества.
Соответственно, способ согласно изобретению позволяет найти различие между полученными от реципиента и полученными от донора веществами и тем самым получить указание на статус ксенотрансплантата и, возможно, отторжение, так что можно предпринять соответствующую корректирующую терапию, как только полученное из органа-донора вещество идентифицировано в биологической жидкости реципиента, как будет подробнее продемонстрировано ниже.
Под биологической жидкостью здесь имеются в виду, например, такие имеющиеся в организме жидкости как желчь, плазма, сыворотка и моча, а также средства поддержки тканей и перфузаты. Здесь также биологические жидкости в общем случае называются матрицами.
При указании "полученным из органа-донора" здесь имеются в виду органы как таковые, а также ткани и клетки, являющиеся их составными частями или полученные из них.
Аналогичным образом, под материалом донора здесь имеются в виду органы как таковые, а также ткани и клетки, являющиеся их составными частями или полученные из них.
Таким образом, как пример, материалом донора может быть печень, часть печени, такая как доля печени или гепатоциты. Обычно, в случае гепатоцитов будет использоваться кассета гепатоцитов.
В общем случае, реципиентом будет человеческое существо или примат, не являющийся человеком.
Соответственно, материал донора предпочтительно будут получать из примата, не человека, или из животного, такого как свинья, которая физиологически и биохимически аналогична человеческому существу.
Животное-донор может быть трансгенным животным.
Ксенотрансплантация может быть in vivo или ex vivo.
Удобно, чтобы подвергающийся ксенотрансплантации орган был сердцем, почкой или печенью.
Предпочтительно, чтобы полученное из органа-донора вещество было белком, в частности ферментом.
Предпочтительно полученное из органа-донора вещество будет специфическим для донора. В том случае, если имеется соответствующее вещество реципиента, предпочтительно, чтобы вещество реципиента имело низкую степень гомологии с этим полученным из органа-донора веществом. Однако, полученное из органа-донора вещество может иметь высокую степень гомологии (например, более 80% гомологии) с соответствующим веществом реципиента и, тем не менее, быть обнаруживаемым в соответствии с изобретением, как описано ниже.
Предпочтительный фермент - это S-трансфераза глютатиона, конкретнее α GST.
Далее, предпочтительно определение выделенного из органа-донора вещества производить посредством иммунологического анализа. Пригодные методы иммунологического анализа включают в себя иммунологические анализы ферментов.
Таким образом, в случае наличия α GST свиньи в биологической жидкости человека, α GST свиньи может быть захвачена IgG [анти-свиная α GST], непосредственно или косвенно связанной с твердой фазой или, в качестве альтернативы, IgG [анти- α GST человека], проявляющей перекрестную реактивность.
Был выращен поликлональный иммуноглобулин IgG кролика [анти-свиная α GST] , который в высшей степени специфичен для свиной α GST. В том случае, если антитело также проявляет малую степень (примерно 5-10%) перекрестной реактивности c α GST человека, например, при высокой концентрации α GST человека, то α GST человека можно определить отдельно и правильно подсчитать количество свиной α GST, как описано ниже.
Была идентифицирована моноклональная анти- α GST человека с почти 100% перекрестной реактивностью со свиной α GST, как описано ниже в примере 3.
Иммунологический анализ ферментов может быть выполнен с формированием "сандвича" или как полу-конкурентный иммунологический анализ, как описано ниже в примерах 1 и 2, соответственно.
В еще одном аспекте изобретения материал донора испытывают на жизнеспособность до ксенотрансплантации.
Таким образом, изобретение позволяет также определять жизнеспособность материала донора путем измерения содержания полученного из органа-донора вещества в биологической жидкости, которая контактирует с материалом донора с применением описанного выше способа.
В этом аспекте изобретения можно обнаружить вещество в соответствии с любым известным способом в дополнение к способам согласно изобретению. Например, если полученное из органа вещество - это фермент, то можно использовать ферментный анализ на основе применения субстрата для фермента для определения указанного полученного из органа вещества.
Изобретение также предусматривает наличие тест-набора или пакета для использования при осуществлении способа согласно изобретению, как описано выше.
