ВЕКТОРЫ И УСИЛИТЕЛИ ТРАНСЦИТОЗА ДЛЯ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 2001 года по МПК A61K47/48 

Изобретение относится к доставке лекарственных веществ. В частности, изобретение относится к векторам и усилителям трансцитоза, способным осуществлять доставку и усиливать прохождение лекарственных веществ сквозь эндотелий, эпителий и мезотелий, содержащие GP60-рецепторы.

Область предполагаемой молекулярной активности большинства терапевтических лекарственных веществ, вводимых внутривенно или внутриартериально, находится за пределами сосудистой сети. Для лекарственных веществ, которые вводят через дыхательные пути, область предполагаемой активности обычно располагается за первым клеточным барьером эпителия альвеол, бронхов или трахеи. В обоих случаях существует эндотелиальный или эпителиальный барьер, который должен быть преодолен прежде, чем лекарственное вещество сможет оказать свое действие.

Для лекарственных веществ с маленькой липофильной молекулой возможно существует парацеллюлярный путь - между плотно соединенными барьерными клетками. Однако для гидрофильных веществ и активных агентов с более крупной макромолекулой, таких как пептиды, протеины, гены или антисмысловые нуклеотидные последовательности, единственным способом преодоления барьера является путь сквозь клетки. Это создает особую проблему в случае лекарственных веществ, вводимых внутривенно, поскольку они имеют особенно короткое время полужизни в организме из-за быстрого разложения или очищения крови при первом же прохождении через печень. Для поддержания сбалансированных терапевтических уровней при такой интенсивности выведения и разрушения часто бывает необходимо применять высокие дозировки или инфузии. Таким образом, существует несомненная потребность в разработке способа для более быстрой доставки лекарственных веществ через клеточные барьеры.

В литературе многократно описаны специфические рецепторы, являющиеся посредниками во внутриклеточных процессах, при которых лиганд присоединяется к рецептору, а затем интернализуется, образуя комплекс с рецептором, по механизму, сходному с пиноцитозом. Этот процесс включает инвагинацию клеточной мембраны в области комплекса лиганд-рецептор с по следующим высвобождением лиганда внутрь клетки по механизму, который еще не понят до конца. В литературе описан ряд систем внутриклеточных рецепторов, включая LDL, инсулин, эпидермальный ростовой фактор, инсулиноподобный ростовой фактор и tPA-PAI-I (гибридная молекула).

Трансцитоз состоит из инвагинации и образования везикулы вокруг комплекса лиганд-рецептор, прохождения через клетку и высвобождения путем процесса обратной инвагинации на базолатеральной мембране. Моноклональные антитела к транс-ферриновому рецептору были конъюгированы с токсинами таким образом, что они могли подвергаться трансцитозу через гематоэнцефалический барьер. Однако продолжает сохраняться потребность в разработке агентов, способных доставлять лекарственные вещества или усиливать их прохождение путем рецептор-опосредованного трансцитоза через клеточные барьеры другого типа, чем гематоэнцефалический барьер (эндотелий сосудов головного мозга), т.е. через такие как эндотелий сосудистой сети, эпителий альвеол и мезотелий брюшины.

GP60-рецептор, называемый также альбондином, является одним из нескольких альбумин- связывающих белков, описанных в литературе (Schnitzer and Oh, J. Biol. Chem. 269 (8): 6072-6082 (1994)). Эта группа включает также SPARC (Serum Protein, Acidic, Rich in Cysteine - белок сывортки, кислый, богатый цистеином), остеонектин или "основной мембранный протеин 40" GP30, GP18 и GP60. SPARC и остеонектин являются экстрацеллюлярными белками. GP60 проявляет некоторую гомологию со SPARC, что было показано с использованием анти-SPARC антител (Schnitzer and Oh, Am. J. Physiol. 263: H1872-H1879 (1992)). GP18 и GP30 представляют собой гликопротеины мембран, обнаруживаемые в клетках разных типов, но особенно распространенные в макрофагах (Schnitzer et al. , J. Biol. Chem. 267: 24544-24553 (1992)). GP18 и GP30 являются так называемыми "рецепторами-скэвенджерами (уборщиками)", отвечающими за опосредованное удаление окисленных и гликопроизводных альбумина, а также его аддуктов путем эндоцитоза и считается, что они играют важную роль в катаболизме альбумина в самых разнообразных органах (Schnitzer and Bravo, J. Biol. Chem. 268 (10): 7562-7570 (1993)).

В отличие от GP18 и GP30 рецептор GP60, как было обнаружено, находится только в эндотелии сосудистой сети (Schnitzer, Am. J. Physiol. 262: H246-H254 (1992)), в альвеолярном эпителии (Kim et al. Am. J. Resp. and Crit. Care Med. 151: A190 (1994)) и, предположительно, в перитонеальном мезотелии (Gotloib and Shostak, Kidney International. 47: 1274-1284 (1995)). GP60 в особо больших количествах находится в эндотелии микрососудов и, что очень интересно, отсутствует в гематоэнцефалическом барьере, где наблюдается небольшое проникновение альбумина (Rousseaux et al. Methods in Enzymology 121: 163 (1986)). Было показано, что поликлональные антитела к эндотелиальному GP60 связывают также и GP60 из альвеолярного эпителия (Kim et al., см. выше). GP60-рецептор участвует в рецептор-опосредованном трансцитозе альбумина через эпителиальный и эндотелиальные клеточные барьеры (Kim et al., см. выше; Tirrupathi et al. Molecular Biology of the Cell l(Supp): 338a. Abstract No 1964 (1993)). Последовательность аминокислот в GP60 уже известна (Ya-mauchi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 146: 1485 (1987)).

Данное изобретение предоставляет векторы и усилители трансцитоза, способные транспортировать физиологически активные агенты через эпителий, эндотелий и мезотелий, которые содержат рецептор GP60. Рецептор GP60 участвует в рецептор-опосредованном трансцитозе альбумина через клеточные барьеры. С помощью данного изобретения механизм GP60-рецептор-опосредованного трансцитоза может быть использован для транспорта не только альбумина, но также и физиологически активных агентов, которые естественным путем не проникают сквозь эпителий, эндотелий и мезотелий посредством GP60 системы.

Векторы и усилители транцитоза данного изобретения включают альбумин, фрагменты альбумина, поликлональные и моноклональные антитела анти-GP60, фрагменты поликлональных и моноклональных антител анти-GP60 и пептидные фрагменты GP60. Дополнительно они включают PD1 (протеин-дисульфидизомеразу) и ее фрагменты (любые последующие упоминания фрагментов GP60 можно также интерпретировать и как упоминания фрагментов PDI). Общим фактором может являться CGMC-участок, обнаруженный в PDI, и, по меньшей мере, T_1-44 фрагмент GP60. Если вектор или усилитель трансцитоза представляет собой пептидный фрагмент GP60, предпочтительно вводить его совместно с другими векторами или усилителями трансцитоза данного изобретения, такими как альбумин или фрагмент альбумина. Подходящие фрагменты альбумина 14, 20 или 32 кД могут быть получены путем расщепления по остаткам метионина с помощью цианогенбромида и могут быть затем уменьшены по размеру путем восстановления дисульфидных мостиков. Фрагменты поликлональных и моноклональных антител анти-GP60, пригодные для использования в качестве векторов или усилителей трансцитоза в соответствии с данным изобретением, включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂ и F_v фрагменты. Пептидные фрагменты GP60 предпочтительно включают пептид T3118, который соответствует N-концевому участку протеина GP60, состоящему из 18 аминокислот.

В соответствии с данным изобретением в случае, когда перечисленные выше соединения конъюгированы с физиологически активным агентом, они называются в этом документе "векторы трансцитоза". Когда же вышеназванные соединения вводятся совместно с физиологически активным агентом, но не конъюгированы с ним, они называются здесь "усилители трансцитоза". В предпочтительных способах осуществления векторы и усилители трансцитоза данного изобретения используют для доставки или усиления прохождения физиологически активных агентов сквозь эндотелий сосудистой сети, альвеолярный эпителий и перитонеальный мезотелий.

Подробное описание изобретения
Протеин GP60, как видно из его названия, был описан в уровне техники как белок с молекулярной массой около 60000 (60 кД). После более тщательного исследования было обнаружено, что "истинная" молекулярная масса этого белка, более вероятно, составляет около 57 кД. Полагают, что такие расхождения в значении молекулярной массы могут зависеть от разных способов подготовки белкового препарата и свойств геля. Однако, чтобы соблюдать соответствие уровню техники, этот белок упоминается здесь (за исключением примера 1, приведенного ниже) как GP60-рецептор.

Было обнаружено, что GP60-рецептор-опосредованный трансцитоз может быть использован для транспорта не только альбумина, но также и значительного числа терапевтически важных физиологически активных агентов, которые в естественных условиях не проникают сквозь эпителий, эндотелий и мезотелий посредством GP60 системы. Таким образом данное изобретение обеспечивает улучшенный способ для транспорта физиологически активных агентов, например, имеющих относительно высокие молекулярные массы, типа 50, 100, 150 кД и выше, через клеточные барьеры эндотелия сосудистой системы, эпителия альвеол, бронхов и трахеи, а также мезотелия брюшины. Векторы и усилители трансцитоза, способные к доставке или усилению прохождения физиологически активных агентов сквозь содержащие GP60 эндотелий, эпителий и мезотелий, включают альбумин, фрагменты альбумина, поликлональные и моноклональные антитела анти-GP60, фрагменты поликлональных и моноклональных антител анти-GP60 и пептидные фрагменты GP60. Если век тор или усилитель трансцитоза представляет собой пептидный фрагмент GP60, предпочтительно вводить его совместно с другими векторами или усилителями трансцитоза данного изобретения, такими как альбумин или фрагменты альбумина.

