СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ КОРИНЕБАКТЕРИЙ ДИФТЕРИИ Российский патент 1999 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к микробиологии и касается способа внутривидовой идентификации коринебактерий дифтерии. Внутривидовая дифференциация на уровне штамма имеет теоретическое значение при физиолого-биохимическом изучении основ жизнедеятельности микроорганизмов, а также может использоваться в микробиологии, иммунологии, эпидемиологии для совершенствования организации эпиднадзора, стандартизации лечебно-профилактических и диагностических биологических препаратов, стандартизации исследований.

Известно несколько способов внутривидовой дифференциации Corynebacterium diphtheriae, характерных и для других видов разных таксономических групп, это: биотипирование, фаготипирование, серотипирование, колицинотипирование. Эти способы имеют общий недостаток - нестабильность признаков, по которым ведется дифференциация. Кроме того, колицинотипирование редко применяется из-за громоздких схем (Н.А. Кравченко, О.Д. Трофимова. 1980, 1981).

Фаготипирование не нашло широкого применения из-за отсутствия коммерческих препаратов - диагностических фагов и использовалось в основном для исследовательской работы в эпидемиологических целях (С.С. Маркина. Автореферат дис. канд. М., 1971; С.С. Маркина, И.П. Линева, А.В. Солодовникова, Л. Н. Поликарпова. Сб. науч. тр. "Острые детские инфекции". М., 1978. т. XIX, с. 54; Г.Г. Ломоносова, Г.П. Сальникова, И.И. Водорацкая, Т.М. Упорова. Сб. науч. тр. "Острые детские инфекции". М., 1978, т. XIX, с. 57).

Серотипирование дифтерийной палочки в России было предложено в 1961 г. В. С. Сусловой и М.В. Пелевиной (Ж. Микроб., эпид., иммун. М., 1961, N 8, с. 15-19).

В результате перекрестной реакции агглютинации и адсорбции была принята единая рабочая схема серологической классификации дифтерийных микробов. Она имела недостатки из-за отсутствия в наборе эталонных культур штаммов, относящихся к нетоксигенным бактериям типа gravis, циркулирующим в 60-е годы. В связи с этим предлагались дополнительные сыворотки, приготовленные к наиболее распространенным штаммам (Ю.Г. Казьмина с соавт. В кн.: Труды Московского института эпидемиологии и микробиологии, т. XIII. М., 1969, с. 90-96; Н.Н. Костюкова с соавт. Ж. Микроб., 1971, N 6, с. 60-65; М.Д. Крылова с соавт. Ж. Микроб. , 1973, N 11, с. 3-8; В.В. Черкасова с соавт. В. сб.: Острые детские инфекции. М. , 1975, т. XVI, с. 45-48). Позднее появился коммерческий набор сывороток диагностических дифтерийных неадсорбированных сухих для реакции агглютинации (РА), который выпускается Предприятием по производству бактерийных препаратов Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского.

Сущность серотипирования заключается в обнаружении с помощью соответствующего антитела специфических антигенов. Однако поверхностные антигены, определяющие серотип, подвержены изменчивости. Изменение антигенного состава приводит к появлению культур неагглютинирующихся или полиагглютинабельных, так как для них не разработаны типовые сыворотки.

Для серотипирования коринебактерий дифтерии применяются реакция агглютинации на стекле и пробирочная реакция. Реакция на стекле ставится следующим образом. Пастеровской пипеткой на обезжиренное спиртом предметное стекло наносят каплю сыворотки в нужных разведениях, вблизи капли - петлю испытуемой культуры, выращенной на плотных питательных средах (свернутая сыворотка, агар Мартена или мясо-пептонный с сывороткой, агар фосфатный). Обе капли смешивают и тщательно растирают. Для контроля культуры в каплю 3% раствора натрия хлористого вносят одну петлю культуры и тщательно растирают. Учет реакции производят в течение 2-3 мин. Положительный результат - появление хлопьев агглютината при полном просветлении жидкости. Отрицательный результат - гомогенная мутная жидкость (контроль).

Для постановки пробирочной РА готовят нужные разведения сыворотки и переносят каждое в отдельные пробирки по 0,5 мл. Культуру, выращенную на плотных питательных средах, смывают 3% раствором натрия хлористого, эмульгируют быстрым вращением пробирки. Устанавливают густоту взвеси, равную 10 ед. , определяя ее по стандартному образцу для определения мутности бактерийных взвесей, и вносят по 0,5 мл взвеси в пробирки с разведенной сывороткой. Контролями служат две пробирки: в одну вносят 1,0 мл исходного разведения сыворотки (1: 100) - контроль сыворотки, в другую - 0,5 мл 3%-ного раствора натрия хлористого и 0,5 мл микробной взвеси - контроль культуры.