Краткое описание чертежей
На сопроводительных чертежах:
Фиг. 1 это схематическая диаграмма иммунологического анализа фермента с формированием "сандвича" из примера 1;
Фиг. 2 это график зависимости поглощения при 450/630 нм относительно концентрации α GST (мкг/л) согласно данным количественного иммунологического анализа фермента с формированием "сандвича" для α GST свиньи из примера 1;
Фиг. 3 это схематическая диаграмма полу-конкурентного иммунологического анализа фермента по примеру 2;
Фиг. 4 это график зависимости поглощения при 450/630 нм относительно концентрации α GST (мкг/л) согласно данным количественного конкурентного иммунологического анализа фермента для α GST свиньи по примеру 2;
Фиг. 5 это данные анализа методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE анализ) α GST человека и свиньи;
Фиг. 6 - данные иммуно-блот анализа α GST человека и свиньи с использованием конъюгатов IgG [анти- α GST человека] IgG козла [анти- IgG кролика] -HRP (пероксидаза хрена);
Фиг. 7 - данные иммуно-блот анализа α GST человека и свиньи с использованием конъюгатов IgG [анти- α GST] и IgG [анти-IgG кролика] HRP (пероксидаза хрена);
Фиг. 8 это иммуноблот-анализ α GST человека и свиньи с использованием IgG [анти- α GST человека] и IgG козла [анти-IgG мыши] HRP (пероксидаза хрена).
Режимы осуществления изобретения
Изобретение будет далее проиллюстрировано посредством следующих примеров.
Подготовительный пример A
Очистка α GST свиньи
Альфа GST была выделена из печени свиньи аффинной хроматографией и хроматофокусированием (pH 9,5 - 6,0). Точные подробности процедуры очистки следующие:
а. 30 г печени свиньи гомогенизировали в течение 2 минут в буфере для гомогенизации в отношении одна часть печени на три части буфера с использованием гомогенизатора Уоринга (Waring это товарный знак). Буфер для гомогенизации имел следующий состав:
10 мМ трис-HCl
250 мМ сахарозы
5 мМ EDTA рН 7,8
2 мкг/мл лейпептина
2 мкг/мл пепстатина.
б. Гомогенат печени центрифугировали при 10000 g в течение 60 минут.
в. Затем надосадочную жидкость загружали в колонку для аффинной хроматографии с глютатион (GSH)-сефарозой, предварительно приведенной в равновесие в 10 мМ трис-буфера (pH 9,1). Уравновешивающий буфер применялся снова для элюирования несвязанного белка. Наконец использовали 50 мМ трис-буфера (pH 9,1), содержащие 5 мМ GSH, для элюирования из аффинной колонки связанной GST.
г. Затем элюированный материал подвергался диализу относительно 25 мМ этаноламина pH 9,5 и направлялся в хроматофокусирующую колонку (РВЕ94, поставляемую фирмой Pharmacia). Для элюирования использовали буфер марки Polybuffer 96, приготовленный согласно инструкциям производителя.
Подготовительный пример Б
Получение и очистка антител
Очищенная α GST свиньи инъецировалась в белых новозеландских кроликов подкожно (п.к.) согласно временному графику, приведенному ниже, и сыворотка оценивалась на анти- α GST реактивность. Когда титр IgG (анти- α GST свиньи) был достаточен (определялось с помощью дот-блот анализа), животных обескровливали, и собирали сыворотку. Общее количество IgG очищалось от сыворотки кроликов аффинной хроматографией белка A и использовалось как для нанесения на микротитрационный планшет (полу-конкурентный EIA - пример 2), так и для биотинилирования (сандвич EIA - пример 1). Моноклональный IgG (анти- α GST человека, такой), как асцит, получали в Университетской больнице города Ниймеген, Нидерланды, и не очищали далее до использования.
График иммунизации (общий):
День 1: Брали кровь из уха кролика (5 мл предсыворотки) и затем 0,5 мл антигена α GST свиньи (100 мкг) смешивали с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Антиген и адъювант гомогенизировали до получения хорошей эмульсии. Затем эта смесь вводилась п.к. в ряд мест на спине кролика, которую перед этим обривали.
День 28: Брали кровь из уха кролика (5 мл сыворотки) и затем 0,5 мл антигена (100 мкг) смешивали с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Антиген и адъювант гомогенизировали до получения хорошей эмульсии. Затем смесь инъецировалась п.к. в ряд мест на спине кролика.