Альбумин млекопитающих хорошо изучен и легко доступен. Предпочтительно, используемый альбумин должен быть получен от того же вида млекопитающего, к которому принадлежит пациент. Например, если пациентом является человек, в качестве вектора или усилителя трансцитоза предпочтительно применять альбумин сыворотки человека. Подобным же образом, если пациентом является лошадь или корова, предпочтительно использовать лошадиный или бычий сывороточный альбумин, соответственно.

Способ получения фрагментов альбумина хорошо известен специалистам. Например, расщепление альбумина по метиониновым остаткам с помощью цианогенбромида дает три особенно подходящих пептида с массами 14, 20 и 32 кД, которые могут быть далее уменьшены по размеру путем редукции дисульфидных мостиков до пептидов, массы которых находятся в пределах 3,3-20 кД. Альтернативным способом получения пептидных фрагментов альбумина является расщепление с помощью протеаз.

Пригоден ли каждый конкретный фрагмент альбумина в качестве вектора или усилителя транцитоза, можно определить рутинным методом скрининга, описанным ниже. Как показано в приводимых далее примерах, в настоящее время уже показано, что как бычий, так и человеческий сывороточные альбумины, действуя как усилители трансцитоза, в 2,5 - 4 раза усиливают поглощение физиологически активного агента по сравнению с контролем.

Поликлональные и моноклональные антитела анти-GP60 можно получить из GP60-рецепторов, выделенных из эндотелия, эпителия или мезотелия. Как указывалось выше, те эндотелиальные, эпителиальные и мезотелиальные клетки, в которых выражено содержание GP60-рецептора, включают эндотелий сосудистой сети (в том числе эндотелий капилляров (Ghinea et al., J. Cell. Biol. 107: 231-239 (1988)); эндотелий артерий (Silflinger-Birnboim et al., J. Celluar Physiology 149: 575-584 (1991)); эндотелий аорты и вен (Schnitzer and Oh, Am. J. Physiol. (1992), см. выше); эпителий альвеолярной ткани (Kim et al., см. выше); и мезотелий брюшины (Gotloib and Shostak, см. выше). GP60 можно выделить из эндотелия, эпителия и мезотелия с помощью известных из уровня техники методов (например, Schnitzer and Oh, J. Biol. Chem. (1994), см. выше), а также так, как описано в приводимом ниже примере 1.

Поликлональные антитела против очищенного GP60 или пептидного фрагмента GP60 (такого, например, как пептид T3118, обсуждаемый ниже) можно нарабатывать на мышах, кроликах или козах по известным современным методикам. В приводимом ниже примере 1 GP60-рецептор был элюирован с препаративного полиакриламидного геля SDS-PAGE и использован для иммунизации кроликов. После смешивания с равным объемом полного адъюванта Фрейнда кроликам вводили примерно по 50 мкг белка. Через две недели проводили повторные инъекции. Через 4-6 недель после второй инъекции у кроликов отбирали кровь и проводили испытание на иммунный ответ. После этого lgG иммунной сыворотки очищали, используя колонку с Протеин A-Сефарозой.

Препарат моноклональных антител также может быть получен по известной методике (Coding, J. Immunol. Methods. 39: 285 (1980); Oi and Herzenberg, Selected Methods in Cellular Immunology, p. 352, Freeman, San Francisco, (1979)). Например, мышам линии Balb/c вводят интраперитонеально по 50-150 мкг GP60 или пептидного фрагмента GP60. За три-пять дней до слияния позитивные мыши получают бустерную инъекцию антигена (50-150 мкг GP60 или пептидного фрагмента GP60), а затем ежедневно по 10 мкг (внутривенно или интраперитонеально) вплоть до спленэктомии. Клетки селезенки сливают с клетками миеломы Sp2/0- Agl4, по существу выполняя методику St. Groth. et al., J. Immunol. Methods 35: 1-21 (1980). Супернатанты культуры подвергают скринингу с помощью ELISA, используя в качестве антигена неконъюгированные GP60 или фрагмент GP60. После этого позитивные культуры тестируют методами иммунофлуоресценции и вестерн-блотинга на кДНК-трансфицированные COS-1-клетки, как описано в работе Lutz et al. Experimental Cell Research 175: 109-124 (1988). Гибридомы, секретирующие специфичные антитела, дважды клонируют на мягком агаре. Каждая гибридома может быть адаптирована в бессывороточной среде SFRI-4. Для получения асцитной жидкости примерно 2•10⁶ клеток инъецируют в первоначально-примированных (pristineprimed) мышей линии Balb/c. Определение класса и подкласса проводят с помощью "Набора для изотипирования". В качестве источника моноклональных антител могут быть использованы как супернатанты SFRI-культур, так и асцитные жидкости.

Как указывалось, поликлональные и моноклональные антитела анти-GP60 и фрагменты этих антител, являющиеся предметом данного изобретения, применяют в качестве векторов и усилителей трансцитоза, способных доставлять или усиливать прохождение физиологически активных агентов сквозь эндотелий, эпителий и мезотелий, которые содержат GP60-рецепторы. Фрагменты антител анти-GP60, используемые в качестве векторов и усилителей трансцитоза данного изобретения, включают фрагменты, содержащие единичные (Fab) антигенсвязывающие домены, получаемые путем расщепления папаином; или F(ab')₂ фрагменты, получаемые путем лимитированного расщепления пепсином (Olsson and Kaplan, Methods in Enzymology 92: 3 (1983)). Другими пригодными фрагментами являются Fab' и F_v. Пригоден ли каждый конкретный фрагмент антитела в качестве вектора или усилителя трансцитоза, можно определить рутинным методом скринига, описанным ниже. В приводимом далее примере 3 показано, что введение поликлональных антител анти-GP60 при 37^oC приводит к увеличению поглощения физиологически активного агента в 1,6 - 2 раза по сравнению с уровнем контрольной пре-иммунной сыворотки.

Согласно данному изобретению антитела анти-GP60, индуцированные у животных, иных, чем человек, таких как мыши и крысы, пригодны для введения только в течение короткого периода (т.е. не в хронических курсах лечения) в связи с общеизвестными неблагоприятными иммунными ответами на чужеродные антитела. Однако для того, чтобы преодолеть проблемы, возникающие при введении людям мышиных моноклональных антител, возможно применить известные методы получения человеческих моноклональных антител к GP60 рецептору (Olsson and Kaplan, см. выше), воспроизводя таким образом антитела, пригодные для длительного или хронического введения. Помимо этого мышиные антитела данного изобретения могут быть "очеловечены" путем создания химер или CDR-прививкой. Участок узнавания антитела мыши прививают в соответствующий участок человеческого антитела, чтобы исключить или ограничить неблагоприятные иммунные реакции у пациента.

Пептидные фрагменты GP60 также могут быть применены в качестве векторов или усилителей трансцитоза в соответствии с данным изобретением. Особенно подходящим является пептидный фрагмент GP60, включающий первые 18 аминокислот с N-конца цепи GP60; было обнаружено, что он, по крайней мере, на 80%, гомологичен отрезку белка, связывающему бычий мембрано-связанный тиреоидный гормон (T3). Такие пептидные фрагменты GP60 могут быть получены любым из известных энзиматических или физических методов, включая протеолитическое расщепление. Альтернативно, пептидные фрагменты GP60 могут быть получены путем синтеза. Как показано в приводимом ниже примере 5, синтетический N-терминальный пептид (T3118), соответствующий первым 18 остаткам GP60, можно получить синтезом на твердой фазе. Этот пептид, действуя как агонист при трансцитозе, стимулирует поглощение человеческого альбумина на уровне, 5-кратно превышающем контрольный.

Способы конъюгирования векторов данного изобретения с физиологически активным агентом будут легко доступны квалифицированному специалисту и включают, хотя и не ограничиваются ими, следующие реакции: конъюгация с глутаровым альдегидом, включая образование основания Шиффа; карбодиимидная реакция между протеинами и карбоновыми кислотами; активация лекарственных веществ, содержащих аминогруппу, ангидридом кислоты с последующим карбодиимидным сшиванием; активация лекарственных веществ, содержащих первичную аминогруппу, 3-(2-пиридилдитио)пропионато-N-сукцинимидил ангидридом с последующим присоединением к цистеиновым группам белков; присоединение сахарных спиртов к белкам с помощью цианурхлорида; и конъюгация между аминами и гидроксильными группами через стадию биспероксидации.

Например, аминосахарную часть физиологически активного агента можно окислить путем обработки периодатом натрия и прямо прикрепить к лизиновому остатку трансклеточного переносчика данного изобретения через стадию образования основания Шиффа по методу, описанному в работе Hurwitz et al., Cancer Res. 35: 1175-1181 (1975). Альтернативно физиологически активный агент может быть связан с трансклеточным переносчиком данного изобретения посредством карбодиимидного присоединения аминогруппы активного агента к карбонильной группе вектора или к аминоалкильной группе по методу, описанному в работе Hurwitz et al. Int. J. Cancer 21: 747-755 (1978). Физиологически активный агент может быть связан с вектором трансцитоза данного изобретения также путем перекрестной сшивки аминогруппы агента и аминогруппы вектора с помощью глутарового альдегида по методу, описанному в работе Belles-Isles et al., Br. J. Cancer 41: 841-842 (1980).