Пробирки встряхивают и помещают в термостат на 18-24 ч. Учет результатов реакции производят невооруженным глазом по характеру выпавшего агглютината и степени просветления надосадочной жидкости по четырехкрестной системе.

Целью предлагаемого изобретения является повышение точности способа внутривидовой идентификации коринебактерий дифтерии.

Поставленная цель достигается сопоставлением качественных характеристик спектров внутриклеточных растворимых белков сравниваемых культур, по "рисункам" которых судят о принадлежности культур к одному или разным штаммам.

Коринебактерии дифтерии, выделенные от больных, носителей или хранящиеся в ампулах в лиофилизированном состоянии (после растворения физиологическим раствором), высевают на мясо-пептонный агар с добавлением 5% гемолизированной донорской крови на чашки Петри.

Культуру смывают через 24 часа физиологическим раствором (pH 7,4) с мертиолятом в концентрации 1:10000. Клетки трижды отмывают физиологическим раствором при 9000 g в течение 30 мин. Затем проводят дважды обработку клеток ацетоном и однократно эфиром.

Клеточную массу высушивают на воздухе интенсивным перемешиванием до образования сыпучего порошка. Высушенные клетки хранят при +4^oC неограниченно долго. Белковые экстракты получают путем вытяжки белков из ацетонового порошка цитратно-фосфатным буфером (pH 7,4) в течение 18-24 ч при температуре +4^oC. Осадок отделяют центрифугированием при 9000 g в течение 30 мин. Количество белка определяют по Лоури или спектрофотометрически.

Электрофорез в полиакриламидном геле проводят общепринятым методом (Davis, Ornstein, 1964), используя в качестве образца 0,03 мл вытяжки внутриклеточных растворимых белков. Полученные электрофореграммы сравнивают.

Было изучено 82 культуры коринебактерий дифтерии. В работу были взяты варианты gravis и mitis токсигенные и нетоксигенные. Это были как музейные культуры, хранящиеся во Всесоюзном музее патогенных культур ГИСК им. Л.А. Тарасевича, так и свежевыделенные штаммы в 1993-94 гг. от больных и носителей. При изучении различных белковых систем (внеклеточные белки, мембранные белки, внутриклеточные растворимые белки) было показано, что только спектры внутриклеточных растворимых белков были индивидуальными для каждого штамма, т.е. "рисунки" спектров отличались друг от друга. Кроме того, были взяты три группы культур при трех различных эпидемических ситуациях в разных детских учреждениях Нижнего Новгорода. Эпидемиологически было показано, что внутри каждой группы культуры связаны между собой и предположительно являются одним штаммом. Спектры внутриклеточных растворимых белков показали идентичные культуры внутри групп. Спектры белков разных групп были различны.

Предлагаемый метод позволяет идентифицировать культуры коринебактерий дифтерии на уровне штамма, исключив трудоемкий этап изготовления высокоспецифических сывороток и подготовку культур, содержащих специфический антиген. С помощью данного метода повышается точность анализа, так как можно получить белковый спектр каждой культуры.

Набор белков, содержащийся внутри клетки коринебактерий, является стойкой характеристикой.

Данное изобретение может быть использовано при диагностике дифтерийной инфекции, при расследовании различных эпидситуаций, при массовом обследовании населения. Способ может использоваться при идентификации коринебактерий дифтерии от больных и носителей спонтанно полиагглютинабельных или инагглютинабельных штаммов, когда применение серологических методов не эффективно.

Изобретение предназначено для внутривидовой идентификации коринебактерий дифтерии. Биомассу исследуемой культуры коринебактерий дифтерии высушивают с помощью ацетона. Извлекают внутриклеточные растворимые белки цитрат-фосфатным буфером (рН 7,4). Обработку проводят в течение 18-20 ч. Отделяют центрифугированием жидкую фракцию. Проводят электрофорез в ПААГ. Типируют культуры по спектрам внутриклеточных растворимых белков. Изобретение позволяет получить белковый спектр каждой культуры, являющийся стойкой штаммовой характеристикой, что приводит к повышению точности внутривидовой идентификации.

Способ внутривидовой идентификации Corynebacterium diphtheriae путем выращивания исследуемой культуры на плотной питательной среде с последующим типированием коринебактерий дифтерии, отличающийся тем, что выросшую культуру высушивают с помощью ацетона, извлекают внутриклеточные растворимые белки цитрат-фосфатным буфером, pH 7,4 в течение 18 - 20 ч, центрифугированием отделяют жидкую фракцию, проводят электрофорез в ПААГ и типируют культуру по спектрам внутриклеточных растворимых белков.