Способ хранения соRуNевастеRIUм DIрнтнеRIае штамм pW-8 торонто Советский патент 1982 года по МПК C12N1/06 

(54) СПОСОБ ХРАНЕНИЯ CORYNE8ACTERIUM DIPHTHERIALE ШТАММ PW-8 ТОРОНТО

I

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в практике бактериологических лабораторий.

Известен способ длительного хранения, без периодических пересевов, штаммов различных видов микроорганизмов, в том числе коринебактерий дафтерий, путем их лиофильного высушивания в со стабилизатором. В качестве стабилизатора в среде для высушивания используют сыворотку крови, снятое молоко, 10%-ный водный раствор сахарозь, 10%-ный раствор сахарозы с 1% желатины ИОднако как в процессе высушивания, так и при хранении, происходит значительное отмирание микробных клеток, с колебаниями в зависимости от среды высушивания и температуры хранения: При лиофилизации в условиях вакуума имеется опасность загрязне-. ния высушиваемых штаммов микроорганизмов в результате попадания в ампулу посго-ронней микрофлоры из воздуха или из систе-. мы аппарата лиофильной сушки, а также onacfiocTb заражения персонала, при работе с лиофилизированными штаммами патогенных

микроорганизмов, больше, чем при работе с жидкими микробными культурами, так как при вскрытии ампул с концентрированным порошкообразным микробным материалом под вакуумом Создается гораздо большая возможность распыления и аэрозольного заражения патогенными микробами.

Известен также способ хранения Согупеbacterium diphtheriae штамм PW-8 Торонто путем посева в зашитную среду с последующим инкубирюванием посева и хранением при 4-10°С {2.

Однако известный способ позволяет сохранить жизнеспособность коринебактерий дифтерии только до 3 мес., для многолетнего хранения штамма необходимы периодические пересевы.

Цель изобретения - удлинение сроков хранения без периодических пересевов.

Эта цель достигается тем, что согласно способу хранения Corynebacterium diphtheriae штамм PW-8 Торонто путем посева в защитную среду с последующим инкубированием посева и хранением при 4-10° С, штамм за390севают в культуру фибробластов человеческого эмбриона и инкубируют в течение четырех дней. Способ осуществляют следующим образом, В качестве среды для хранения коринебактерий дафтерии применяют одагослойную первично-трипсинизированную или перевиваемую клеточную культуру, высокочувствительную к дифтерийному токшну. Однослойную клеточную культуру в пробирках или в пенищшликовых флаконах при посевной дозе от 400 000 до 500 000 клеток на миллиметр среды под резиновыми пробками готовят общепринятым способом или получают готовую из лаборатории культур клеВ качестве среды выращивания для перевиваемых клеток берут среду 199 с 10% сывороткн крупного рогатого скота и антибиотиками (пенициллин 100 ЕД/мл, стрептомиЩ Я 50 ЕД/мл), для первично-трипсинизирован гшх клеток 0,5%-1шга раствор гидролизата пактальбумина на основе солевого раствора Хенкса с 10% сьшоротки крупного рогатого скота и антибиотиками в той же концентрации. Все машшуляции с клеточной культурой и депо1шруемым штаммом коринебактерий дифтерии проводят в асептических условиях. Депонируемьш штамм коринебактерий диф терии в количестве 0,2-0,3 мл бульонной кул туры, например на мартеновском бульоне, вносят в пробирку с клеточной культурой СО сформировавшимся монослоем, предварительно удалив ростовую среду. Затем в пробирку с клеточной культурой ° добавляют поддерживающую среду, отличающуюся от среды для выращивания отсутствием сьшоротки и антибиотиков. Пробирки с инокулироваяной клеточной культурой инкубируют в термостате при 37° С в течение 4 сут для накоплегош микробной массы. Независимо от токсигеннос ти коринебактерий дифтерии в течение этого срока инкубации обильно размножаются. В случае токсигенных штаммов наблюдается цитотоксический эффект. Микробную культуру вместе с клеточным материалом из 5 или 10 пробирок сливают в одну из пробирок и под резиновой пробкой переносят в холодильник на длительное хранение при температуре от 4 до 10° С. Проведен опыт хранения производственного штамма коринебактерий дифтерии PW-8 Торон то, в культуре фибробластов человеческого эмбриога с 0,5%-ным раствором гидролизата лактальбумина на протяжении 9 лет без пересевов, при температуре от 4 до 100° С. Предлагаемый способ позволяет хранить депонируемые коринебактерий дифтерии в кле точном материале фибробластов человеческого эмбриона, без периодических переносов и ттофильного высушивания в течение 9 лет, сохраняя при этом высокую жизнеспособность штамма; что подтверждается обильным ростом коринебактерий дифтерии при посеве на бульо Мартена, Мартен-Хоттингера и сьгоороточный агар, а также сохраняются при этом типичные мор)фопогические признаки коринебактерий дифтерии и биологические свойства в том числе антигенные (по реакции флокуляции), токскч ные (по датотоксичности). Хранение в клеточной культуре позволяет сохранить производственный дифтерийный ппамм PW-8 Торонто, в течение 9 лет в жизнеспособном, биологически активном состоянии. Экономический эффект при этом достигается за счет экономии материальных средств (питательные среды) и трудовых затрат (работа бактериолога), затрачиваемых на периодические пересевы при хранении на искусственных питательных средах. Формула изобретения Способ хранения Gorynebacterium diphtheriae штамм PW-8 Торонто путем посева в защитную среду с последующим инкубиров.нием посева и хранением при 4-10° С, о тличающийся тем, что, с целью удлинения сроков хранения без периодических пересовов, штамм засевают в культуру фибробластов человеческого эмбриона и инкубируют в течение четырех дней. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Суслова fe. С- Влияние условий хранения лиофилизированных культур на их жиз неспособность. Инструктивно- методические материалы по вопросам контроля и стандартизации биологических препаратов. М., 1965., с. 335-339. 2.Инструкция по бактериологическому исследованию на дифтерию. Утверждена приказом МЗ СССР № 580, 26.06.1974.