Способ внутривидовой идентификации менингококков Советский патент 1991 года по МПК C12Q1/04 

(Л

с

Изобретение относится к микробиологии, в частности к выделению, идентификации микроорганизмов Цель изобретения - повышение точности способа внутривидовой идентификации менингококков. Способ включает выращивание культуры на твердой среде, суспендирование клеток в физиологическом растворе, центрифугирование суспензии и фракционирование полученного супернатанта электрофорезом в по- лиакриламидном геле Идентификацию микроорганизмов проводят путем сравнения белковых спектров исследуемой и эталонных культур

Изобретение относится к микробиологии, в частности к выделению, идентификации микроорганизмов позвонит идентифицировать культуры менингококков по соответствующим серогруппам, принятым при серотипировании по капсульному антигену, что имеет теоретическое значение при физиолого-биохимическом и иммунологическом изучении основ жизнедеятельности микроорганизмов, и может использоваться в микробиологии эпидемиологии, при стандартизации лечебно-профилактических, диагностических и биологических препаратов

Наиболее распространенными методами определения различных капсульных полисахаридов или различных серогрупп N. meningitidis являются реакция агглютинации на стекле и по Ноблю Хотя приемы серогруппирования различны все они основаны на обнаружении с помощью соответствующего антитела общего специфического антигена - капсульного полисахарида При постановке всех этих реакций необходимы наборы диагностических сывороток. При постановке серологических реакций большое значение имеет качество используемых им- муных сывороток, т е. их специфичность, уровень активности (по IgM и IgG антителам), диапазон охвата. Недостатками методов серогруппирования являются трудности при производстве биологических препаратов в четкости соблюдений соотношений IgM, IgG антител, снижение специфичности при значительном повышении активности, использование сывороток разных производств, разного времени выпуска, что обусловливает расхождения в результатах группирования быстрая потеря специфического капсульного антигена у произведето ю со о о

венных и контрольных штаммов, необходимость применения для его восстановления длительных трудоемких методик.

Для серогруппирования менингококков наиболее широко применяется реакция агглютинации на стекле, которая ставится следующим образом. Пастеровской пипеткой наносят на обезжиренное спиртом предметное стекло каплю сыворотки в нужных разведениях. В каждую каплю сыворотки вносят петлю 20-часовой агаровой культуры и тщательно перемешивают. Постановка реакции требует одномоментного использования основного набора диагностических сывороток (А, В, С, X, Y, Z, 135w, 29E) и должна сопровождаться дополнительным контролем физиологического состояния культуры менингококка. Учет реакции проводят в течение 1-5 мин.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Менингококки, выделенные от больного носителя или хранящиеся в ампулах в лио- филизированном состоянии (после растворения физиологическим раствором), высевают на питательную среду с добавлением крови или сыворотки. Затем 0,1 мл полученной микробной массы переносят на покрытый целлофановым диском агар Хот- тингера, содержащий 20% лошадиной инак- тивированной сыворотки, разлитой в чашки Петри,

После 5-часового культивирования при 37°С культуру смывают 1 мл физиологического раствора (рН 7,4) с мертиолатом в концентрации 1:10000, центрифугируют при 6000 g 30 мин. Супернатант, содержащий внеклеточные белки, хранят при - 20°С проведения электрофореза.

Диск-электрофорез проводят общепринятым методом, используя в качестве образца 0,1 мл надосадочной жидкости. Полученные электрофореграммы сравнивают.

Было изучено 40 штаммов N. meningitidis восьми серологических групп. Два - три штамма представляли каждую серологическую группу. В работу были взяты культуры, являющиеся международными эталонными, и хранящиеся во Всесоюзном музее патогенных культур ГИСК им. Л.А.

Тарасевича МЗ СССР. Обнаружено, что штаммы одной серогруппы имели одинаковый рисунок расположения белковых фракций на протеинограмме и отличались от

протеинограмм культур других серогрупп, т.е. штаммы каждой из 8 серологических групп имели характерный только для них белковый спектр и отличались друг от друга по электрофореграммам. Этот признак не

зависит от состояния популяции (S, OS-форма), уровня содержания или отсутствия кап- сульного антигена, культивирования на различных питательных средах, времени и способа хранения культур.

Предлагаемый способ позволяет идентифицировать культуры менингококка на внутривидовом уровне по серогруппам исключив трудоемкий этап изготовления высокоспецифических диагностических

сывороток и подготовку с помощью селекции культур менингококков, содержащих капсульный антиген. С помощью данного способа повышается точность анализа, так как можно получить белковый спектр каждои культуры. Набор белков, выделяемый культурой в среду, является стойкой характеристикой.

Изобретение может быть использовано при диагностике менингококковых инфекций, при эпидрасследованиях, при массовом обследовании населения. Способ может использоваться даже при выделении от больных и носителей спонтанно полиаг- глютинабельных и инагглютинабельных

штаммов в случаях, когда применение серологических методов неэффективно.

Формула изобретения Способ внутривидовой идентификации

менингококков путем выращивания исследуемой культуры на плотной питательной среде, отличающийся тем, что, с целью повышения точности, культуру, выращенную на плотной среде, суспендируют в физиологическом растворе, центрифугируют, фракционируют полученный супернатант электрофорезом в полиакриламидном геле, получают спектры внеклеточных белков, а идентификацию проводят путем сравнения

белковых спектров исследуемой и эталонных культур.