Другие области молекулы, пригодные для осуществления конъюгации физиологически активного агента к одному из векторов трансцитоза данного изобретения могут быть определены эмпирически рутинными методами. Например, вектор трансцитоза данного изобретения можно пометить с помощью флуоресциина или изотопа ¹²⁵I как до, так и после конъюгации с таким физиологически активным агентом, как инсулин. После конъюгации и прикрепления метки можно провести скрининг-анализ по методике, описанной ниже в примерах, для определения поглощения эндотелиальными клетками, проникновения через эпителиальные клетки или мезотелиальные клетки любого кандидата вектор/активный конъюгат. Такой рутинный скрининг-анализ позволяет квалифицированному специалисту определять, какие из векторов трансцитоза данного изобретения сохраняют способность к трансцитозу после конъюгации конкретного участка с физиологически активным агентом. Этот метод анализа применим также для рутинного скрининга кандидатов из фрагментов альбумина, фрагментов анти-GP60 антител и пептидных фрагментов GP60 с целью определения их пригодности для использования в качестве векторов и усилителей трансцитоза в соответствии с данным изобретением.

Конъюгация физиологически активных агентов с векторами трансцитоза данного изобретения пригодна, в частности, в случаях внутривенного введения лекарственных веществ с низкой молекулярной массой, которые иначе имеют исключительно короткое время полужизни в сыворотке, или в случаях лекарственных веществ пептидной природы, которые быстро распадаются в кровотоке или же удаляются путем экскреции при первом проходе через печень. Конечно, в случаях, когда физиологически активный агент ковалентно связан с одним из векторов трансцитоза данного изобретения, должна быть определена остаточная активность терапевтического агента после конъюгации. Методики определения активности терапевтического агента хорошо разработаны, а многие терапевтические средства успешно были конъюгированы и сохранили активность субстанции. Например, в литературе описаны конъюгаты между рецепторными лигандами или их фрагментами и лекарственными веществами с целью ускорения трансцитоза через гематоэнцефалические барьеры. Fukta et al., Pharm. Research 11 (12): 1681 (1994), описывают конъюгацию пероксидазы хрена (HRP) с инсулином, что позволило HRP преодолеть гематоэнцефалический барьер. Исследователи продолжали получать фрагменты инсулина, которые были подвергнуты скринингу на способность связывать инсулиновый рецептор на клетках эндотелия микрососудов бычьего мозга в культуре. Подобным же образом другие системы для трансцитоза позволяют проходить через клетки антителам, связанным с активными веществами, включая, наряду с другими, конъюгат антитело-метотрексат, нацеленный на транферриновый рецептор (Friden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4771 (1991)), и конъюгат антитело-полилизин, нацеленный на рецептор эпидермального фактора роста (Chen et al., FEBS Lett. 338: 167 (1994)).

В отличие от векторов трансцитоза усилители трансцитоза данного изобретения не конъюгируются с физиологически активными агентами. Было обнаружено, что присутствие на эпителии, эндотелии и мезотелии, содержащих GP60-рецепторы, одного из усилителей трансцитоза данного изобретения совместно с физиологически активным агентом достаточно для того, чтобы усилить поглощение агента и прохождение его сквозь клеточный барьер. Не желая связывать себя теорией, можно представить, что усилители трансцитоза данного изобретения являются "спусковыми крючками" механизма GP60-опосредованного трансцитоза и таким образом стимулируют усиленное поглощение совместно присутствующих макромолекул, включая терапевтические агенты.

Поглощение физиологически активных агентов эпителием, эндотелием и мезотелием или прохождение их сквозь эти слои может быть индуцировано или усилено с помощью любого из усилителей трансцитоза данного изобретения как по отдельности, так и в комбинациях. Например, приведенные ниже результаты экспериментов показывают, что, действуя в качестве агониста трансцитоза, пептид T3118 из GP60 увеличивает поглощение человеческого альбумина в 5 раз по сравнению с контролем. В дополнительном воплощении данного изобретения доставка активных агентов может быть обеспечена в случае, когда один из конъюгатов с векторами трансцитоза, описанных выше, вводится совместно с одним или несколькими усилителями трансцитоза данного изобретения.

Конъюгаты с векторами трансцитоза и композиции с усилителями трансцитоза (включающие активный агент) данного изобретения могут вводиться совместно с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем, например, с фармацевтически приемлемыми органическими и неорганическими веществами, пригодными для применения, которые не вступают в разрушающие реакции с конъюгатами или с композицией. Подходящие фармацевтически приемлемые вещества включают, хотя и не ограничиваются данным перечнем, следующие субстанции: воду, солевые растворы, спирт, растительные масла, полиэтилингликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, душистые масла, моноглицериды и диглицериды жирных кислот, эфиры петролейных жирных кислот, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т.п. Фармацевтические продукты могут быть простерилизованы и, если нужно, смешаны с дополнительными агентами, например, лубрикантами (смазками), консервантами, стабилизаторами, увлажняющими агентами, эмульгаторами, солями, влияющими на осмотическое давление, буферами, красителями, ароматизаторами и/или душистыми веществами, которые не вступают в разрушающие реакции с конъюгатами. Для парентерального применения, в частности, пригодны препараты в виде растворов, предпочтительно масляных или водных растворов, а также суспензии, эмульсии, или имплантаты, включая суппозитории. Удобными единицами дозировки являются ампулы. Для энтерального способа применения, в частности, подходят препараты в форме таблеток, драже или капсул, содержащих носитель-связыватель такой, как тальк и/или углевод, причем предпочтительно, чтобы носитель представлял собой лактозу и/или кукурузный крахмал и/или картофельный крахмал. Может быть применен сироп, эликсир или подобная лекарственная форма, в которых используется подслащенный растворитель. Могут быть составлены композиции, постепенно высвобождающие лекарственное вещество, включая такие, где активный компонент защищен дифференциально разрушающимися покрытиями, например, изготовленными путем микрокапсулирования, многослойными покрытиями и т. д.

Введение конъюгата или композиции, включающей один физиологически активный агент или большее их число, а также один вектор или усилитель трансцитоза данного изобретения или большее их число, может осуществляться любым известным способом, включая инъекции, или же через пульмонарные дыхательные пути. В частности, инъекции пригодны для введения в сосудистую сеть и в брюшину, в то время как через пульмонарные дыхательные пути особенно удобен для введения в альвеолы. Составы, пригодные для легочного введения, включают один или несколько усилителей трансцитоза данного изобретения в смеси с физиологически активным агентом. Альтернативно, подходящие для легочного введения составы включают вектор трансцитоза, конъюгированный с агентом. Например, лекарственные средства могут быть составлены с помощью распылительного устройства, такого, как распылитель Эйкорна (Acorn) или ДеВилбисса (DeVilbiss), в которых агент и усилитель трансцитоза или вектор присутствуют в водном растворе в резервуаре распылителя. Альтернативно, в предпочтительном способе осуществления пульмонарного введения состав выбрасывается из устройства для сухой порошковой ингаляции (DPI). Устройства для сухой ингаляции описываются Саттоном и др. (Sutton et al.) в заявке на патент США (U. S. Patent Application) No 08/487420 и в патенте WO-A-9609814. Для них требуется проведение распылительной сушки состава до микрочастиц размером 2-5 мкм, которые являются предпочтительными для проникновения в альвеолы.

В частности, усилитель или вектор трансцитоза данного изобретения или их смесь, предпочтительно в концентрации около 20% (масс/об), используют для распылительной сушки. Продукт, который должен быть распылен, может содержать и другие вещества, кроме усилителей или векторов трансцитоза, а также растворитель или жидкость-носитель. Например, водная фаза может содержать 1-20% по весу водорастворимых гидрофильных соединений, таких как сахара и полимеры в качестве стабилизаторов, например поливиниловый спирт (PVA), поливинилпирролидон (РYР), полиэтиленгликоль (PEG), желатин, полиглутаминовая кислота и полисахариды, такие как крахмал, декстран, агар, ксантин и т.п. Подобные водные фазы могут быть использованы в качестве несущих жидкостей, в которых конечный продукт в виде микросфер суспендируют перед использованием. Могут быть использованы эмульгаторы (0,1-5% по весу), включая наиболее физиологически приемлемые эмульгаторы, в первую очередь, яичный лецитин или лецитин соевых зерен, или синтетические лецитины, такие как насыщенные синтетические лецитины, например димиристоилфосфатидилхолин, дипальмитоилфосфатидилхолин или дистеароилфосфатидилхолин, или ненасыщенные синтетические лецитины, такие как диолеилфосфатидилхолин или дилинолеилфосфатидилхолин. Эмульгаторы включают также сурфактанты (поверхностно-активные вещества), такие как свободные жирные кислоты, эфиры жирных кислот с полиоксиалкиленовыми соединениями, например полиоксипропиленгликолем и полиоксиэтиленгликолем; эфиры жирных спиртов с полиоксиалкиленгликолями; эфиры жирных кислот с полиоксиалкилированным сорбитом; мыла; глицерин-полиоксиэтиленрицинолеат; гомо- и сополимеры полиалкиленгликолей; полиэтоксилированное соевое масло и касторовое масло, а также их гидрогенированные производные; простые и сложные эфиры сахарозы или других углеводов с жирными кислотами, жирными спиртами, которые дополнительно полиоксиалкилированы; моно-, ди- и триглицериды насыщенных или ненасыщенных жирных кислот, глицериды или соевое масло и сахароза.