День 42: Для исследования брали 100 мл крови из уха кролика.
День 56: Вторая бустер-инъекция давалась кролику, как описано для дня 28.
День 70: Для исследования брали 10 мл крови из уха кролика. Когда титр был достаточно высок, кролика убивали, и собирали как можно больше крови.
Подготовительный пример В
Иммуноблоттинг
Все поликлональные и моноклональные IgG для использования в следующих примерах проверялись на реактивность и перекрестную реактивность относительно α GST человека и свиньи, соответственно, посредством следующих комбинаций иммуноблота:
(а) IgG кролика [анти- α GST человека] использовали для зондирования нитроцеллюлозных мембран, содержащих иммобилизованные α GST человека и свиньи.
(б) IgG кролика [анти- α GST свиньи] использовали для зондирования нитроцеллюлозных мембран, содержащих иммобилизованные α GST человека и свиньи.
(в) ldG мыши [анти- α GST человека] использовали для зондирования нитроцеллюлозных мембран, содержащих иммобилизованные α GST человека и свиньи.
Способ, использованный для обнаружения иммуноблота, был следующим:
1. α GST человека и свиньи (0,5 мкг/след) подвергались электрофорезу на 15% SDS-PAGE, с использованием маркеров молекулярного веса.
2. После электрофореза полиакриламидный гель разрезали и одну половину окрашивали на белок, тогда как оставшуюся часть использовали для электрофорезного переноса на нитроцеллюлозу.
3. После электрофорезного переноса нитроцеллюлозные мембраны блокировали в течение 1 часа с помощью 5% (вес/объем) раствора Marvel (Marvel это товарный знак) в солевом фосфатном буфере, содержащем 0,05% (вес/объем) блокирующего буфера TWEEN-20 (PBST).
4. Затем приготавливали следующие растворы:
(I) IgG кролика [анти- α GST человека] в 1% (веса и объема) Marvel в PBST
(ii) IgG кролика [анти- α GST свиньи] в 1% (вес/объем) Marvel в PBST
(iii) IgG мыши [aнти- α GST человека] в 1% (вес/объема) Marvel в PBST
и добавляли их к мембранам после декантирования блокирующего буфера. Инкубация с растворами антител продолжалась в течение одного часа.
5. Затем нитроцеллюлозные мембраны промывали в PBST (2х в течение 5 мин каждая).
6. Затем приготовлялся конъюгат IgG кролика и HRP 1/1000 в 1% (вес/объем) Marvel в PBST и добавлялся в 4(I) и (ii), указанные выше. Также приготовлялся конъюгат IgG мыши-HRP (1/1000) и добавлялся к раствору 4(iii), указанному выше. Противовидовые (кролик-мышь) конъюгаты, использованные для иммунологического анализа, приобретались в фирме Bio-Rad Laboratories Limited.
7. После одного часа инкубации с противовидовыми конъюгатами реагенты удаляли, и мембраны промывались, как описано в 5 выше.
8. Затем готовился субстрат диаминобензидин и добавлялся к мембране. На положительную реакцию указывал коричневый осадок на нитроцеллюлозной мембране.
Подготовительный пример Г
Синтез конъюгата α GST свиньи и пероксидазы хрена (HRP)
Конъюгаты α GST-HRP синтезировались с использованием методики конъюгации тиоэфира. Реакционноспособные малеимидные группы вводились в молекулы α GST с использованием SMCC (сукцинимидил 4-(N-малеимидометил) циклогексан 1-карбоксилат), и маскированные сульфгидрильные группы связывались с HRP (Данкен Р.Дж.С. и др., (1983)б "Anal. Biochem", 132, 68-73). После этапа демаскировки для получения реакционноспособных сульфгидрильных активированные малеимидом α GST и HRP-SH перемешивались вместе и реагировали в течение 4,5 часов. Получившийся конъюгат α GST-HRP, образованный ковалентной тиоэфирной связью, доводился до 50% (объем/объем) глицеролом и хранился при -20oC для использования в полу-конкурентном анализе EIA в примере 2.