В оболочки микросфер могут быть включены добавки с целью модификации физических свойств, таких как способность к диспергированию, эластичность и водопроницаемость. Среди применяемых добавок есть соединения, которые могут "гидрофобизировать" оболочки для того, чтобы снизить водопроницаемость, - такие как жиры, воски и углеводы с высокой молекулярной массой. Добавки, которые улучшают диспергирование микросфер в инъецируемой жидкости-носителе, представляют собой амфипатические соединения, такие как фосфолипиды; они также повышают водопроницаемость и скорость биодеградации. Добавки, которые повышают эластичность оболочек, включают пластификаторы, такие как изопропилмиристат и подобные вещества. Количество добавок, которые должны быть включены в оболочки, широко варьируют и зависят от конкретных потребностей. В некоторых случаях добавки вообще не используют, в других случаях возможные количества добавок в оболочках могут достигать около 20% по весу.

Раствор, содержащий один вектор или усилитель трансцитоза данного изобретения или большее их число и добавку, если она вообще вводится, разбивают на мелкие частицы (атомизируют) распылением и высушивают любым пригодным способом, который обеспечивает получение дискретных микросфер или микрокапсул размером от 2 до 5 мкм, как обсуждалось выше. В данном случае термин "микрокапсулы" обозначает полые частицы, заключающие в себе пространство, заполненное газом или паром, а не каким-либо твердым материалом.

При атомизации состава, содержащего вектор или усилитель трансцитоза, формируется аэрозоль, например, при распылении данного состава под давлением хотя бы через одно сопло, или при использовании центрифужного атомизатора в камере с горячим воздухом или другим инертным газом. Такая камера должна быть достаточно большой для того, чтобы самые крупные из разбрасываемых капель не ударялись о стенки до момента высыхания. Газ или пар в камере является чистым (предпочтительно, стерильным и апирогенным) и нетоксичным, так как попадает в кровоток в сопутствующих количествах при введении используемых микрокапсул. Скорость испарения жидкости из препарата должна быть достаточно высокой, чтобы образовывались полые микрокапсулы, но не слишком высокой, чтобы эти микрокапсулы не разрывались. Скорость испарения можно контролировать, изменяя скорость газового потока, концентрацию вектора или усилителя трансцитоза в составе, природу жидкого носителя, скорость подачи раствора и, что более важно, температуру газа, с которым встречается аэрозоль. Например, для получения полых капсул при концентрации альбумина или фрагментов альбумина в воде 15-25% достаточно температуры газа на входе минимально около 100^oC, предпочтительно, по меньшей мере 110^oC, и температуру можно повышать вплоть до 250^oC без разрушения капсул. Оптимальной является температура около 180-240^oC, предпочтительной - около 210-230^oC, а наиболее предпочтительной - примерно около 220^oC. Поскольку температура газа, с которым сталкиваются частицы аэрозоля, будет зависеть также от скорости подачи аэрозоля и от содержания жидкости в препарате, можно отслеживать температуру на выходе из камеры, чтобы быть уверенными в адекватности температуры внутри ее. Удовлетворительной является температура на выходе от 40 до 150^oC. Контроль скорости потока полезен для управления прочими параметрами, такими как количество интактных полых частиц.

Микрочастицы могут заключать в себе по меньшей мере 50%, более предпочтительно 70% или 80%, а наиболее предпочтительно 90% по весу усилителя трансцитоза. Для использования в ингаляторах микрочастицы могут быть объединены в состав с общепринятым наполнителем, таким как лактоза или глюкоза. Количество физиологически активного агента необходимо выбирать с учетом его природы и активности, способа введения и других факторов, известных квалифицированным специалистам. В качестве примера, число вводимых частиц может быть таким, чтобы транспортировать 100 мг/сутки α-1 антитрипсина, или 0,1 мг/сутки такого активного агента, как беклометазон. Другие вероятные физиологически активные агенты, которые могут вводиться в форме микрочастиц, приведены ниже.

Дополнительным способом осуществления данного изобретения является совместная распылительная сушка физиологически активного агента с усилителем трансцитоза для облегчения стабилизации активного агента в процессе составления лекарственного средства, упаковки и, что наиболее важно, в процессе нахождения на альвеолярной выстилке. В таких окружающих условиях возможна сильная протеолитическая активность. При данном или другом способе осуществления активный агент может быть перед распылительной сушкой сшит с вектором трансцитоза посредством ковалентной связи, которая впоследствии может быть разорвана. Этот способ осуществления представляет собой метод переноса активного агента на всем пути от распылительного устройства до кровотока и, возможно, до цели внутри тела. Образование частиц с оптимальными аэродинамическими размерами означает, что "физический" вектор доставляет активный агент к месту абсорбции. После попадания на альвеолы далее действует "молекулярный" вектор, который защищает агент и облегчает его проникновение в кровоток посредством GP60-опосредованной системы трансцитоза и, уже в кровотоке, дополнительно может продлить время полужизни в системе кровообращения и даже направить активный агент к определенным участкам, в которых, как было обнаружено, содержится GP60- рецептор. Пригодные способы сшивания приведены выше; дополнительно патент WO-A-9317713 описывает эстеразочувствительные полигидроксилированные кислые сшивающие агенты. В случае применения перед распылительной сушкой такая методика изготовления производных векторов трансцитоза обеспечивает получение несущей системы с ковалентной связью для доставки активного агента в общую сосудистую сеть организма. Таким образом используется способность векторов трансцитоза проходить сквозь альвеолы и нести на себе активный агент в течение длительного периода, защищая потенциально нестабильные вещества.

Хотя физиологически активный агент, применяемый в данном изобретении, может быть включен внутрь микрочастиц или другим способом связан с ними после приготовления лекарственного средства, предпочтительно, он должен быть объединен с вектором или усилителем трансцитоза в процессе составления лекарственного средства. Микрочастицы могут быть хотя бы частично покрыты гидрофобным или нерастворимым в воде материалом, таким как жирная кислота, для того, чтобы замедлить скорость их растворения и защитить от набухания за счет поглощения воды. Методики и оборудование для распылительной сушки и производства микрочастиц, например, по применению устройства для сухой порошковой ингаляции, более подробно описаны в патенте WO-A- 9609814 и заявке на патент США U. S. Patent Application No 08/487420, содержание которых включено в данный документ в связи со сходством тематики. Оптимальные соотношения лекарственного вещества и усилителя трансцитоза в лекарственных средствах для легочного способа применения могут быть определены любым подходящим способом.

Оптимизация состава in vitro влечет за собой использование эпителиальных слоев первичных человеческих или иммортализованных человеческих эпителиальных клеток, выращенных в виде монослоев на пористых фильтрах, как описано в приводимых ниже примерах. После этого комбинации лекарственного вещества и стимулятора могут быть внесены в верхнюю камеру системы для изучения сквозного проникновения с фильтром Transwell, также описанной ниже. Путем использования либо меченых маркеров, либо иммунного метода анализа определяют скорость проникновения лекарственного вещества или гена в нижний слой. Оптимальным является такой состав лекарственного средства, который проявляет максимальную скорость и степень проникновения через ограничивающий монослой.

Альтернативным способом оптимизации состава лекарственного средства является проведение определения проникновения исследуемого лекарственного вещества из легких в кровь in vivo. Известны хорошо документированные исследования на крысах, свиньях и овцах (Patton et al. Journal of Controlled Release 28: 79 (1994); Folkesson et al., Acta. Physiol. Scahd. 147: 73 (1993); Schreier et al., Pharm. Res. Ц: 1056 (1994)), которые описывают методы инстилляции или распыления в виде аэрозоля лекарственных средств внутрь трахеи и бронхиол и количественной оценки появления этого лекарственного вещества в крови путем иммунного анализа или определения фармакологической активности. Для оптимизации потребуется серия опытов на животных с использованием различных пропорций лекарственного вещества и стимулятора, причем оптимальный состав определяют по наиболее благоприятной области под кривой, которая соответствует желаемому фармакологическому профилю данного лекарственного вещества. Например, для какого-либо лекарственного вещества может потребоваться просто проявление максимальной биодоступности или, наоборот, профиль, соответствующий замедленному или продленному высвобождению. Вероятно, в каждом случае должны быть разные требования к уровню усилителя, включаемого в лекарственное средство. Для лекарственных веществ, требующих максимальной доступности, было бы желательно использовать максимальный уровень усилителя и/или тот усилитель, который обнаружил наибольший активирующий эффект в отношении GP60-рецептора. Для лекарственных веществ, требующих более длительного прохождения через легкие, предпочтительнее использовать меньшие количества усилителя и/или усилители, проявившие более низкий потенциал активации GP60-рецептора трансцитоза.

"Эффективность" усилителя или вектора можно определить по тому, во сколько раз может быть усилен трансцитоз данного маркера в присутствии связывающего GP60-рецептор лиганда, антитела или миметика по сравнению с уровнем трансцитоза в отсутствие лиганда. "Эффективность" усиливающего агента может так же до некоторой степени зависеть от вида лекарственного вещества. Усиление поглощения маркера может происходить различным образом в зависимости от природы самого маркера и усилителя трансцитоза. Ниже в виде таблицы представлен краткий обзор маркеров, усилителей трансцитоза, клеточных систем и степени усиления по сравнению с контролем, данные для которого получены на разных маркерах, клеточных системах и типах опытов.

Используемые сокращения:
¹²⁵I-BSA - бычий альбумин, меченый ¹²⁵I,
¹²⁵I-lgG - иммуноглобулин G, меченый ¹²⁵I,
HSA - человеческий альбумин,
BSA - бычий альбумин,
FITC-инсулин - инсулин, меченый флуоресцеином,
GP60 Ab - поликлональное антитело анти-GP60,
T3118 - синтетический пептид, полученный из 18-ти остатков с N-конца GP60.

Под названием "физиологически активный агент" имеются в виду лекарственные вещества, которые включают молекулы нуклеиновых кислот и лекарственных пептидов и белков. В данном документе термин "физиологически активный агент" равнозначен терминам "лекарственное вещество", "активное начало", "активный агент" и "терапевтическое средство". Лекарственные вещества, для которых было бы полезным ускорение трансцитоза через эндотелий и эпителий, включают лютеинизирующий гормон (LH), хорионический гонадотропин, атриальные пептиды, интерферон, различные лимфокины, такие как интерлейкины (I, II, III, IV, V, VI и VII), колоние-стимулирующие факторы.

Другие лекарственные вещества, пригодные для использования в данном изобретении включают следующие: релизинг-фактор гормона роста, релизинг-фактор кортикотропина, релизиг-гормон лютеинизирующего гормона (LHRH), соматостатин, кальцитонин, релизинг-гормон тиротропина, кальцитонин ген-зависимый пептид (CGRP); такие белки, как ферменты, включая трансферазы, гидролазы, изомеразы, протеазы, лигазы, оксидоредуктазы, эстеразы и фосфатазы; различные ростовые и нейротрофические факторы, такие как соматомедины, эпидермальные факторы роста, урогастрон, фактор роста нервов (NGF), цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), нейротрофический фактор церебрального происхождения (BDNF), нейротрофический фактор глиального происхождения (GDNF), эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), инсулиноподобный
ростовой фактор, фактор некроза опухолей (TNF) и трансформирующий ростовой фактор (TGF). Дополнительно лекарственные вещества включают эндогенные агонисты опиоидов, такие как энкефалины и эндорфины; гипоталамические гормоны, такие как гонадолиберин, меланостатин, меланолиберин, соматостатин, тиролиберин, субстация P и нейротензин; аденогипофизальные гормоны, такие как кортикотропин, липотропин, меланотропин, лютропин, тиротропин, пролактин и соматотропин; нейрогипофизарные гормоны; кальцитрапические (тироидные) гормоны, такие как паратирин и кальцитонин; тимические факторы, такие как тимозин, тимопоэтин, цикуляторный тимический фактор и тимический гуморальный фактор; панкреатические гормоны, такие как инсулин, глюкагон и соматостатин; гастроинтестинальные гормоны, такие как гастрин, холецистокинин, секретин, желудочный ингибиторный полипептид, вазоинтестинальный пептид и мотиллин; гормоны яичников, такие как релаксин; вазоактивные тканевые гормоны, такие как ангиотензин и брадикинин; искусственные и псевдопептиды, такие как дефероксамин; и аналоги LHRH, такие как бусерелин, дезлорелин, гонадорелин, госерелин, гистерелин, лейпрорелин, нафарелин или трипторелин.

После изучения обычного описания изобретения, то же самое можно будет лучше понять с помощью следующих примеров, которые приводятся в качестве иллюстраций, но не имеют ограничительного характера.

Пример 1
Выращивание эндотелиальных и эпителиальных монослоев
Клетки эндотелия микросоудов легких быка (BPMVEC) и клетки эндотелия легочной артерии быка (BPAEC), выделяют и культивируют по известным методикам (Del Veccio et al. In Vitro. Cell. Dev. Biol. 28A: 711-715 (1992)). Эндотелиальные клетки рутинно выращивают на среде DMEM, содержащей 20% FBS. Для выделения плазматических мембран эндотелиальные клетки выращивают во вращающихся колбах объемом 850 см³. В каждую колбу вносят по 75 мл культуральной среды и вводят смесь воздух-CO₂. Затем колбы с клетками помещают в специальный инкубатор при 37^oC и оставляют для роста в течение 10-12 дней.

Первичные клетки эпителия альвеол крыс (AEC) выделяют по методике, описанной в работе Uhal et al. Am. J. Physiol. 257: C528-C536 (1989). Клетки культивируют в среде DMEM, содержащей 10% FBS, в течение 2 или 4 дней, причем за эти периоды времени они проявляют клеточный фенотип по типу II или типу I, соответственно. Фенотип подтверждают по методикам, описанным Uhal et al. Am. J. Physiol. Suppl. 261: 110-117 (1991).

Выделение мембран эндотелиальных клеток
Эндотелиальные клетки, выращенные во вращающихся колбах, отмывают дважды физраствором с фосфатным буфером. Клетки извлекают из вращающихся колб, суспендируют в буфере A (HEPES/Tris 20 мМ; NaCl 0,15 мМ; PMSF 0,1 мМ; pH 7,4) и дважды промывают путем центрифугирования при 700g в течение 10 мин. Клетки, полученные из 6-8 колб, суспендируют в 75 мл буфера A и гомогенизируют с помощью гомогенизатора Политрон в течение 1 мин при полной скорости. Гомогенную массу центрифугируют при 3000g в течение 10 мин. Супернатант отбирают и центрифугируют при 40000g в течение 60 мин. Полученную таблетку осадка затем суспендируют в буфере A и повторно центрифугируют при 40000g в течение 60 мин. Конечную таблетку мембран суспендируют в небольшом объеме буфера A, содержащего 0,2 мМ EDTA и определяют содержание белка (Lowry et al., J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951)). Определяют активность фермента-маркера плазматических мембран и хранят образец до дальнейшего использования при -70^oC.

Блоттинг лиганда
Мембраны эндотелиальных клеток предварительно инкубируют с 1мМ PMSF и 0,5 мМ EDTA при 22^oC в течение 20 мин, а затем солюбилизируют путем смешивания с 1,5 объемами солюбилизирующего буфера (мочевина 9 М; SDS 2%; β- -меркаптоэтанол 2%; Трис 0,1 М; бромфеноловый синий 0,02%; pH 6,8). Смесь инкубируют при 22^oC в течение 30 мин. Солюбилизированные белки разделяют методом электрофореза на полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия - SDS-PAGE (Laemmli, Nature (London) 227: 680-685 (1970)) с использованием пластинчатой системы гель-электрофореза с 3%-ным акриламидом на участке стэк-геля и 10%-акриламидом на участке сепарирующего геля. После электрофореза белки переводят на пленку из PVDF или из нитроцеллюлозы. Перевод осуществляют в течение 2 часов при напряжении 150 В с использованием в качестве буфера переноса: Трис 25 М, глицин 192 мМ и метанол 20%. Неспецифичиское связывание блокируют путем инкубирования мембран с раствором 5 мМ CaCl₂ в Трис-буфере (Трис 20 М, NaCl 0,5 М при pH 7,5) в течение 10 мин, а затем с раствором 0,5% Твин-20 в Трис-буфере в течение ночи. После этой стадии пленку промывают и разрезают на две полоски. Одну полоску инкубируют с раствором безглобулинового бычьего альбумина (BSA) 0,6 мг/мл в Трис-буфере, содержащем 1,5% желатина, в течение 2 часов, а другую полоску инкубируют без BSA. Полоски отмывают и инкубируют с анти-BSA в течение 60 мин в Трис-буфере, содержащем 1,5% желатина. Затем пленки дважды промывают и инкубируют со вторыми антителами (козий анти-кроличий lgG), конъюгированными с щелочной фосфатазой. Полосы белка локализуют после добавления 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата и тетразолиевой соли нитро-голубого.

Очистка белка
Мембраны клеток BPMVEC используют для выделения альбуминсвязывающего белка с массой молекулы 57 кД. Чтобы оценить наличие этого белка, на каждой стадии выполняют блоттинг лиганда. Мембраны клеток BPMVEC (100 мг) предварительно инкубируют с 1 мМ PMSF и 0,5 мМ EDTA при 22^oC в течение 30 мин. Мембраны солюбилизируют, применяя холат натрия в конечной концентрации 2,5% и 4 М мочевину, при 4^oC в течение 3 часов, осторожно перемешивая. В процессе солюбилизации концентрацию белка доводят до 4 мг/мл. После такой обработки суспензию центрифугируют при 100000g в течение 60 мин. Супернатант собирают и проводят диализ против 5 мМ HEPES/Tris (pH 7,2). В супернатант переходит более 80% белков мембран. Диализованную суспензию концентрируют путем осаждения 60%-ным этанолом при 4^oC. Преципитат после осаждения этанолом отделяют центрифугированием при 10000g в течение 30 мин при 4^oC и суспендируют в буфере A. Полученный преципитат солюбилизируют в течение ночи с помощью 2,5%-ного Тритона Х-100 при 4^oC и при осторожном перемешивании. Суспензию центрифугируют при 100000g в течение 60 мин. Супернатант собирают и диализуют против 4 л Tris-HCl 50 мМ; EDTA 0,2 мМ; Тритон Х-100 0,15%; PMSF 0,1 мМ; pH 8,0 (буфер В). Диализованный экстракт вносят в колонку с носителем DEAE-52 (10 х 13 см). Предварительно колонку уравновешивают буфером В. После внесения образца колонку промывают 50 мл буфера В. Связанные белки элюируют из колонки с помощью 80 мл буфера В, содержащего NaCl с линейным градиентом 0-500 мМ, при скорости протекания 15 мл/час. Фракции, соответствующие индивидуальным пикам, собирают раздельно и концентрируют путем осаждения 50 2%-ным ацетоном. Ацетоновый преципитат используют для проведения блоттинга лиганда. Только пик 1 проявляет альбуминсвязывающую активность. Белки, присутствующие во фракции пика 1, далее разделяют с помощью препаративного электрофореза SDS-PAGE (гель-пластина 16 см х 16 см, толщина 3 мм) и для дальнейших исследований используют белок с молекулярной массой 57 кД, который элюируют с геля.