Подготовительный пример Д
Биотинилирование IgG [анти- α GST свиньи]
Биотинилированная IgG [анти- α GST свиньи] готовили соединением очищенного поликлонального IgG [анти- α GST свиньи], ранее полученного иммунизацией кроликов с помощью очищенной α GST (как описано в подготовительном примере Б), с N-гидроксисукцинимид-биотином (NHS-биотин) в щелочной среде. Затем не прореагировавший NHS-биотин удалялся экстенсивным диализом, а биотинилированный IgG отбирался и хранился замороженным при -20oC до использования.
Пример 1
Иммунологический анализ ферментов методом "сандвича"
Используемая процедура схематически описана на фиг. 1.
а. На микротитрационный планшет Nunc Maxisorp (Nunc Maxisorp - это товарный знак) наносили моноклональный IgG мыши [анти- α GST человека] (упомянутый в подготовительном примере Б), иммобилизованный посредством фрагментов F(ab)2 козла [анти-IgG0 мыши] . Этот способ нанесения антител способствует ориентации Mab - связывающих участков (сайтов) и также улучшает чувствительность анализа, сводя к минимуму вызванную прилипанием денатурацию иммобилизованного антитела. Микротитрационный планшет блокировали раствором белок/сахароза.
б. α GST свиньи, выделенная из печени, как описано в подготовительном примере А, полученная сразу же после экспирации и хранящаяся при 2-8oC или -20oC, использовалась для калибровки.
в. Биотинилированные конъюгаты IgG [анти- α GST свиньи] использовали для облегчения обнаружения захваченных/иммобилизованных α GST.
г. Конъюгат стрептавидина - пероксидазы хрена (HRP) затем использовался для обнаружения всего антигенного комплекса-сандвича в связи с использованием субстрата тетраметилбензидин (ТМВ).
д. Реакция фермента прекращалась добавлением 1 H H2SO4, и измеряли поглощение при 450 нм с использованием 630 нм в качестве базовой длины волны. Интенсивность цвета пропорциональна концентрации α GST, и после получения графика зависимости А450 .630нм от концентрации (мкг/л) можно определить концентрацию неизвестных образцов (см. фиг. 2). Общее время анализа составило менее 3,5 часов.
Пример 2
Полу-конкурентный иммунологический анализ ферментов
Использованная процедура схематически описана на фиг. 3.
а. В этом случае пластины Nunc Maxisorp покрывались поликлональным иммуноглобулином IgG [анти- α GST свиньи], иммобилизованным посредством белка А, т.к. было обнаружено, что непосредственное покрытие поликлональным IgG не облегчает захват α GST, возможно, из-за денатурации IgG после образования связи с микротитрационным планшетом.
б. α GST, меченая HRP, использовалась в качестве конъюгата в этом случае и добавлялась в микро-лунку, чтобы впоследствии стать немеченым калибратором/образцом. Таким образом инициировалась реакция конкурентного типа между меченой HRP и немеченой α GST.
в. После подходящего инкубационного периода, обычно 60 минут, микротитрационный планшет промывали, и добавили субстрат ТМВ.
г. Реакция фермента прекращалась добавлением 1 H H2SO4, и измеряли поглощение при 450 нм с использованием 630 нм как базовой длины волны. Интенсивность цвета обратно пропорциональна концентрации α GST свиньи, и после построения графика зависимости А450 /630нм от концентрации (мкг/л), достигается количественное обнаружение неизвестных образцов (см. фиг. 4).
Пример 3
Оценка чистоты реагентов в иммунологическом анализе
Иммуноблоттинг проводился в соответствии с процедурой, описанной в подготовительном примере В. Результаты приведены на фиг. 5-8.
Ключ к следам на фиг. 5-8:
След 1: Маркеры молекулярного веса.
След 2: α GST человека (0,5 мкг).
След 3: α GST свиньи (0,5 мкг).