Получение и очистка антител
Альбуминсвязывающий белок с массой 57 кД, элюированный с геля после препаративного SDS-PAGE, используют для иммунизации кроликов. После смешивания с равным объемом полного адъюванта Фрейнда вводят внутримышечно примерно по 50 мкг белка (на кролика). Через две недели проводят повторные инъекции. Через 4-6 недель после второй инъекции у кроликов отбирают кровь и проверяют иммунный ответ. После этого пре-иммунный сывороточный lgG и lgG иммунной сыворотки очищают, используя колонку с протеин A-Сефарозой.

Иммуноблоттинг
Мембраны эндотелиальных клеток подвергают процедуре SDS-PAGE (Laemmli, см. выше) и электрофоретическим путем переводят на пленку из нитроцеллюлозы или PVDF. Неспецифическое связывание блокируют обработкой 3%-ным желатином в Трис-буфере при 22^oC в течение 5 часов. Пленку промывают дважды 0,5%-ным раствором Твин-20 в Трис-буфере и инкубируют с антисывороткой, разбавленной в Трис-буфере, содержащем 1% желатина. Инкубацию проводят в течение 4-6 часов, промывают дважды, а затем инкубируют в течение 60 мин со вторыми антителами (козий анти-кроличий lgG, сцепленный с щелочной фосфатазой). После инкубации пленки дважды промывают и полосы белка локализуют так же, как описано в разделе "Блотинг лиганда". Молекулярные массы белков определяют с помощью белков-маркеров с известной массой.

Изучение связывания в монослое
Клетки BPMVEC высевают в шесть лунок (3 х 105 клеток/лунка) планшетов для тканевых культур Корнинга (Corning) и выращивают до слияния. Монослои промывают дважды бессывороточной средой (20 мМ HEPES/DMEM, pH 7,4) и инкубируют с бессывороточной средой в течение 15-20 часов в инкубаторе для тканевых культур. После такой инкубации монослои промывают дважды связывающим буфером (20 мМ HEPES/Tris в растворе HBSS, pH 7,4) и инициируют связывание добавлением 1 мл раствора 1 мкМ ¹²⁵I-BSA в связывающем буфере. В течение 60 мин проводят инкубацию при 4^oC. Связывание прерывают путем троекратного промывания связывающим буфером. Радиоактивность, связанную с монослоем, определяют после лизиса клеток с помощью 1н NaOH (Tiruppathi et al. Am. J. Physiol. (Lung. Cell. Mol. Physiol. ) L595-L601 (1992)). Неспецифическое связывание определяют с помощью включения немеченого BSA (40 мг/мл) в процесс связывания. Перед добавлением ¹²⁵I-BSA монослой предварительно инкубируют в течение 30 мин с тест-компонентами: пре-иммунным сывороточным IgG и анти-57 кД-IgG.

Эксперименты по проникновению веществ через клеточные слои
Для оценки транэндотелиального транспорта альбумина измеряют скорость проникновения ¹²⁵I-альбумина сквозь эндотелий в выращенных эндотелиальных монослоях. Система, применяемая для такого исследования, была описана ранее (Cooper et al. , J. Appl. Physiol. 62: 1076-1083 (1987); Garcia et al., J. Cell. Physiol. 128: 96-104 (1986); Del Vecchio et al., Vitro. Cell. Dev. Biol. 28A: 711-715 (1992) and Siflinger-Birnboirn et al., J. Cell. Physiol. 132: 111- 117 (1987)). Система измеряет движение молекул-маркеров сквозь эндотелий в отсутствие градиентов гидростатического и онкотического давления. Она состоит из "люминального" и "аблюминального" отделений, разделенных поликарбонатным микропористым фильтром (диаметр пор 0,8 мкм). Клетки BPMVEC высевают по 105 клеток/фильтр и выращивают в течение 3-4 дней до достижения слияния. В обоих отделениях содержится одинаковая среда (20 мМ HEPES-DMEM, pH 7,4) в объемах 600 мл и 25 мл, соответственно. Люминальное отделение снабжено наружным кольцом из материала Styrofoam и "плавает" в альбуминовой среде таким образом, что уровни жидкости остаются равными после повторяющихся отборов образцов из аблюминального отделения. В аблюминальном отделении непрерывно производится перемешивание, а вся система целиком находится в термостатируемой водяной бане при 37^oC. Трансэндотелиальный клиренс ¹²⁵I-альбумина определяют по количеству радиоактивности, перенесенному из люминальной в аблюминальную камеру. Изменение этого количества во времени дает скорость клиренса ¹²⁵I-альбумина в мкл/мин, определяемую по методу наименьших квадратов с помощью нелинейного регрессионного анализа (Программа статистической обработки BMDP, Беркли, Калифорния).

В начале опыта люминальное отделение погружают в аблюминальную среду и наполняют средой, содержащей ¹²⁵I-альбумин с активностью около 6 мкКи/мл. В течение 60 мин через каждые 10 мин отбирают образцы объемом 400 мкл из аблюминального отделения и измеряют их радиоактивность с помощью гамма-счетчика. В конце опыта определяют свободный ¹²⁵I и в люминальном, и в аблюминальном отделениях, используя осаждение 12%-ной ТХУ, и корректируют значение скорости трансэндотелиального проникновения ¹²⁵I-альбумина с учетом свободного ¹²⁵I.

За день проведения эксперимента монослои клеток BPMVEC дважды промывают бессывороточной средой 20 мМ HEPES-DMEM, pH 7,4 и выдерживают в инкубаторе для клеточных культур при 37^oC с бессывороточной средой в течение 12-15 часов. После такого инкубационного периода тест-компоненты (пре-иммунный сывороточный IgG и анти-57 кД-IgG) разбавляют бессывороточной средой и инкубируют с монослоями в течение желаемого периода. Эти монослои используют затем для измерения транэндотелиального транспорта альбумина.

Скорости трансэпителиального проникновения измеряют по методике, немного модифицированной по сравнению со способом для эндотелиальных клеток. Скорости проникновения определяют на крысиных первичных AEC или на клетках карциномы легких человека линии A549, культивируемых, как описано, на фильтрах Transwell (фирма Costar) (Evans et al. , Exper. Cell. Res. 184: 375-387 (1989)). Целостность монослоя определяют с помощью измерения трансэпителиального электрического сопротивления, которое должно быть более 500 Ом/см². Фильтры с интактными монослоями помещают на 24-луночный планшет для культивирования, содержащими по 1 мл бессывороточной среды DMEM на лунку (аблюминальная камера). В люминальную камеру заливают 200 мкл бессывороточной DMEM, содержащей меченую изучаемую молекулу (FITC-инсулин). Уровни жидкостей в двух отделениях одинаковы, что исключает влияние гидростатического давления. Фильтрующую систему преинкубируют в течение 30 мин, а затем выдерживают при 37^oC в инкубаторе с CO₂ в течение всего эксперимента по проникновению. Через один и два часа из аблюминальной камеры отбирают образцы объемом по 300 мкл и немедленно возмещают этот объем с помощью бессывороточной DMEM. Флуоресценцию вещества, прошедшего сквозь клетки (трансцитоз), регистрируют в планшете с помощью счетчика, а отношение связанного FITC к свободному определяют с помощью гель-хроматографии образцов из аблюминальной камеры.

Распределение нитей актина
Распределение нитей актина и цитоскелетные изменения в эндотелиальных монослоях, выращенных на фильтрах, изучают при условиях, идентичных тем, которые используют при измерении скоростей клиренса ¹²⁵I-альбумина. После периода необходимой предварительной обработки тест-компонентами монослои на фильтре фиксируют 10%-ным формалином в буфере (Palles-cences Inc., Warrington, PA), повышают проницаемость (пер-меабилизируют) с помощью 1%ного Nonidet P40 (Sigma) и окрашивают родамин-фаллоидином (Molecular Probes Inc., Eugene, OR), как описано в работе Phillips and Tsan, J. Histochem. Cytochem. 36: 551-554 (1988). Интактные фильтры, содержащие монослои, извлекают из лунок, помещают на покровные стекла, заливают раствором (1:1) глицерина в физрастворе с фосфатным буфером, накрывают круглыми покровными стеклами и запечатывают. Полученные слайды анализируют с помощью флуоресцентного микроскопа Nikon Lab Diaphot (NiKon Inc., Melville, New York) и фотографируют с использованием фотопленки TRI х Pan 400 ASA Kodak.

Идентификация альбуминсвязывающих белков
Сначала выделяют плазматические мембраны из клеток BPMVEC путем дифференциального центрифугирования и идентифицируют альбуминсвязывающие белки, присутствующие в этой мембранной фракции, с использованием блоттига лиганда (см. выше). Был разработан простой способ идентификации нативных албуминсвязывающих белков в мембранах эндотелиальных клеток. Мембранные белки выделяют с помощью SDS-PAGE и затем переводят на пленку из поливинилдифторида или нитроцеллюлозы. Неспецифическое связывание блокируют путем инкубирования полосок этой пленки с Твин-20, а затем проводят обработку безглобулиновым мономерным нативным BSA. Если не проводить выдержку полосок пленки с нативным BSA, анти-BSA распознает только полипептид с массой 67 кД, обнаруживая присутствие значительного количества BSA, связанного с мембранами эндотелиальных клеток. Однако в случае, когда полоска обработана BSA, антитела анти-BSA дополнительно реагируют с еще тремя полипептидами (110 кД, 57 кД и 18 кД). Наиболее интенсивно из этих полипептидов реагирует с антителом тот, масса которого составляет 57 кД, указывая на то, что "полипептид 57 кД" является мажорным нативным альбуминсвязывающим белком. Готовят также объединенные фракции мембран эндотелиальных клеток (фракция частиц клеток BPMVEC и BPAEC, полученная центрифугированием при 100000g) и используют их для проведения блоттинга лиганда. В этих фракциях частиц также проявляется первичное взаимодействие BSA с полипептидом 57 кД.

Выделение альбуминсвязывающего белка 57 кД
Поскольку наблюдается связывание нативного альбумина преимущественно с белком 57 кД, был разработан способ выделения этого белка из мембран клеток BPMVEC. Для оценки присутствия этого белка на всех стадиях очистки применяют блоттинг лиганда. Сначала мембраны клеток BPMVEC солюбилизируют с помощью 2,5%-ного холата натрия и 4 М мочевины, а затем экстракт диализуют и концентрируют путем преципитации 60%-ным этанолом. Из преципитата проводят повторную экстракцию с помощью Тритон Х-100 (см. выше). Солюбилизированный Тритоном Х-100 экстракт хроматографируют на колонке с DEAE и элюируют связанные белки при линейном градиенте (NaCl 0-500 мМ). При элюции белков проявляются три пика. Фракции, соответствующие каждому из пиков, собирают и проверяют на связывание альбумина с помощью блоттинга лиганда. Только пик (1) проявляет альбуминсвязывающую активность в области белка 57 кД.

Проводят SDS-электрофорез белков из нативных BPMVES мембран и пика 1 с DEAE-колонки после проявления красителем "Кумасси бриллиантовый синий R-250". Присутствие белка 57 кД соответствующего альбуминсвязывающему, наблюдается при блоттинге лиганда как в нативных мембранах, так и во фракции пика 1. Проводят также SDS-PAGE при невосстанавливающих условиях (без β- меркаптоэтанола) и связывание альбумина наблюдается только с областью 57 кД, что подтверждает отсутствие дисульфидных связей в этом белке. Далее этот белок очищают, применяя препаративный SDS-PAGE, и элюированный с геля белок используют для приготовления антител.

Иммуноблоттинг
Белки мембран клеток BPMVEC и BPAEC разделяют с помощью SDS-PAGE и переводят на полоски из нитроцеллюлозы. На полосках проводят иммуноблоттинг с анти-сывороткой к 57 кД. Пре-иммунная сыворотка не распознает никаких белков из мембран клеток BPMVEC и BPARC. Анти-сыворотка распознает два мажорных белка (57 кД и 36 кД) и один минорный белок (43 кД) в обоих препаратах мембран. Фракции частиц из клеток BPMVEC и BPAEC также используют для проведения иммуноблоттинга. Во фракциях частиц антитело распознает только эти же три белка, что свидетельствует об очистке альбуминсвязывающего белка до явной гомогенности.

Для изучения предполагаемых структурных взаимоотношений между эндотелиальными мембранно-связанными белками и секретируемыми альбуминсвязывающими белками (SPARC) иммуноблотинг мембран клеток BPMVEC выполняют с антителами, выработанными против очищенного бычьего SPARC. Антисыворотка, выработанная против очищенного бычьего SPARC, распознает в мембранах клеток BPMVEC полипептидов 67 кД, 61 кД, 57 кД, 43 кД и 36 кД. Антисыворотка против терминального пептида "анти-SPARC-NH2" сильно реагирует с полипептидом 36 кД и слабо - с полипептидом 43 кД. Это свидетельствует о том, что рецепторы-скэвинджеры сильно отличаются от нативных альбуминовых рецепторов.

Действие анти-57 кД-IgG на связывание ¹²⁵I-BSA монослоями BPMVEC
IgG пре-иммунной сыворотки и анти-57 кД-IgG очищают методом аффинной хроматографии на колонке с протеин-A-Сефарозой. Изучают влияние фракций IgG на связывание ¹²⁵I-BSA монослоями BPMVEC при температуре 4^oC: неспецифическое связывание находилось в пределах 40-50%. IgG пре-иммунной сыворотки не оказывал значительного влияния на специфическое связывание ¹²⁵I-BSA монослоями BPMVEC. Напротив, анти-57 кД-IgG снижал специфическое связывание ¹²⁵I-BSA монослоями BPMVEC в степени, зависящей от дозы. Такое снижение было максимальным (40-50%) при концентрации анти-57 кД-IgG 200 мкг/мл и оставалась постоянным вплоть до 1000 мкг/мл.

Эти результаты показывают, что антитела, выработанные против белка 57 кД, не полностью распознают альбуминсвязывающий домен рецептора, или же, что нативный альбумин может взаимодействовать с другими связывающими участками на поверхности клеток эндотелия.

Активация проникновения альбумина сквозь эндотелий с помощью анти-57 кД-IgG при отсутствии изменения формы эндотелиальных клеток.

Для изучения действия анти-57 кД-IgG на трансэндотелиальный транспорт альбумина измеряют скорости трансэндотелиального клиренса ¹²⁵I-BSA в монослоях BPMVEC. Монослои предварительно инкубируют с пре-иммунным сывороточным IgG и анти-57 кД-IgG в течение 15 мин, 30 мин и 60 мин, а затем измеряют скорости трансэндотелиального клиренса ¹²⁵I-BSA в период до 60 мин. Индуцированное антителом анти-57 кД-IgG повышение проницаемости проявляет зависимость от времени. После 30-минутного периода предварительной инкубации с анти-57 кД-IgG наблюдается повышение скорости клиренса ¹²⁵I-BSA в 2 раза по сравнению с действием пре-иммунного IgG. При 15-минутной предварительной инкубации не проявляется заметного повышения проницаемости, а когда анти-57 кД- lgG пре-инкубируют с монослоем вплоть до 60 мин, отмечают изменение на 40-50%. IgG пре-иммунной сыворотки не оказывает влияния на трансэндотелиальный транспорт альбумина при любом из проверенных периодов предварительной инкубации. При 4^oC действие анти-57 кД-IgG на проникновение ¹²⁵I-альбумина становится обратным.

Изменение формы клеток эндотелия после обработки пре-иммунным сывороточным IgG и анти-57 кД-IgG изучают с помощью методик, описанных ранее (Phillips and Tsan, см. выше; Siflinger-Birnboim et al., Lab. Invest. 67: 24-30 (1992)). Клетки BPMVEC, выращенные на фильтрах "Нуклеопор" предварительно инкубируют с пре-иммунным сывороточным IgG и анти-57 кД-IgG в течение 30 мин, а затем монослои окрашивают родамин-фаллоидином (см. выше). Ни в одном случае не наблюдается "округления" клеток или образования межэндотелиальных промежутков.

Эти результаты свидетельствуют о том, что антитело против альбуминсвязывающего белка с массой 57 кД активирует транспорт альбумина. Существует и другая возможность, т.е. это антитело может неспецифическим образом усиливать перицеллюлярный транспорт альбумина, расширяя промежутки в межэндотелиальных соединениях. Чтобы уточнить это, изучают действие анти-рецепторного IgG и IgG пре-иммунной сыворотки на морфологию клеток эндотелия. Предварительная обработка моно слоев клеток BPMVEC как IgG пре-иммунной сыворотки, так и анти-рецепторным IgG не оказала никакого влияния на промежутки в межэндотелиальных соединениях. Это антитело к альбуминсвязывающему белку с массой 57 кД может активировать трансцитоз альбумина. Эффект повышения проницаемости этого антитела на проявляется при 4^oC, подтверждая мнение о том, что такое антитело активирует трансцитоз альбумина посредством формирования везикул, а этот процесс, как было ранее показано, чувствителен к температуре (Lo et al., J. Cell. Physiol. 151: 63-70 (1992)).

Пример 2
Антитела, индуцированные против GP60
Антитела, индуцированные против GP60 из эндотелиальных клеток, используют для проверки экстрактов эпителиальных мембран, как описано в примере 1. Антитела анти-GP60 распознают белок с массой 60 кД, который находится в эпителиальных экстрактах. Это четко показывает, что в этой системе присутствует иммунологически родственный белок.

Эпителиальные и эндотелиальные клетки выращивают в виде монослоев, как описано в примере 1, чтобы получить сплошные монослои, проявляющие соответствующую способность пропускать вещество сквозь себя. Антитело анти-GP60 (200-500 мкг/мл) инкубируют с монослоями при 4^oC, чтобы связать антитело с рецептором, в отсутствие метаболической активности, которая могла бы привести к интернализации GP60. Связывание антитела анти-GP60 в таких условиях приводит к снижению на 80-90% связывания ¹²⁵I-BSA эндотелиальными монослоями. Эпителиальные монослои дополнительно инкубируют со вторым антителом к первичному кроличьему антителу анти-GP60, чтобы перекрестно сшить рецепторы. И те, и другие монослои промывают и затем инкубируют эпителиальные клетки с ¹²⁵I-BSA, а эндотелиальные монослои с ¹²⁵I-анти-ВSА-иммуноглубулином при 37^oC, чтобы сделать возможными интернализацию комплекса рецептор-антитело и ко-трансцитоз меченого ¹²⁵I маркера. Инкубация с антителом анти-GP60 приводит к повышению поглощения в 1,6-2 раза по сравнению с уровнем для контрольной пре-иммунной сыворотки. Таким образом, связывание GP60-рецептора антителом анти-GP60 приводит к активации механизма трансцитоза, усиливая в связи с этим поглощение макромолекулы вблизи инвагинирующей мембраны.