На фиг. 5 показана чистота (указанная одной полоской в каждом случае) α GST человека и свиньи до иммунизации в кроликов, что подтверждает отсутствие любых других полученных от человека или свиньи белков, которые, в противном случае, могли бы снизить специфичность анализа. Иммуноблот-анализ реакционной способности антител показывает, что IgG [анти- α GST человека] в высшей степени специфичен для α GST человека и не проявляет какой-либо значительной перекрестной реактивности с α GST свиньи (фиг. 6), на что указывает большая интенсивность сигнала α GST человека при относительно малой интенсивности сигнала α GST свиньи. Эта находка подтверждается отсутствием реакционной способности α GST свиньи ( α GST)p в специфическом для α GST ( α GST)h человека иммунологическом анализе ферментов, набор для которого поставляется на рынок фирмой Biotrin International Limited, Маунт Меррион, Каунти Дублин, Ирландия, под названием HEPKIT. Результаты представлены в табл. 1, показывающей оценку реакционной способности α GSTp в HEPKIT фирмы Biotrin. Очевидно, что никакой перекрестной реактивности не имеет место, когда α GST анализируется с помощью набора HEPKIT.
Значимость этого факта является чрезвычайно важной, поскольку это подразумевает, что иммунологический анализ ферментов для количественного определения α GST человека специфичен для обнаружения α GST человека. Таким образом, любая α GST человека, присутствующая в образцах, в которых также можно измерить α GST свиньи, может быть специфически обнаружена без перекрестного загрязнения от антигена свиньи. Это отсутствие перекрестной реактивности в иммунологическом анализе ферментов α GST человека и обнаружение того, что примерно 5-10% перекрестной реактивности очевидны между IgG [анти- α GST свиньи] и α GST человека (фиг. 7), как указывает малая интенсивность сигнала α GST человека при относительно большой интенсивности сигнала α GST свиньи, означают, что можно использовать одновременное количественное определение α GST человека в иммунологическом анализе ферментов HEPKIT и α GST свиньи в иммунологическом анализе ферментов для α GST свиньи для корректировки любого вклада α GST человека в иммунологическом анализе α GST свиньи.
Например, если образец дает следующие показания:
Анализ - α GST (мкг/л)
EIA свиньи ( α GST свиньи) - 10000
ElA Hepkit ( α GST человека) - 1000
то, принимая во внимание примерно 7% перекрестную реактивность α GST человека в EIA свиньи, можно сделать вывод, что α GST человека вносит вклад 
в показания α GST свиньи. Поэтому присутствуют 10000 - 70 = 9930 мкг/л α GST свиньи.
Более того, как упоминалось выше, экстенсивная перекрестная реактивность между IgG мыши [анти- α GST человека] и α GST свиньи явно показана на фиг. 8, о чем свидетельствует сравнительная интенсивность соответствующих полос/сигналов. Этим явлением можно воспользоваться при использовании этого антитела в иммунологическом анализе методом сандвича в примере 1 для α GST свиньи в качестве иммобилизованного или покрывающего планшету антитела.
Пример 4
Специфичность анализа
Поскольку анализы в примерах 1 и 2 будут прежде всего использоваться для обнаружения α GST свиньи в не принадлежащих свиньям биологических жидкостях, важно, чтобы чувствительность и специфичность анализа оценивалась с использованием α GST свиньи, присутствующих в следующих матрицах:
- моча человека;
- сыворотка человека;
- плазма человека;
- желчь человека;
- среды поддержки тканей.
Для достижения этого анализа α GST "вкалывалась" во все вышеуказанные матрицы и затем анализировалась в иммунологических анализах примеров 1 и 2. В дополнение к количественному обнаружению α GST, линейность (параллельность) анализа также оценивалась, как и чувствительность анализа. Более того, необходимо также, чтобы специфичность анализа облегчала обнаружение только α GST свиньи и чтобы любая α GST человека не вызывала значительных помех при проведении иммунологического анализа. С этой целью, потенциальная перекрестная реактивность α GST человека была исследована путем примешивания образцов, содержащих α GST свиньи, к разным количествам α GST человека для оценки потенциальной перекрестной реактивности. При условии, что такая значительная гомология последовательностей между обоими изоферментами это далеко не тривиальная задача, и ее можно решить только экстенсивным анализом антисывороток [анти- α GST свиньи] на предмет потенциальной перекрестной реактивности c α GST человека.
Результаты количественного определения α GST свиньи в различных матрицах при определении иммунологическими анализами ферментов по методу сандвича и полу-конкурентным анализом приведены в табл. 2.
Из табл. 2 ясно, что количественная регенерация α GST свиньи достижима во всех испытанных матрицах. Очевидно, важно, чтобы α GST была обнаруживаема как в плазме, так и в моче человека, соответственно, чтобы облегчить статус ксенотрансплантата печени и почки, и это действительно так. Однако, заметно, что матрица-плазма, очевидно, несовместима с методикой полу-конкурентного иммунологического анализа, возможно из-за взаимодействия IgG с иммобилизованным белком A, что приводит к аномальным показаниям. За исключением этого, все другие жидкости, кажется, совместимы с этими методиками анализа. Особенно интересна возможность обнаруживать α GST свиньи в средах поддержки тканей, что должно облегчить возможность предтрансплантационной оценки ксенотрансплантата или анализа живучести изолированных гепатоцитов свиньи (присутствующих в кассетах), т.к. эти системы в основном поддерживаются в обычных средах поддержки. Кроме того, эта совместимость матрицы-образца должна сильно облегчить обнаружение α GST в средах, используемых для сохранения органов-доноров ex vivo, причем орган-донор (например, печень) поддерживается экстракорпорально в контакте с культуральной средой.
Пример 5
Оценка влияния присутствия α GST человека при иммунологическом анализе ферментов α GST свиньи по методу сандвича
Проводилась оценка влияния присутствия α GST человека в иммунологическом анализе ферментов α GST свиньи по методу сандвича. Никаких помех при анализе при измерении поглощения не было отмечено при концентрации микро-лунок менее 25 мкг/л (эквивалентной концентрации образцов 125 мкг/л при разбавлении 1/5 в разбавителе образцов). Результаты представлены в табл. 3.
Результаты, приведенные в табл. 3, показывают специфичность иммунологических анализов для обнаружения α GST свиньи. Из данных очевидно, что присутствие α GST человека не влияет на данные иммунологического ферментного анализа даже при концентрациях образцов, доходящих до 125 мкг/л (25 мгк/л х 5), что представляет собой величину, в 15 и 6 раз большую нормального верхнего предела для α GST сыворотки и мочи человека, соответственно. При более высоких уровнях α GST человека (> 250 мкг/л; 50 мкг/л х 5) очевидно, что некоторое наложение имеет место, и было подсчитано, что имеется примерно 5-10% перекрестной реактивности между α GST человека и IgG [анти- α GST свиньи] . Однако совместное измерение уровней α GST в количественных иммунологических анализах для α GST и человека, и свиньи должно позволить рассчитать точное количество присутствующей α GST человека, и таким образом, его можно учесть во время количественного определения α GST свиньи в биологических жидкостях человека.
Далее следует заметить, что иммунологические анализы согласно изобретению можно также применять для обнаружения GST свиньи в полученных от свиньи биологических жидкостях, и это было бы справедливо для токсикологических исследований in vitro или in vivo, включающих в себя свиней или органы свиней. Эта находка имеет большое значение, поскольку известно, что физиология/биохимия свиньи и человека вполне схожи и, следовательно, свиней часто используют в качестве животных моделей для предсказания лекарственной токсичности у людей.
Изобретение относится к способу определения или обнаружения присутствия вещества, полученного из органа-донора, в биологической жидкости, указывающего на поражение органа-донора после ксенотрансплантации. Способ включает в себя захват или обнаружение этого вещества донора антителом, которое специфично для полученного из органа-донора вещества или способно вступать в перекрестную реакцию с этим полученным из органа-донора веществом. При этом в качестве реципиента может быть использован человек или примат, в качестве органа-донора - органы из свиньи, в частности почка, печень. В качестве вещества из органа-донора, в частности, определяют белок, например, фермент, например S-трансферазу глютатиона. Способ позволяет найти различие между полученными от реципиента и полученными от донора веществами и тем самым определить статус ксенотрансплантата и возможность его отторжения. 13 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 табл.
| Способ определения отторжения трансплантата культур островковых клеток поджелудочной железы | 1990 |
|
SU1720009A1 |
| Устройство для программного управления технологическим оборудованием | 1986 |
|
SU1372277A1 |
| Способ прогнозирования приживления кератотрансплантата | 1990 |
|
SU1807415A1 |
| Способ определения состояния организма больных с почечным аллотрансплантатом | 1987 |
|
SU1601581A1 |
| Способ прогнозирования криза отторжения трансплантата | 1972 |
|
SU507310A1 |