Пример 3
Использование альбумина с макромолекулами
Эндотелиальные монослои инкубируют при 4^oC в присутствии BSA, чтобы инициировать связывание BSA с GP60, но предупредить интернализацию комплекса лиганд-рецептор. После интенсивного промывания с целью удаления несвязанного BSA клетки инкубируют при 37^oC с меченым ¹²⁵I-анти-ВSА-иммуноглобулином в качестве макромолекулярного маркера. Предварительная обработка BS-альбумином усиливает трансцитоз иммуноглобулинового маркера в 1,5 раза по сравнению с контрольными клетками, пре-инкубированными с немеченым анти-BSA иммуноглобулином. Далее, когда клетки, инкубированные при 37^oC, отмывают и немедленно подвергают операциям по тому же самому протоколу, не наблюдается проникновения макромолекул, что показывает неспособность GP60-рецептора к связыванию лиганда после того, как он один раз был интернализован. Таким образом крупные (150 кД) молекулы могут участвовать при взаимодействии с HSA в совместном трансцитозе, используя GP60-систему.

Пример 4
Использование альбумина с пептидами
Монослои человеческих и крысиных эпителиальных клеток выращивают до достижения слияния, как описано в примере 1. Затем клетки инкубируют при 37^oC либо с FITC-инсулином (1 мг/мл), либо со смесью FITC-инсулина и BSA (каждого по 1 мг/мл) в системе для трансклеточного проникновения, описанной выше. Для монослоев эпителиальных клеток человека и крысы наблюдается усиление проникновения FITC-инсулина в присутствии BSA в 2,5 раза или в 4 раза по сравнению с контролем, т.е. в случае одного FITC-инсулина. Таким образом альбумин также стимулирует котрансцитоз пептидов с небольшой молекулярной массой сквозь эпителиальные клетки, содержащие GP60-рецептор.

Пример 5
Использование N-концевого пептида 1-18 из GP60
Синтетический N-концевой пептид (T3118) от GP60, соответствующий первым 18 остаткам, получают путем твердофазного пептидного синтеза. Последовательность расположения аминокислот (SEQ ID No. 1) показывает существование гомологии с бычьим белком, связывающим бычий мембрано-связанный тироидный гормон (Т3) по меньшей мере на 80% (Yamauchi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 146: 1485 (1997)). Этот пептид имеет 97% гомологии с PDI.

На кроликах нарабатывают антитела против Т3118 и используют их, чтобы провести испытание экстрактов эндотелиальных мембран с целью определения перекрестной реакционной способности с белками, распознаваемыми антителами анти-GP60, как описано ниже. Белки мембран клеток BPMVEC (100 мкг) отделяют с помощью SDS-PAGE и переводят на полоски пленки из нитроцеллюлозы. Неспецифическое связывание блокируют добавлением 5%-ного обезжиренного сухого молока в физрастворе с Трис-буфером. Антисыворотки разбавляют блокирующим раствором, инкубируют в течение 4-5 часов при 4^oC, промывают и обрабатывают анителом "козий анти-кроличий-IgG", конъюгированным с щелочной фосфатазой. Полосы белка идентифицируют с помощью белков-маркеров с известной молекулярной массой. Антитела анти-Т3118 проявляют реакционную способность только в отношении белка GP60, но не реагируют с пептидами SPARC, распознаваемыми антителом анти-GP60.

Затем пептид Т3118 используют в эксперименте по эндотелиальному поглощению, чтобы определить, будет ли он действовать как антагонист распознавания и поглощения альбумина. Эндотелиальные монослои инкубируют при 4^oC в присутствии либо ¹²⁵I-BSA, либо ¹²⁵I-BSA плюс пептид T3118. После инкубации клетки интенсивно промывают, лизируют и определяют поглощение маркера. Удивительно, что вместо того, чтобы действовать антагонистически, в действительности пептид T3118 стимулирует поглощение альбумина, усиливая его в 5 раз по сравнению с контролем, т. е. опытом с одним альбумином. Усиление достигает насыщения при концентрации пептида T3118 в 500 мкМ. Эти данные свидетельствуют о том, что пептид T3118, действуя как агонист, может вызывать изменение конформации молекулы альбумина, которое усиливает распознавание ее GP60-рецептором или является сигналом для поглощения эпителиальными клетками.

Квалифицированный специалист примет во внимание тот факт, что данное изобретение может быть представлено в широких рамках равноценных параметров, таких как составы, концентрации, методы введения и условия, без отступления от сущности или сферы действия изобретения или любого из способов его осуществления.

Список последовательностей
(1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ:
(i) ЗАЯВИТЕЛЬ:
A) НАИМЕНОВАНИЕ: Андарис Лимитед
В) УЛИЦА: 1, Мер-Вэй
C) ГОРОД: Раддингтон
D) ГРАФСТВО: Ноттингэмпшир
E) ГОСУДАРСТВО: Великобритания
F) ПОЧТОВЫЙ ИНДЕКС (ZIP): NGl 5AQ
(ii) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: ТРАНСКЛЕТОЧНЫЕ ПЕРЕНОСЧИКИ И СТИМУЛЯТОРЫ ТРАНСЦИТОЗА ДЛЯ ТРАНСПОРТА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ
(iv) ФОРМА ДЛЯ СЧИТЫВАНИЯ КОМПЬЮТЕРОМ:
A) ТИП НОСИТЕЛЯ: дискета
В) КОМПЬЮТЕР: IBM PC-совместимый
C) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: PC-DOS/MS-DOS
ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ С ИДЕНТИФИКАЦИОННЫМ НОМЕРОМ 1
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
А) ДЛИНА: 18 аминокислот
В) ТИП: аминокислота
C) НИТЧАТОСТЬ:
D) ТОПОЛОГИЯ: линейная
(ii) ТИП МОЛЕКУЛЫ: пептид
Описание последовательности с ид. N 1 приведено ниже.

Изобретение относится к медицине и касается векторов и усилителей трансцитоза для доставки лекарственных веществ. Сущность изобретения заключается в включении в лекарственное средство путем присоединения к нему посредством конъюгации или совместного введения вектора или усилителя трансцитоза, который выбирают из альбумина и его фрагментов, антитела анти - GP 60 и его фрагментов, пептидных фрагментов GP 60, РД 1 (протеин-дисульфидизомераза) и ее фрагментов. Преимущество изобретения заключается в усилении прохождения лекарственных веществ через эндотелий, эпителий и мезотелий. 7 з.п. ф-лы.

1. Композиция или конъюгат, усиливающие трансцитоз, представляющие собой сухой порошок, пригодный для ингаляции, включающие физиологически активный агент, который проявляет свое действие после прохождения сквозь эндотелий, эпителий или мезотелий, содержащие GP60-рецептор, и усилитель или вектор трансцитоза, содержащие в своем составе CGMC-мотив, выбранные из альбумина и его фрагментов, антитела анти-GP60 и его фрагментов, пептидных фрагментов GP60, PD1(протеин-дисульфидизомеразы) и ее фрагментов. 2. Композиция или конъюгат по п.1, отличающиеся тем, что усилитель или вектор трансцитоза включает альбумин или фрагмент альбумина в сочетании с пептидным фрагментом GP60. 3. Композиция или конъюгат по п.1, отличающиеся тем, что усилитель или вектор трансцитоза включает антитело анти-GP60 или фрагмент антитела анти-GP60. 4. Композиция или конъюгат по п.1, отличающиеся тем, что вектор трансцитоза включает альбумин или фрагмент альбумина в сочетании с пептидным фрагментом GP60. 5. Композиция или конъюгат по любому из пп.1 или 2, отличающиеся тем, что пептидный фрагмент GP60 представляет собой или включает в себя SEQ 1D No.1. 6. Композиция или конъюгат по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что физиологически активный агент выбирают из группы, состоящей из лютеинизирующего гормона (LH), хорионического гонадотропина, атриальных пептидов, интерферона, лимфокинов I, лимфокина II, лимфокина III, лимфокина IV, лимфокина V, лимфокина VI, лимфокина VII, колониестимулирующего фактора, релизинг-фактора ростового гормона, релизинг-фактора кортикотропина, релизинг-гормона лютеинизирующего гормона (LHRH), соматостатина, кальцитонина, релизинг-гормона тиротропина, кальцитонин -гензависимого пептида (CGRP), трансфераз, гидролаз, изомераз, протеаз, лигаз, оксидоредуктаз, эстераз, фосфатаз, фактора роста нервов (NGF), цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), нейротрофического фактора церебрального происхождения (BDNF), нейротрофического фактора глиального происхождения (GDNF), эпидермального фактора роста (EGF), фактора роста фибропластов (FGF), инсулиноподобного ростового фактора, фактора некроза опухолей (TNF), трансформирующего ростового фактора (TGF), энкефалинов, эндорфинов, гонадолиберна, меланостатина, меланолиберина, соматостатина, тиролиберина, субстанции P, нейротензина, кортикотропина, липотропина, меланотропина, лютропина, тиротропина, пролактина, самототропина, нейрогипофизарных гормонов, паратирина, кальцитонина, тимозина, тимопоэтина, циркуляторного тимического фактора, тимического гуморального фактора, инсулина, глюкагона, соматостатина, гастрина, холецистокинина, секретина, желудочного ингибиторного полипептида, вазоинтестинального пептида, мотиллина, релаксина, ангиотензина, брадикинина, соматомединов, эпидермальных факторов роста, урогастрона, дефероксамина, бусерелина, дезлорелина, гонадорелина, госерелина, гистрелина, лейпрорелина, нафарелина и трипторелина. 7. Композиция или конъюгат по п.1, отличающиеся тем, что включают наполнитель. 8. Композиция или конъюгат по п.1, отличающиеся тем, что включают микрочастицы активного агента размером 2 - 5 мкм.

Приоритет по пунктам:
21.09.95 по п.1;
26.03.96 по п.1;
21.09.95 по пп.2 - 5;
26.03.96 по пп.6 - 8.